0 引 言
大苞荆芥源于唇形科（Labiatae）植物大苞荆芥（
Nepeta bracteata Benth）的全草，维吾尔语音译名为“祖发”或“祖帕”，是维吾尔医常用进口药材，主要产于巴基斯坦、印度等周边国家，《维吾尔药志》等书籍中记载其以干燥的全草入药，具有清热利湿、镇咳平喘等功效，用于治疗气管炎症、咳嗽气喘、感冒发烧、小便不利等病症
［1~5］。目前，以“祖发”命名的药材在药材市场中存在同名异物的现象，除大苞荆芥外还包括硬尖神香草（
Hyssopus cuspidatus）、神香草（
Hyssopus officinalis）及白花枝子花（
Dracocephalum heterophyllum）等
［1，2，6，7］，其中硬尖神香草已被《新疆维吾尔自治区中药维吾尔药饮片炮制规范》等地方标准收录
［8］。大苞荆芥在新疆市场上虽然具有一定的流通量，但因维吾尔药材名称均为“祖发”，易造成混淆，多年来大苞荆芥一直被认为是“祖发”的代用品或伪品
［9~12］。
通过对新疆各地市场及医院临床应用反复调研和实地考察结果，目前新疆各地（尤其是南疆）药材市场、饮片厂及维吾尔医临床所使用的药材祖发一直以来以大苞荆芥为主流品，各地药材市场及医院中很少见到硬尖神香草
［13］。大苞荆芥与硬尖神香草两者为同科不同属的植物，化学成分和药理活性各不相同，但由于大苞荆芥目前尚未制定相关质量标准，致使药材的使用受到很大的制约。因此，急需制定规范的大苞荆芥药材质量标准。近年来，有一些大苞荆芥鉴别鉴定及含量测定方面的研究，但均未形成规范的药材质量标准
［14~16］。本研究收集了多批次大苞荆芥药材，对其性状、基源、显微特征鉴别、薄层色谱鉴别、水分、灰分、浸出物、有效成分含量等药材质量标准项进行深入研究，为大苞荆芥质量标准的制定和用药质量的提高提供科学依据。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
500克摇摆式高速中药粉碎机（型号：DFY⁃500）；电热鼓风干燥箱（型号：GZX⁃9240MBE）；瑞士METTLER TOLEDO电子天平（AB265⁃S）；药典检验筛，五四纱筛长；温度计（量程0~150度）；干燥器（直径30 cm）；扁形称量瓶（50×30 mm）；安捷伦1260液相色谱仪；AL104电子天平（METTLER TOLEDO）；NB⁃QXJ⁃22.5D型超声波清洗仪器；JADE⁃PAK ODS⁃AQ色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。
1.2 试剂
齐墩果酸（批号：PU0596⁃00025），购于普思生物科技股份有限公司；熊果酸（批号：CHB201205），购于成都克洛玛生物科技有限公司；甲醇为色谱纯；纯净水，正己烷、丙酮、乙酸乙酯、甲酸均为分析纯；硅胶GF254（薄层色谱用）。
1.3 药材
药材市场中的“祖发”来源较多，本研究用的31批次样品（全草）均为购买，经新疆维吾尔自治区中药民族药研究所王果平研究员鉴定，共源于3种植物，其中有26批次为文献记载的药用植物大苞荆芥（
图1）、3批次为硬尖神香草、2批次为白花枝子花，样品具体来源信息见
表1。
2 方法
2.1 性状鉴定
大苞荆芥的性状鉴定采用《中国药典》2020年版（四部）
［17］通则0212项下的鉴定方法，对大苞荆芥药材的形状、大小、表面色泽、特征、质地及气味进行观察和描述。
2.2 显微鉴别
参照《中国药典》2020年版（四部）17］通则2001项下的显微鉴别法，对大苞荆芥的茎横切面及药材粉末进行鉴别。
2.3 薄层色谱鉴别
取大苞荆芥药材粉末约0.5 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入95%甲醇20 mL，超声40 min，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取齐墩果酸对照品、熊果酸对照品，分别加甲醇制成每1 mL各含0.07 mg和0.10 mg的溶液，作为对照品溶液。参照薄层色谱法（《中国药典》2020年版（四部
［17］）通则0502）试验，吸取药材供试品溶液、齐墩果酸和熊果酸对照品溶液分别点于同一薄层板上，随即浸入1%碘⁃二氯甲烷溶液至刚过起始线，迅速取出，立即用玻璃板覆盖，30 min后取下玻璃板，挥干，以正己烷⁃丙酮⁃乙酸乙酯⁃甲酸（体积比为9∶4∶2∶0.2）为展开剂展开，取出后晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，分别置于日光和紫外灯（365 nm）下检视。
2.4 水分、灰分、浸出物的测定
按照《中国药典》2020年版（四部）
［17］通则下的0832项下烘干法、2302项下灰分测定法、2201项下醇溶性浸出物测定法对不同批次的大苞荆芥药材进行水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物的测定。
2.5 齐墩果酸和熊果酸含量测定
大苞荆芥中齐墩果酸和熊果酸含量的测定参考前期研究实验的测定方法
［18~20］，并参照《中国药典》2020年版（四部）
［17］通则0512项下的高效液相色谱法进行测定。
2.5.1 色谱条件
JADE⁃PAK ODS⁃AQ色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；以甲醇∶ 0.05 mol/L乙酸铵（体积比为85∶15）为流动相；紫外检测器，检测波长为210 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL。
2.5.2 对照品溶液的制备
精密称取齐墩果酸对照品（0.54 mg）和熊果酸对照品（1.06 mg），置5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成浓度为108 μg/mL和212 μg/mL的对照品溶液。
2.5.3 供试品溶液的制备
取大苞荆芥药材粉末（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，加入95%甲醇20 mL，称重，超声提取40 min，放冷，用95%甲醇补足减少的重量，滤过，取续滤液，过0.45 μm滤膜，作为供试品溶液。
2.5.4 线性关系考察
精密称取齐墩果酸对照品5.4 mg，熊果酸对照品10.6 mg，置于10 mL容量瓶中，精密加入甲醇，定容后各移取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，精密加入甲醇定容制成混合标准品溶液，按上述色谱条件进样分析。以齐墩果酸和熊果酸对照品的质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归分析。
2.5.5 精密度试验
精密吸取同一齐墩果酸和熊果酸对照品溶液，连续进样6次，计算其RSD值，考察仪器精密度是否良好。
2.5.6 重复性试验
取同一批次样品平行制备6份供试品溶液，按上述方法操作，测定峰面积，计算RSD值，考察该方法的重现性是否良好。
2.5.7 稳定性实验
取同一份药材供试品溶液，分别在0、2、6、8、12、24、48 h后进行测定，记录峰面积，计算RSD值，考察该方法在48 h的稳定性。
2.5.8 加样回收率试验
精密称取同一批次的药材样品0.5 g，共6份，按上述方法制备供试品溶液。取一定量的供试品溶液，精密加入齐墩果酸和熊果酸对照品溶液，混匀后按上述色谱条件精密吸取20 μL进行含量测定，计算加样回收率。
2.5.9 样品测定
根据样品制备方法，按照上述色谱条件，将不同批次的样品进行样品分析，采集峰面积，根据线性方程计算样品中齐墩果酸和熊果酸的含量。
3 结果与分析
3.1 药材性状鉴别
如
图1所示，大苞荆芥药材常不完整，较少的根细弱，稍弯曲，淡黄棕色。主要为花序及其下的茎，常无茎生叶，长3~9 cm，多4~5 cm。茎方形，灰棕色或浅棕色，细弱易折断，断面黄白色，中空。叶对生，薄草质，稀少，叶片披针形至广卵形，全缘，叶柄短，被短糙毛。轮伞花序多数组成假穗状，生于叶腋或枝端，总苞片广卵形，小苞片椭圆状披针形，全缘，边缘有疏糙毛，略带紫红色；萼长5~7 mm，齿5，边缘有粗糙毛，几近等长。气微清香，味淡。
3.2 药材显微鉴别
3.2.1 大苞荆芥茎横切面显微特征
茎横切面近圆形，外围表皮细胞1层排列紧密；表皮内侧具1~3层厚角组织（外皮层，部分被挤破碎）；外皮层内侧有1~3层细胞较大的薄壁组织呈环状排列；皮层薄壁组织内侧的次生韧皮部和残留初生韧皮部不发达，仅有1~2层呈环状排列；维管形成层1层成环状排列，其内侧为发达的次生木质部，向外（生长后期）木纤维较多，向内（生长前期）导管较多、其内方有部分保留的初生木质部；中央髓部为较大不等的薄壁细胞构成的薄壁组织，后期有时形成髓腔，见
图2。
3.2.2 大苞荆芥药材粉末特征
粉末灰褐色。表皮细胞不规则形，长69.22~242.19 μm，宽30.11~55.87 μm。苞片表皮长形，两侧有不规则凸凹；边缘具非腺毛，长84.03~253.52 μm，宽21.99~105.08 μm。花药倒卵形，花粉粒近圆形或卵圆形，种皮具不规则雕纹，方形草酸钙晶体；导管螺纹，直径9.07~40.75 μm，见
图3。
3.3 薄层色谱鉴别
不同批次的药材与对照品在薄层色谱相应位置上，日光和紫外灯下分别显相同颜色的斑点和荧光斑点，见
图4。
3.4 水分、总灰分和醇溶性浸出物测定
共进行了26批大苞荆芥药材样品的水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物的测定结果见
表2。由试验结果可得出26批大苞荆芥药材样品的水分为3.69%~7.98%；总灰分为7.97%~18.92%；酸不溶性灰分为1.67%~7.74%；浸出物12.41%~19.51%。进行这些常规项目检查，综合评价并舍去极端值，可有效地评价药材的优劣，在一定程度上反应药材的质量。
3.4.1 水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物极端值研究
为防止水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物测定结果出现远离均数的极端值，采用spss 18.0软件进行分析，采用explore绘制箱线图（
图5）。
箱线图结果表明，在水分测定数据中14和16号样品为离群值，故舍去。选择其余24批次样品计算平均值为5.40%；总灰分测定中24号样品为离群值，故舍去，其余25批次样品计算灰分平均值为10.07%；酸不溶性灰分24号样品为离群值，故舍去，其余25批次样品平均值为2.51%；浸出物测定中1号样品为离群值，故舍去，其余25批次样品计算浸出率均值为17.16%。
3.4.2 水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物限量标准
根据测定数据，水分的限量标准取均值上浮20%，为6.40%，综合分析确定大苞荆芥水分含量不得高于7.0%，26批次样品中25批次样品合格，合格率为96%；总灰分和酸不溶性灰分的限量标准取均值上浮20%，值分别为12.08%和8.01%。综合分析确定大苞荆芥总灰分含量不得高于12%，25批次样品合格，合格率为96%；酸不溶性灰分含量不得高于8%，26批次样品全合格，合格率为100%；浸出物的限量标准取均值下浮20%，值为13.73%，综合分析确定大苞荆芥浸出物不得低于14.0 %，26批次样品中有25批样品合格，合格率为96 %。
3.5 齐墩果酸和熊果酸含量测定
3.5.1 线性范围
以对照品（齐墩果酸和熊果酸）质量浓度为横坐标X，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程分别为齐墩果酸：y=989 3x-36.121（R2 = 0.999 3），熊果酸：y=827 8.9x-35.609 （R2 = 0.999 4），结果表明齐墩果酸在0.108~4.32 μg、熊果酸在0.212~8.48 μg进样量与峰面积呈良好线性关系。
3.5.2 精密度试验
测得齐墩果酸和熊果酸的RSD分别为2.09%，0.81%，表明仪器精密度良好。
3.5.3 重复性试验
测得齐墩果酸和熊果酸的RSD分别为2.10%，1.48%，表明该方法重复性良好。
3.5.4 稳定性试验
测得齐墩果酸RSD值为1.65%，熊果酸RSD值为1.95%，表明供试品溶液在48 h内的稳定性良好。
3.5.5 加样回收率试验
测得齐墩果酸平均加样回收率为98.12%，RSD值为1.19%，熊果酸平均加样回收率为99.46%，RSD值为1.81%。（
表3）
3.5.6 样品含量测定
将不同批次的样品按上述方案进行分析，采集高效液相色谱峰面积，根据线性方程计算齐墩果酸和熊果酸的含量，结果如
表4。
为防止测定结果出现远离均数的极端值，采用spss 18.0软件进行分析，explore绘制箱线图（
图6），结果表明，19号样品为离群值，故舍去。其余25批次样品齐墩果酸均值为0.0667%、熊果酸均值为0.114%。
根据测定数据，取均值下浮20%，值为0.05%，综合分析确定大苞荆芥齐墩果酸不得低于0.05%，26批次样品中有24批样品合格，合格率为92%；取均值下浮20%，值为0.091%，综合分析确定大苞荆芥熊果酸不得低于0.09%，26批次样品中有25批样品合格，合格率为96%。
4 讨 论
4.1 薄层色谱鉴别条件选择
大苞荆芥主要含有黄酮类、萜类、有机酸类物质。其中，齐墩果酸和熊果酸均为三萜类化合物，具有抗炎、镇静等作用，是大苞荆芥发挥药理活性的主要物质，因此，选择齐墩果酸和熊果酸作为薄层鉴别的对照物质。分别考察了正己烷⁃丙酮⁃乙酸乙酯⁃甲酸，正己烷⁃乙酸乙酯⁃冰醋酸等不同薄层展开体系，分别对26批大苞荆芥、3批硬尖神仙草、2批白花枝子花样品进行鉴别实验，结果表明正己烷⁃丙酮⁃乙酸乙酯⁃甲酸（体积比为9∶4∶2∶0.2）作为展开剂，实验结果分离度好，斑点相对位置和重现性好。同时经过试验确定，经1%碘⁃二氯甲烷溶液浸润30 min后展开，齐墩果酸和熊果酸的分离度好，熊果酸的斑点更明显、且较大，说明药材中熊果酸化学成分的含量较高。比较了国家药典规定使用的5种硅胶板，结果表明均可对大苞荆芥中的熊果酸及齐墩果酸进行定性鉴别。
4.2 高效液相色谱含量测定条件优化
对提取溶剂（甲醇、乙醇、氯仿等）、体积分数（50%、70%、75%、85%、95%、100%）、提取时间、料液比进行考察，最终建立了大苞荆芥药材中熊果酸及齐墩果酸的HPLC含量测定的方法，对26批大苞荆芥样品进行了定性定量分析，结果表明各样品均可检出齐墩果酸及熊果酸，综合分析确定大苞荆芥齐墩果酸含量不得低于0.05%，熊果酸含量不得低于0.09%，可作为指标用于进行质量控制。
4.3 大苞荆芥（祖发）药材标准制定的意义
经调查研究发现，多年来新疆各地（尤其是南疆）药材市场所经销的药材和维吾尔医临床所使用的药材神香草（祖发）一直以来以大苞荆芥为主流品。针对大苞荆芥使用广泛且质量标准未确定的问题，本研究建立了维药大苞荆芥的定性、定量检测方法，具有简便、准确、灵敏度高、重复性好等特点，不仅可为维吾尔药材大苞荆芥的生产、市场流通及使用提供质量标准控制依据，而且有助于大苞荆芥的深入研究与产品开发。
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