黄鹌菜的化学成分及其抗肿瘤活性研究

Chemical composition of Youngia japonica and its antitumor activity

摘要

通过硅胶、ODS、Sephadex LH⁃20等多种柱色谱技术以及制备HPLC等对黄鹌菜（Youngia japonica）甲醇提取物进行分离，根据核磁波谱技术对分离的化合物进行结构鉴定。利用MTT法筛选影响三阴性乳腺癌（MDA⁃MB⁃231）细胞生长的化合物，进一步利用克隆形成实验，Hoechst33342/PI双染色法，Annexin V⁃FITC/PI双染以及Western blot检测候选化合物对乳腺癌和结直肠癌的抑制效果及可能的作用机制。从黄鹌菜中分离到5个单体化合物，经核磁共振谱鉴定为grosheimin （1），4⁃（3'⁃hydroxypropyl）⁃2，6⁃dimethoxyphnol⁃3'⁃O⁃β⁃D⁃glcoside （2），木犀草素⁃7⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖苷（3），木犀草素⁃7⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖醛酸苷（4），芹菜素（5）。通过活性筛选发现grosheimin能显著降低三阴性乳腺癌细胞MDA⁃MB⁃231的活力。明视野下观察到在不同浓度grosheimin处理下，MDA⁃MB⁃231和结直肠癌（HCT⁃116）细胞形态发生明显改变；grosheimin作用24 h后，MDA⁃MB⁃231和HCT⁃116的IC₅₀分别为16.86 μmol/L、30.94 μmol/L。克隆形成实验结果显示，在30 μmol/L grosheimin的作用下，MDA⁃MB⁃231和HCT⁃116细胞集落形成能力分别为9%、39.7%；Hoechst33342/PI双染法显示，grosheimin可诱导上述两种细胞的凋亡，且存在浓度依赖性。20 μmol/L grosheimin作用24 h后，流式细胞仪检测发现MDA⁃MB⁃231和HCT⁃116的凋亡率分别为45%和37.78%；Western blot检测结果显示随着grosheimin处理浓度的增加，凋亡相关蛋白cleaved PARP水平逐渐增加。以上结果表明，grosheimin可能通过诱导细胞凋亡进而抑制MDA⁃MB⁃231和HCT⁃116的生长。

Abstract

The methanol extract of Youngia japonica was separated by column chromatography techniques （silica gel， ODS， Sephadex LH⁃20） and preparative HPLC. The structures of the separated compounds were identified using nuclear magnetic spectroscopy. The effect of the compounds on the proliferation of triple⁃negative breast cancer （MDA⁃MB⁃231）cells was screened by MTT. Furthermore， cloning experiment， Hoechst33342/PI double staining， Annexin V⁃FITC/PI double staining and Western blot were used to detect the anti⁃tumor cell effect of the selected compound. A total of five monomeric compounds were isolated from methanol extract of Youngia japonica， the compounds were identified with NMR spectroscopy as grosheimin （1）， 4⁃（3'⁃hydroxypropyl）⁃2，6⁃dimethoxyphnol⁃3'⁃O⁃β⁃D⁃glcoside （2）， luteolin⁃7⁃O⁃β⁃D⁃glucoside （3）， luteolin⁃7⁃O⁃β⁃D⁃glucuronide （4） and apigenin （5）. The anti⁃tumor screening assay results showed that the viability of MDA⁃MB⁃231 cells was significantly reduced by the compound grosheimin. The morphology of MDA⁃MB⁃231 and colorectal cancer HCT⁃116 cells was significantly damaged under different concentrations of grosheimin treatment. The IC₅₀ of MDA⁃MB⁃231 and HCT⁃116 treated by grosheimin were 16.86 and 30.94 μmol/L using MTT method. The clone formations of MDA⁃MB⁃231 and HCT⁃116 cells were suppressed to 9% and 39.7% respectively after 30 μmol/L grosheimin treatment. Hoechst33342/PI staining results showed that grosheimin could induce the apoptosis of two kinds of cancer cells in a concentration dependent manner， and the apoptosis rates of MDA⁃MB⁃231 and HCT⁃116 were 45% and 37.78% respectively by flow cytometry under 20 μmol/L grosheimin treatment of 24 h. Furthermore， the Western blot detection results showed that the level of cleaved PARP was increased also in a grosheimin concentration dependent manner. These results demonstrate that grosheimin may inhibit the growth of triple⁃negative breast cancer and colorectal cancer cells via inducing apoptosis.

Graphical abstract

关键词

黄鹌菜 / 化学成分 / grosheimin / 抗肿瘤作用 / 细胞凋亡

Key words

Youngia japonica / chemical composition / grosheimin / anti⁃tumor / apoptosis

0 引 言

国家癌症中心发布的数据显示，2020年全球乳腺癌新发病例高达226万例，成为全球第一大癌^［1］，同时也是全球因癌症死亡的第五大原因。作为一种侵袭性恶性肿瘤，确切的致癌原因尚不明确^［2］。其中三阴性乳腺癌（TNBC）占15%~20%，预后效果较其他类型乳腺癌差，并且极易复发，无进展生存期以及总生存期短^［3］。其雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体⁃2（HER2）表达缺乏，导致内分泌治疗、HER2两种靶向治疗均对TNBC无效，为临床治疗带来了巨大的挑战^［4］。目前常用的治疗方法仍是化疗，并且可选择的治疗策略较少，因此迫切需要研发针对TNBC患者的新型治疗药物^［5］。而结直肠癌新发病例达56万，高居我国癌症发病率第二位，是全球最为常见的消化道恶性肿瘤之一^［6］。但因为早期表现并不突出，约50%的患者就诊时就已经进展为晚期甚至发生转移^［7］，仍需接受化疗。但是经过多线化疗，结直肠癌的耐药性十分突出，迫切需要寻找新的有效的药物或方案^［8］。

黄鹌菜（Youngia japonica），又名毛连连、黄花菜等，系菊科（Asteraceae）黄鹌菜属（Youngia）植物，主要分布于湖北、浙江、江苏、安徽、江西、云南、四川等地。黄鹌菜作为一种民间中草药，具有清热解毒，利尿消肿的功效，主要用于治疗感冒、喉咙痛和腹泻，也可用作利尿剂。黄鹌菜中富含倍半萜类成分，外用可缓解疖子、乳腺炎等。现代药理学研究表明黄鹌菜具有多种活性，包括抗炎、抗病毒、抗肿瘤和抗菌等^［9~13］。尽管目前有文献报道了黄鹌菜的抗肿瘤活性，如其水提取物可以抑制人类早幼粒细胞白血病（HL⁃60）、小鼠肉瘤180（S⁃180）以及人类髓系白血病（K⁃562）细胞增殖^［14］。但是尚未发现黄鹌菜及其化合物在乳腺癌及结直肠癌方面的报道。作为一种潜在的抗肿瘤药用植物，其真正发挥作用的活性成分有待进一步挖掘。

本文利用各种色谱技术从黄鹌菜甲醇提取物分离得到5个单体化合物。抗肿瘤细胞筛选实验发现化合物grosheimin具有抑制肿瘤细胞生长的作用。进一步通过多种实验方法发现grosheimin具有较好的抗三阴性乳腺癌和结直肠癌作用，为黄鹌菜及grosheimin的开发和应用提供实验依据。

1 材料

1.1 细胞

人三阴性乳腺癌细胞（MDA⁃MB⁃231）和人结直肠癌细胞（HCT⁃116）均由江汉大学医学部武汉生物医学研究院传代保种。

1.2 主要试剂和耗材

MTT（BioFroxx，德国）；胰酶、胎牛血清、RPMI 1640培养液（Gibco，美国）；BCA蛋白浓度检测试剂盒（碧云天生物技术，上海）；Annexin V⁃FITC/PI凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术，上海）；PAPR抗体（CST，Cat#9532S）；actin抗体（Proteintech，Cat#66009⁃1⁃Ig）；HRP标记的羊抗鼠抗体（Proteintech，Cat#SA00001⁃1）；HRP标记的羊抗兔抗体（Proteintech，Cat#SA00001⁃2）；二甲基亚砜（DMSO）（上海，67⁃68⁃5）；5⁃氟尿嘧啶（5⁃FU）（MCE，51⁃21⁃8）；Staurosporine （STS）（MCE，62996⁃74⁃1）。RIPA裂解液（中）（碧云天，P0013C）；实验所用化学试剂均为分析纯或色谱纯；ODS填料（30~50 μmol/L）；Sephadex LH⁃20型凝胶；YMC ODS C18色谱柱（10 mm×250 mm， 5 μmol/L）；实验所用药材为2021年12月购自浙江丽水，经江汉大学生命科学学院董元火教授鉴定为菊科黄鹌菜属植物黄鹌菜，样本存放于江汉大学武汉生物医学研究院（NO.20211227）。

1.3 仪器

Bruker AV 600型核磁共振仪（Bruker，美国）；睿合科技半制备液相（睿合科技，中国）；离心机、CO₂培养箱、酶标仪（Thermo，美国）；c6 plus流式分析仪（BD，美国）；荧光显微镜（OLYMPUS，日本）；手持式超声波粉碎机UP⁃250（新芝，中国）；电泳槽，转膜仪、化学凝胶成像系统（Bio⁃Rad，美国）；TU⁃100C恒温金属浴（一恒，上海）。

2 实验方法

2.1 黄鹌菜的提取和分离

干燥的黄鹌菜10 kg，甲醇室温浸提2次（150 L），每次48 h，合并提取液，减压浓缩得到浸膏1.0 kg。黄鹌菜浸膏经硅胶柱色谱分离，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇洗脱得4个流分（Fr. A~Fr. D）。Fr. C经ODS柱色谱分离，甲醇⁃水（20%~100%）梯度洗脱，得5个流分（Fr. C1~Fr. C5）；Fr. C4经Sephadex LH⁃20（甲醇）柱色谱分离，得流分Fr. C1-1~Fr. C1-3；Fr. C1-2经液相制备分离（色谱柱：YMC ODS C18；流动相：38%甲醇；流速：4.0 mL/min）得到化合物1（30 mg）；Fr. D经ODS柱色谱分离，甲醇⁃水（30%~100%）梯度洗脱，得4个流分（Fr. D1~Fr. D4）；Fr. D2经Sephadex LH⁃20（甲醇）柱色谱分离，得流分Fr. D2-1~Fr. D2-3；Fr. D2-2经制备液相分离（色谱柱：YMC ODS C18；流动相：15%乙腈；流速：3.0 mL/min）得到化合物2（20 mg）；Fr. D3经Sephadex LH-20（甲醇）柱色谱分离，得流分Fr. D3-1~Fr. D3-4；Fr. D3-2经制备液相分离（色谱柱：YMC ODS C18；流动相：20%乙腈；流速：3.0 mL/min）得到化合物3（15 mg）和4（20 mg）；Fr. D3-3经制备液相分离（色谱柱：YMC ODS C18；流动相：40%乙腈；流速：3.0 mL/min）得到化合物5（25 mg）。

2.2 细胞培养

MDA⁃MB⁃231和HCT⁃116细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI⁃1640培养基，放置于5%CO₂的37 ℃培养箱中培养。待细胞生长到80%~90%融合度时，用胰酶消化后传代或分板培养。

2.3 Western blot检测

将对数生长期细胞以1.5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板过夜培养，加入不同浓度的grosheimin继续培养24 h。每孔加入200 μL含有蛋白酶的RIPA裂解液于冰上静置20 min。收集皿里的细胞裂解液于1.5 mL的试管中，37.5 W功率超声10 s。离心后用BCA试剂盒对上清中的蛋白进行浓度测定，取30 μg蛋白加入5×SDS上样缓冲液，100 ℃处理10 mim。用8%SDS⁃PAGE凝胶对蛋白进行电泳分离，然后应用转膜仪将蛋白转移到PVDF膜上。将含有蛋白的PVDF膜置于含有5%脱脂牛奶的1×TBST溶液内，室温封闭1 h后，分别与抗actin或者PARP抗体4 °C孵育过夜。1×TBST洗三次后，分别用HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠抗体室温孵育1 h，用化学凝胶成像系统对要检测的蛋白进行蛋白条带可视化并记录。

2.4 Hoechst33342/PI双染

将5×10⁴个细胞涂布于12孔板内培养过夜，加入1 mL含有20 μmol/L grosheimin的培养基于培养箱培养24 h。小心弃去上清，加入250 μL含PI和Hoechst33342的Hank’s平衡盐（HBSS）溶液，37 ℃培养箱内孵育30 min，倒置荧光显微镜下拍照。荧光图中所示标尺为200 μm，明视野图中所示标尺为100 μm。

2.5 细胞活力测定

将对数生长期的细胞以每孔8 000个的密度接种于96孔板中培养过夜。将100 μL分别含有50 μmol/L单体化合物的培养基或含有不同浓度（0、10、20、30 μmol/L）grosheimin的培养基分别加入对应的孔内，每组设置5个孔，培养24、48和72 h。加入MTT试剂，终浓度为0.5 mg/mL，置于培养箱中孵育4 h，弃去上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），混匀后酶标仪测量OD₅₇₀值。

2.6 克隆形成实验

将1.5×10⁵个细胞涂布于6孔板培养过夜。用含有不同浓度grosheimin（0、10、20 μmol/L）培养基培养24 h。用胰酶消化后，每组取1 000个细胞布于新的6孔板内，每隔3 d换一次不含药物培养基，连续培养10~14 d至形成细胞集落。弃去上清后，4%多聚甲醛固定细胞集落，结晶紫染液染色10~30 min。克隆形成率的计算公式为：克隆形成率（%）=克隆数/接种细胞数×100%。

2.7 细胞凋亡

将1.5×10⁵个细胞涂布于6孔板过夜培养。用含有不同浓度grosheimin（0、20 μmol/L）的培养基培养48 h。收集上清，胰酶消化细胞后，用收集的上清终止消化，1 000 g离心3 min，PBS重悬离心后弃去上清。用200 μL含Annexin V⁃FITC和PI的结合缓冲液重悬，室温30 min后，使用流式细胞仪分析细胞。仅Annexin V⁃FITC染色的细胞为早期凋亡；Annexin V⁃FITC/PI双染的细胞为晚期凋亡，两者合并计算凋亡率，公式为：凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

2.8 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0分析数据，所有实验至少重复3次，实验数据以均数±标准差表示。统计学比较采用t检验、单因素方差分析（One⁃Way ANOVA）。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 化合物结构鉴定

利用多种色谱技术对黄鹌菜甲醇提取物的化学成分进行研究，从中分离得到5个单体化合物，通过核磁共振氢谱、碳谱以及与参考文献中的核磁数据进行比对，确定了化合物的结构（图1）。

化合物1：白色粉末。¹H⁃NMR （CD₃OD， 600 MHz）， δ_H： 6.31 （1H， dd， J = 3.6， 1.8 Hz， H-13b）， 6.25 （1H， dd， J = 3.6， 1.8 Hz， H-13a）， 5.07 （1H， s， H-14b）， 4.79 （1H， s， H-14a）， 4.10 （1H， t， J = 9.0 Hz， H-6）， 3.81 （1H， m， H-8）， 3.26 （1H， m， H-1）， 3.15 （1H， m， H-7）， 2.60 （1H， m， H-2b）， 2.57 （1H， d， J = 9.0 Hz， H-4）， 2.49 （1H， m， H-2a）， 2.40 （1H， m， H-5）， 2.35 （1H， m， H-9b）， 2.29 （1H， m， H-9a）， 1.23 （3H， d ， J = 7.2 Hz， H-15）； ¹³C-NMR （CD₃OD， 150 MHz）， δ_C： 172.1 （C-12）， 145.9 （C-10）， 139.1 （C-11）， 125.1 （C-13）， 115.2 （C-14）， 84.6 （C-6）， 74.0 （C-8）， 52.2 （C-5）， 50.3 （C-7）， 49.0 （C-9）， 48.1 （C-4）， 44.1 （C-2）， 41.3 （C-1）， 15.1 （C-15）。以上数据与文献^［15］报道的grosheimin基本一致。

化合物2：白色粉末。¹H⁃NMR （CD₃OD， 600 MHz）， δ_H： 6.55 （2H， s， H-2， 6），4.79 （1H， d， J = 9.0 Hz， H-1'）， 3.83 （6H， s， -OCH₃×2）， 3.77 （1H， m， H-6′b）， 3.65 （1H， m， H-6′a）， 3.19-3.56 （m， H-2′-H-5′）， 2.63 （2H， t， J = 9.0 Hz， H-7 ）， 1.81 （2H， m， H-8）； ¹³C-NMR （CD₃OD， 150 MHz）， δ_C： 154.1 （C-3， 5）， 140.4 （C-1）， 134.4 （C-4）， 107.4 （C-2， 6）， 105.6 （C-1'）， 78.3 （C-3'）， 77.8 （C-5'）， 75.7 （C-2'）， 71.3 （C-4'）， 62.6 （C-6'）， 62.1 （C-9）， 57.0 （3， 5-OCH₃ ）， 35.5 （C-7）， 33. 4 （C-8）。以上数据与文献^［16］报道的4⁃（3'⁃hydroxypropyl）⁃2，6⁃dimethoxyphnol⁃3'⁃O⁃β⁃D⁃glycoside基本一致。

化合物3：淡黄色粉末。¹H⁃NMR （DMSO-d₆， 600 MHz）， δ_H： 12.99 （1H， s， 5-OH）， 7.45 （1H， dd， J = 8.4， 2.4 Hz， H-6′）， 7.42 （1H， d， J =2.4 Hz， H-2′）， 6.90 （1H， d， J = 8.4 Hz， H-5′）， 6.79 （1H， d， J = 1.8 Hz， H-8）， 6.70 （1H， s， H-3）， 6.44 （1H， d， J = 1.8 Hz， H-6）， 5.08 （1H， d， J = 7.8 Hz， H-1″）， 3.71 （1H， d， J = 12.0 Hz， H-6′′b）， 3.50 （1H， m， H-6′′a）， 3.18-3.46 （m， H-2′′-H-5′′） ； ¹³C⁃NMR （DMSO-d₆， 150 MHz）， δ_C： 181.9 （C-4）， 164.5 （C-2）， 163.0 （C-7）， 161.2 （C-5）， 157.0 （C-9）， 150.0 （C-4′）， 145.8 （C-3′）， 121.4 （C-1′）， 119.2 （C-6′）， 116.0 （C-5′）， 113.6 （C-2′）， 105.3 （C-10）， 103.2 （C-3）， 99.9 （C-1″）， 99.5 （C-6）， 94.7 （C-8）， 77.2 （C-5″）， 76.4 （C-3″）， 73.1 （C-2″）， 69.5 （C-4″）， 60.6 （C-6″）。以上数据与文献^［17］报道的luteolin 7⁃O⁃β⁃D⁃glucopyranoside基本一致。

化合物4：淡黄色粉末。¹H⁃NMR （DMSO-d₆， 600 MHz）， δ_H： 13.00 （1H， s， 5-OH）， 7.44 （1H， dd， J = 8.4， 1.8 Hz， H-6′）， 7.42 （1H， d， J = 1.8 Hz， H-2′）， 6.90 （1H， d， J = 8.4 Hz， H-5′）， 6.81 （1H， d， J = 1.8 Hz， H-8）， 6.75 （1H， s， H-3）， 6.45 （1H， d， J = 1.8 Hz， H-6）， 5.26 （1H， d， J = 7.2 Hz， H-1′′）， 4.00 （1H， d， J = 9.6 Hz， H-5′′）， 3.29-3.40 （3H， m， H-2″， 3″， 4″）； ¹³C-NMR （DMSO-d₆， 150 MHz）， δ_C： 181.9 （C-4）， 170.4 （C-6′′）， 164.5 （C-2）， 162.6 （C-7）， 161.2 （C-5）， 157.0 （C-9）， 150.0 （C-4′）， 145.8 （C-3′）， 121.4 （C-6′）， 119.2 （C-1′）， 116.0 （C-5′）， 113.6 （C-2′）， 105.4 （C-10）， 103.2 （C-3）， 99.4 （C-6）， 99.2 （C-1″）， 94.5 （C-8）， 75.7 （C-5″）， 75.2 （C-3″）， 72.8 （C-2″）， 71.3 （C-4″）。以上数据与文献^［18］报道的luteolin 7⁃O⁃β⁃D⁃glucuronide基本一致。

化合物5：淡黄色粉末。¹H⁃NMR （DMSO-d₆， 600 MHz）， δ_H： 12.96 （1H， s， 5-OH）， 7.92 （2H， d， J = 9.0 Hz， H-2′， 6′）， 6.92 （2H， d， J = 9.0 Hz， H-3′， 5′）， 6.78 （1H， s， H-3）， 6.48 （H， d， J = 2.4 Hz， H-8）， 6.19 （1H， d， J = 2.4 Hz， H-6）； ¹³C-NMR （DMSO-d₆， 150 MHz）， δ_C： 181.8 （C-4）， 164.2 （C-2）， 163.7 （C-7）， 161.5 （C-4′）， 161.2 （C-5）， 157.3 （C-9）， 128.5 （C-2′， 6′）， 121.2 （C-1′）， 116.0 （C-3′， 5′）， 103.7 （C-10）， 102.8 （C-3）， 98.9 （C-6）， 94.0 （C-8）。以上数据与文献^［19］报道的apigenin基本一致。

3.2 Grosheimin抑制三阴性乳腺癌（MDA⁃MB⁃231）细胞生长情况

为了分析上述分离的化合物是否具有抗肿瘤活性，分别用5个单体化合物处理MDA⁃MB⁃231细胞 24 h后，应用MTT法进行细胞毒性检测。临床抗肿瘤药物5⁃氟尿嘧啶（5⁃FU）作为阳性对照。检测结果显示，MDA⁃MB⁃231细胞活力分别为化合物1（grosheimin）：22.12%，化合物2（4⁃（3'⁃hydroxypropyl）⁃2，6⁃dimethoxyphnol⁃3'⁃O⁃β⁃D⁃glycoside）：101.09%，化合物3（luteolin 7⁃O⁃β⁃D⁃glucopyranoside）：64.97%，化合物4（luteolin 7⁃O⁃β⁃D⁃glucuronide）：96.22%，化合物5（apigenin）：78.38%，5⁃FU：70.99%，其中化合物1（grosheimin）明显抑制细胞生长，其抑制率为77.88%，是5⁃FU的3倍，而其他化合物无明显效果（图2）。该结果提示，化合物grosheimin可能具有抑制肿瘤细胞生长的作用。

3.3 Grosheimin对乳腺癌细胞和结直肠癌细胞形态的影响

进一步在白光视野下观察grosheimin对MDA⁃MB⁃231和HCT⁃116细胞形态的影响。正常培养条件下，MDA⁃MB⁃231细胞为梭状单层贴壁生长，结直肠癌HCT⁃116细胞为梭状明显聚团生长^［20］。随着grosheimin作用浓度和作用时间的增加，具有正常形态的MDA⁃MB⁃231和HCT⁃116细胞逐渐减少，细胞发生形变且明显皱缩，同时也看到两种细胞的生长明显受到抑制（图3）。以上结果初步证实，grosheimin可抑制MDA⁃MB⁃231和HCT⁃116细胞生长。

3.4 Grosheimin对MDA⁃MB⁃231和HCT⁃116细胞的增殖影响

利用MTT实验进一步明确，grosheimin对肿瘤细胞增殖的抑制效果。不同浓度的grosheimin处理MDA⁃MB⁃321和HCT⁃116细胞，24 h、48 h和72 h后进行MTT检测。结果显示，与未处理组相比，MDA⁃MB⁃231和HCT⁃116的存活率分别由100%降到34.5%和51.46%。最小二乘法计算得出MDA⁃MB⁃231细胞处理24 h后grosheimin的IC₅₀为16.86 μmol/L（图4a），而HCT⁃116细胞的IC₅₀为30.94 μmol/L（图4b）。以上结果提示，随着化合物浓度的增加，活细胞明显减少。同样随着作用时长的延长，同一浓度下活细胞也明显减少，表明grosheimin可持续抑制细胞的增殖。这些结果提示grosheimin可抑制MDA⁃MB⁃231和HCT⁃116细胞的增殖，而MDA⁃MB⁃231细胞更为敏感。

3.5 Grosheimin抑制MDA⁃MB⁃231和HCT⁃116细胞集落的形成

克隆形成实验是测定细胞增殖能力的经典方法之一，进一步应用克隆形成实验验证上述结果。与未处理组相比，随着药物浓度的增加，细胞集落的形成逐渐减少。Grosheimin 20 μmol/L时初步显现出抑制效果；30 μmol/L时MDA⁃MB⁃231、HCT⁃116细胞集落形成能力分别为9%和39.7%（图5）。结合图4，以上结果提示grosheimin可显著抑制肿瘤细胞MDA⁃MB⁃231和HCT⁃116的增殖。

3.6 Grosheimin诱导MDA⁃MB⁃231和HCT⁃116细胞凋亡

细胞凋亡是抑制细胞增殖的主要原因之一，因此我们应用Hoechst33342/PI双染法检测grosheimin是否引起肿瘤细胞凋亡，staurosporine（STS）为阳性对照。坏死细胞由于失去膜的完整性，PI可进入细胞内与DNA结合，呈现出红色。根据此特点，使用PI染色可鉴别死细胞。分别使用10 μmol/L和20 μmol/L grosheimin处理两种肿瘤细胞24 h。应用Hoechst33342和PI进行染色，荧光检测结果显示随着化合物浓度的增加，染成红色的细胞明显增多，表明grosheimin可明显诱导MDA⁃MB⁃231（图6A）和HCT⁃116（图6B）细胞凋亡。

进一步应用Annexin⁃V⁃FITC/PI双染法通过流式细胞仪检测细胞凋亡率，20 μmol/L grosheimin分别处理MDA⁃MB⁃231和HCT⁃116细胞24 h后进行流式分析。结果显示，MDA⁃MB⁃231细胞的凋亡率是未处理组的7倍，增加至45%（图7a），而HCT⁃116是未处理组的5.6倍（图7b），增加至37.78%。

最后应用Western blot检测凋亡相关蛋白（poly ADP⁃ribose polymerase， PARP），它是一种DNA修复酶，作为多种Caspase的切割底物^［21］，剪切的PARP可作为细胞凋亡的指标^［22］。结果表明，grosheimin 处理后cleaved PARP蛋白水平呈现浓度依赖性增加（图8）。以上结果证明grosheimin可以引起肿瘤细胞的凋亡。

4 讨 论

本研究通过硅胶、ODS、Sephadex LH⁃20等多种柱色谱及其制备HPLC等技术对黄鹌菜甲醇提取物进行分离，得到5个单体化合物。进一步利用MTT筛选对三阴性乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞具有抑制作用的化合物。结果表明，化合物grosheimin能明显抑制MDA⁃MB⁃231细胞增殖，抑制率为77.88%，明显高于阳性对照。其余四个化合物抑制效果较弱，抑制率分别为-1.09%，35.03%，3.78%和21.62%。结果显示，grosheimin可能存在抗肿瘤细胞增殖作用。为了验证筛选结果，我们使用grosheimin进行了一系列实验，同时引入结直肠癌细胞HCT⁃116以探索grosheimin是否为潜在的广谱的抗肿瘤药物。MTT，克隆形成以及明视野下的细胞形态检测结果表明，grosheimin可同时抑制MDA⁃MB⁃231和HCT⁃116细胞增殖，并且MDA⁃MB⁃231对grosheimin更为敏感。明视野下的细胞形态提示grosheimin可能是通过促进细胞凋亡来抑制肿瘤细胞增殖的。因此，通过Hoechst33342/PI双染，Annexin V⁃FITC/PI双染以及凋亡相关蛋白水平检测细胞凋亡。结果表明grosheimin具有促进肿瘤细胞凋亡的能力。

据此前研究报道，grosheimin具有抗过敏和抗氧化活性^［23］、抑制T细胞受体活化^［24］、抑制Jurkat T细胞中细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）磷酸化^［25］等活性，未见其他活性研究报道。本研究结果提示，grosheimin具有明显诱导细胞凋亡的作用。而细胞凋亡是多基因调控的复杂生理过程，结合已有报道，推测可能与grosheimin抗氧化活性及抑制ERK磷酸化相关，其具体机制仍需进一步研究。

综上所述，本研究首次发现从黄鹌菜甲醇提取物中分离的化合物grosheimin能在体外通过诱导细胞凋亡而发挥抗三阴性乳腺癌和结直肠癌的作用，为黄鹌菜及grosheimin的开发和应用提供实验依据。

参考文献

[1] Sung H, Ferlay J, Siegel R L, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries [J]. CA Cancer J Clin, 2021, 71(3): 209⁃249.

[2] 黄育北.中国女性乳腺癌筛查指南[J]. 中国肿瘤临床, 2019(9): 429⁃431.

[3] Huang Y B. Breast cancer screening guidelines for Chinese women [J]. Chinese Journal of Clinical Oncology, 2019(9): 429⁃431.

[4] Mustacchi G, De Laurentiis M. The role of taxanes in triple⁃negative breast cancer: literature review [J]. Drug Des Devel Ther, 2015, 9: 4303⁃4318.

[5] Wang Y H, Chen Y H, Shen W H. Amikacin suppresses human breast cancer cell MDA⁃MB⁃231 migration and invasion [J]. Toxics, 2020, 8(4): 108.

[6] LaPorta E, Welsh J. Modeling vitamin D actions in triple negative/basal⁃like breast cancer [J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2014, 144: 65⁃73.

[7] 洪志军, 赵晓宇, 王承芳. 结直肠癌筛查研究现状[J]. 大连医科大学学报, 2022, 44(6): 534⁃538.

[8] Hong Z J, Zhao X Y, Wang C F. Current status of colorectal cancer screening [J]. J Dalian Med Univ, 2022, 44(6): 534⁃538.

[9] Xiang L, He B, Liu Q, et al. Antitumor effects of curcumin on the proliferation, migration and apoptosis of human colorectal carcinoma HCT‑116 cells [J]. Oncol Rep, 2020, 44(5): 1997⁃2008.

[10] 刘静, 刘云鹏. 转移性结直肠癌三线化疗研究现状[J]. 肿瘤综合治疗电子杂志, 2018, 4(3): 1⁃5, 12.

[11] Liu J, Liu Y P. Current status of third⁃line chemotherapy for metastatic colorectal cancer [J]. J Multidiscip Cancer Manag Electron Version, 2018, 4(3): 1⁃5, 12.

[12] Ooi L S M, Wang H, Luk C W, et al. Anticancer and antiviral activities of Youngia japonica (L.) DC (Asteraceae, Compositae) [J]. J Ethnopharmacol, 2004, 94(1): 117⁃122.

[13] 曾健滢, 何耀松, 何春兰, 等. 金银花等8种中草药的体外抑菌试验[J]. 兽药与饲料添加剂, 2008, 13(1): 9⁃10.

[14] Zeng J Y, He Y S, He C L, et al. Experimental research on anti⁃bacterial effect of 8 kinds of Chinese herbal medicine in vitro [J]. Vet Pharm Feed Addit, 2008, 13(1): 9⁃10.

[15] 谢春香, 张忠镇, 彭向永, 等. 30种植物提取物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌抑制作用研究[J]. 井冈山大学学报(自然科学版), 2011, 32(5): 55⁃59, 65.

[16] Xie C X, Zhang Z Z, Peng X Y, et al. Study on the antibacterial effect of the extracts from 30 species of plants in Escherichia coli and Bacillus subtilis [J]. J Jinggangshan Univ Nat Sci Ed, 2011, 32(5): 55⁃59, 65.

[17] 管棣, 谢青兰, 杨喆, 等. 黄鹌菜的抗氧化作用研究[J]. 中药材, 2007, 30(8): 1002⁃1005.

[18] Guan D, Xie Q L, Yang Z, et al. Study on antioxidant effect of yellow quail [J]. J Chin Med Mater, 2007, 30(8): 1002⁃1005.

[19] Munira M, Kabir, Bulbul I, et al. Pharmacological activities of Youngia japonica extracts [J]. Annu Res \& Rev Biol, 2018, 25: 1⁃14.

[20] 凌彤, 杨红超, 张欢, 等. 黄鹌菜药学研究概况[J]. 安徽农业科学, 2013, 41(12): 5261⁃5262, 5264.

[21] Ling T, Yang H C, Zhang H, et al. Progress of pharmacological studies on Youngia japonica (L.) DC [J]. J Anhui Agric Sci, 2013, 41(12): 5261⁃5262, 5264.

[22] Adekenova A S, Sakenova P Y, Ivasenko S A, et al. Gram⁃scale purification of two sesquiterpene lactones from Chartolepis intermedia Boiss. [J]. Chromatographia, 2016, 79(1): 37⁃43.

[23] 黄圣卓, 蒋思萍, 朱华结. 藏药臭蚤草的一个新的苯丙素苷类成分(英文)[J]. 天然产物研究与开发, 2009, 21(4): 549⁃552.

[24] Huang S Z, Jiang S P, Zhu H. A new phenylpropanoid glycoside from Tibetan folk drug Pulicaria insignis [J]. Nat Prod Res Dev, 2009, 21(4): 549⁃552.

[25] Aditi W, Hui S S, Ji J E, et al. Discovery of a highly potent tyrosinase inhibitor, luteolin 5⁃O⁃β⁃d⁃glucopyranoside, isolated from Cirsium japonicum var. maackii (Maxim.) Matsum., Korean thistle: kinetics and computational molecular docking simulation [J]. ACS Omega, 2018, 3(12): 17236⁃17245.

[26] Ma Q, Jiang J G, Zhang X M, et al. Identification of luteolin 7⁃O⁃β⁃D⁃glucuronide from Cirsium japonicum and its anti⁃inflammatory mechanism [J]. J Funct Foods, 2018, 46: 521⁃528.

[27] 张秀艳, 王晓琴, 温爱平. 小秦艽花化学成分研究[J]. 中草药, 2017, 48(2): 241⁃246.

[28] Zhang X Y, Wang X Q, Wen A P. Chemical constituents from flowers of Gentiana dahurica [J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2017, 48(2): 241⁃246.

[29] 范爽, 武雪亮, 薛军, 等. Runt相关转录因子3在人结肠癌HCT⁃116/5⁃FU耐药细胞株中的表达及其与耐药的相关性[J]. 中国医学科学院学报, 2021, 43(5): 706⁃715.

[30] Fan S, Wu X L, Xue J, et al. Expression of runt⁃related transcription factor 3 in human colon cancer cell line HCT⁃116 resistant to 5⁃fluorouracil and the mechanism of drug resistance [J]. Acta Acad Med Sin, 2021, 43(5): 706⁃715.

[31] Tewari M, Quan L T, O'Rourke K, et al. Yama/CPP32β, a mammalian homolog of CED⁃3, is a CrmA⁃inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP⁃ribose) polymerase [J]. Cell, 1995, 81(5): 801⁃809.

[32] Oliver F J, de la Rubia G, Rolli V, et al. Importance of poly(ADP⁃ribose) polymerase and its cleavage in apoptosis. Lesson from an uncleavable mutant [J]. J Biol Chem, 1998, 273(50): 33533⁃33539.

[33] Yae E, Yahara S, El⁃Aasr M, et al. Studies on the constituents of whole plants of Youngia japonica [J]. Chem Pharm Bull (Tokyo), 2009, 57(7): 719⁃723.

[34] Schepetkin I A, Kirpotina L N, Mitchell P T, et al. The natural sesquiterpene lactones arglabin, grosheimin, agracin, parthenolide, and estafiatin inhibit T cell receptor (TCR) activation [J]. Phytochemistry, 2018, 146: 36⁃46.

[35] Khlebnikov A I, Schepetkin I A, Kishkentaeva A S, et al. Inhibition of T cell receptor activation by semi⁃synthetic sesquiterpene lactone derivatives and molecular modeling of their interaction with glutathione and tyrosine kinase ZAP⁃70 [J]. Molecules, 2019, 24(2): 350.

基金资助

湖北省重点研发项目（社会发展）(2022BCA018)

湖北省自然科学基金项目(2021CFB289)

江汉大学科研启动经费(08190001)

江汉大学科研启动经费(2021yb138)

江汉大学科研启动经费(2019037)

江汉大学科研经费(08190006)

江汉大学科研经费(06210035)

工业发酵省部共建协同创新中心开放课题(2022KF16)