靛蓝生物合成酶的研究进展

Research advances in enzymes involved in indigo biosynthesis

摘要

靛蓝色素是人类所知最古老的色素之一，广泛用于食品、医药和印染工业。靛蓝最初由植物中提取获得，作为一种色泽艳丽、无毒无害、能够生物降解的环保型染料，深受青睐。生物合成靛蓝因其绿色、高效、节约土地、安全稳定等优点，作为取代目前植物提取及化学合成的主流途径，受到广泛关注。在过去的几十年中，许多天然酶和工程酶已筛选用于合成靛蓝。本文概述了能够催化靛蓝生物合成的酶及相关应用，并探讨了当前存在的问题和未来研究方向，为推进基于生物合成的靛蓝工业化生产奠定基础。

Abstract

Indigo is one of the oldest pigments known to mankind and is widely used in the food， medicine and printing⁃dyeing industries. Indigo was originally extracted from plants and is highly favored as an environmentally friendly dye with bright color， non⁃toxic， and biodegradable properties. Biosynthesis of indigo has attracted widespread attention as a mainstream way to replace the current plant extraction and chemical synthesis due to its advantages of green， efficient， landsaving， safety and stability. Over the past few decades， a number of natural and engineered enzymes have been identified for use in the synthesis of indigo. This review summarizes the enzymes that can catalyze indigo biosynthesis and their related applications， and discusses the current problems and future research directions， laying the foundation for promoting the industrial production of indigo based on biosynthesis.

Graphical abstract

关键词

靛蓝 / 色素 / 酶 / 生物合成 / 催化机制

Key words

indigo / pigment / enzyme / biosynthesis / catalytic mechanism

0 引 言

天然靛蓝（C₁₆H₁₀N₂O₂）又名蓝靛、靛青，为水溶性非偶氮类着色剂。靛蓝染料使用历史悠久，秘鲁北海岸史前遗址发现的存在了6 000多年的棉织物上的蓝色色素痕迹经分析为靛蓝^［1］。我国春秋战国时期，《诗经》有云“终朝采蓝、不盈一襜”，此时已有采蓝叶作染料的记载；靛蓝（“黛”）也在该时期作为女子的画眉材料^［2］。现今，靛蓝依然延续着用于纺织品染色的传统^［3］。靛蓝染色可以使牛仔布料在洗涤过程中形成独特的磨损效果，故成为牛仔裤产业最重要的染料^［4］。同时，天然靛蓝也被用于染发^［5，6］、数字纺织品印刷油墨的原料^［7］，并可作为食品添加剂在蜜饯类、果蔬汁饮料类、凉果类等多种食品中使用^［8］。此外，靛蓝化合物还具有多种药用活性^［9］，包括抗惊厥、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗炎^［10］、镇痛^［11］和抗癌等。

据统计，全球每年靛蓝需求达5万吨，需求量巨大。起初，人们从植物中提取所需的天然靛蓝色素，主要包括豆科（Fabacea）的木蓝（Indigofera tinctoria）、十字花科（Brassicaceae）的菘蓝（Isatis indigotica）、蓼科（Polygonaceae）的蓼蓝（Polygonum tinctorium）、爵床科（Acanthaceae）的马蓝（Baphicacanthus cusia）^{［2，12~14］}等。然而从植物中提取的靛蓝含量最多只能达到2%^［15］，且制备工艺繁琐，需要经过采摘、下坑、搅浆、打花、出靛、上缸、储藏等十几道工序，质量不稳定，还需历时20 d左右；而且野生资源有限，人工栽培需占用大量土地，供求矛盾日益突出。1897年，德国化学家Adolf von Baeyer发现的化学合成靛蓝法（1905年度诺贝尔化学奖^［16］）缓解了靛蓝资源短缺的问题。目前，靛蓝化学合成的方法主要包括邻硝基苯基丙酸法、β⁃苯胺乙醇法、均二苯硫脲法、苯基甘氨酸一邻甲酸法、苯基甘氨酸法等，其中苯基甘氨酸法为主流方法。化学合成靛蓝虽然效率高（收率约97%），但合成过程中涉及苯胺、邻苯二甲酸等有毒有害的化学物质^［17］，对操作者具有潜在的致癌毒性，污水排放等也对环境造成了严重的破坏；同时化学合成色素的安全性问题也备受关注^［18］。随着基因工程、酶工程和合成生物学的快速发展，生物合成靛蓝因其绿色、高效、节约土地、安全稳定、易于工业化生产成为研究的热点。本文主要综述了靛蓝生物合成酶的研究进程、分类以及结构基础，同时对未来该领域的研究及应用发展方向进行了展望。

1 靛蓝生物合成酶的研究历程

生物合成是利用酶或生物有机体（全细胞、细胞器、组织等）作为催化剂进行化学转化的过程，实现前体物质的转化或通过从头合成制备目标产物。酶是生物合成的基石，靛蓝生物合成酶的发现以1983 年Science的一篇文章^［19］为起点，Ensley等利用基因工程技术构建表达重组的萘双加氧酶合成了靛蓝。随后人们陆续从细菌、人体、植物中发现了多种靛蓝生物合成酶，利用基因工程技术构建异源表达重组酶或对天然酶进行定向改造在靛蓝合成领域得到了迅速的发展（见图1）。

2 靛蓝生物合成酶及其在靛蓝合成中的应用

至今，研究者已经报道多种靛蓝生物合成酶并发现它们均属于加氧酶，包括单加氧酶和双加氧酶^［20~58］（表1），作为催化吲哚生成吲哚酚的关键酶在靛蓝生物合成中起重要作用：首先色氨酸在色氨酸酶的催化作用下生成吲哚，吲哚可在单加氧酶作用下经环氧化作用生成吲哚环氧化物，然后通过环氧苯乙烯异构酶催化生成吲哚酚；同时，吲哚也可在单加氧酶作用下直接生成吲哚酚；第三条途径是吲哚通过双加氧酶催化生成顺⁃2，3⁃二羟基吲哚，随后自发脱水生成吲哚酚；最终吲哚酚自发二聚化生成靛蓝（图2）。靛蓝生物合成酶的催化反应依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）、黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）、血红素、抗坏血酸、细胞色素c、L⁃半胱氨酸、Cu^2＋、Fe^2＋等不同类型的辅（酶）因子，且存在较高选择依赖性。因此，根据辅因子类别可将靛蓝生物合成酶分为非血红素铁加氧酶、含血红素加氧酶和依赖黄素的单加氧酶^［21］。其中非血红素铁加氧酶包括萘加氧酶和多元酚羟化酶；含血红素加氧酶包括细胞色素P450单加氧酶等；依赖黄素的单加氧酶包括苯乙烯单加氧酶、2⁃羟基联苯3⁃单加氧酶、含黄素单加氧酶和Baeyer⁃Villiger单加氧酶。这些酶多来源于具有靛蓝合成能力的微生物菌株中，包括假单胞菌属（Pseudomonas spp.）、红球菌属（Rhodococcus spp.）、丛毛单胞菌（Comamonas spp.）、不动细菌属（Acinetobactor spp.）和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas spp.）等^［22］。

2.1 单加氧酶

单加氧酶是将分子氧中的一个氧原子加到底物中，另一个氧原子被还原成水。目前发现参与靛蓝生物合成的单加氧酶种类较多，主要包括苯乙烯单加氧酶、苯酚羟化酶、黄素蛋白单加氧酶和细胞色素P450单加氧酶等。与双加氧酶相比，单加氧酶通常合成途径较单一，副产物少^［59］。

2.1.1 苯乙烯单加氧酶

苯乙烯单加氧酶（SMO，EC 1.14.14.11）^［24］是由编码FAD依赖型加氧酶的styA和编码NADH/FAD氧化还原酶的styB两个基因组成^［59］。其中styA基因表达生成的蛋白亚基主要行使催化烯烃环氧化功能且在反应中消耗FADH₂；styB基因表达产物作为一类典型的NADH的黄素蛋白酶能催化辅酶的再生（即通过接收辅酶因子NADH携带的氢原子而向整个加氧反应提供还原力将FAD转化成FADH₂），使整个反应辅酶系统得以循环^［60］。有趣的是，苯乙烯和吲哚在结构上非常相似，因此研究人员研究了多种将吲哚转化为靛蓝的苯乙烯降解菌株。1997 年，研究者发现两株恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida ）S12和CA⁃3在含吲哚的固体培养基上生长时呈蓝色，同时发现在该过程中加入苯乙烯有助于提高SMO的催化活性，进而提高靛蓝的产量。另外，他们推测了恶臭假单胞菌S12的SMO催化吲哚形成吲哚环氧化物（图2），在环氧苯乙烯异构酶（SOI：styrene oxide isomerase）的作用下形成吲哚酚，随后二聚合成靛蓝^［61］。2007年，有学者在土壤的宏基因组文库中挖掘到一种新型苯乙烯单加氧酶SmoA，也能催化吲哚生成靛蓝^［62］。2010年，研究人员通过随机突变并利用吲哚⁃靛蓝转化试验监测来自恶臭假单胞菌CA⁃3的SMO活性的变化，发现突变使酶活提高了9~12 倍^［21］。2022 年，学者发现恶臭假单胞菌的苯乙烯单加氧酶StyAB、色氨酸酶TnaA和伴侣蛋白groES/groEL在大肠杆菌中共表达能生产靛蓝^［27］（表1）。

2.1.2 苯酚羟化酶

苯酚羟化酶又称多元酚羟化酶（multicomponent phenol hydroxylase， mPH， EC 1.14.13.7），是一种多组分单加氧酶^［63］，含KLMNOP共6个组分，分为4类：PHK、PH（LNO）₂ 、PHM和PHP。PHK的作用是为mPH的活性位点聚集铁原子；PH（LNO）₂负责底物结合；PHM是调节蛋白，对mPH的高效催化作用有重要影响；PHP是NADH氧化还原酶，负责氧化还原反应中的电子传递。据报道，来自节杆菌（Arthrobacter sp.）W1和不动杆菌（Acinetobacter sp. ）ST⁃550中mPH均发现能催化吲哚产生靛蓝^{［32，64］}（表1）。2013年，研究人员利用大肠杆菌表达来自假单胞菌KL33的mPH_KL33与假单胞菌KL28的mPH_KL28，重组蛋白能催化吲哚生成靛蓝^［31］。

2.1.3 黄素蛋白单加氧酶

黄素蛋白单加氧酶（FMO，EC 1.14.13.8）是依赖FAD、还原型辅酶Ⅱ（NADPH）和分子氧的单组分加氧酶，属于黄素氧化酶家族，是一种独特的不含亚铁血红素的单加氧酶。FMO能够催化含亲核杂原子的化合物，如氮、硫、磷、硒为氧化位点的外源性和内源性化学物质的氧化，具有代谢环境中的有毒物和致癌物质的功能。2003年，研究人员利用大肠杆菌表达来自噬甲基菌（Methylophaga sp.）菌株SK1的mfmo有效地催化吲哚生成了靛蓝^［34］。2008 年，有学者发现来自嗜硫胺噬甲基菌（Methylophaga aminisulfidivorans）MP^T的mfmo能将色氨酸转化生成克级规模的靛蓝^［35］。2010年，有研究发现来自中生根瘤菌（Mesorhizobium loti）和鞘鞍醇单胞菌（Sphingomonas wittichi）的B1（GenBank：GU586287）和B2（GenBank：GU586288）也具有靛蓝合成作用^［36］。2015 年，研究人员发现来自棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum） ATCC13032中的cfmo能以吲哚为底物合成靛蓝^［37］。2020 年，研究人员发现了首个来自于植物的靛蓝生物合成酶蓼蓝（Polygonum tinctorium）的ptfmo，重组蛋白能催化吲哚生成靛蓝^［39］（表1）。

2.1.4 P450单加氧酶

细胞色素P450单加氧酶（EC 1.14.14.X）是一类种类繁多的超基因家族酶系，能催化烷基的羟化、氧化、环氧化、氨基的羟化、氧化等多种反应，广泛存在于细菌、真菌、植物、动物以及人体内^［42］。1999 年，有研究发现来自人的细胞色素P450能催化吲哚产生靛蓝，包括P450 2A6、P450 2C19和2E1^［65］。2018 年，研究人员发现来自链霉菌（Streptomyces cattleya） CYP102G4是一种天然产生靛蓝的自给P450酶，也能够催化吲哚生成靛蓝^［40］。

2.1.5 甲苯⁃4⁃单氧酶

甲苯⁃4⁃单加氧酶（T4MO）是由连续的基因簇编码的多组分单加氧酶复合物，其中六个关键基因依次命名为t4moA–F。其中t4moA、t4moB和t4moE是编码羟化酶组分的亚单位；t4moC编码一种Rieske型［2Fe⁃2S］铁氧还蛋白；t4moD编码催化效应蛋白前体——不含氧化还原活性辅因子的催化效应蛋白；t4moF编码含有FAD和［2Fe–2S］簇的NADH氧化还原酶；T4MOH是由t4moA、t4moB和t4moE基因产物组成的二铁羟化酶。它将甲苯氧化为对甲酚，具有较高的区域特异性和氧化杂环芳香化合物（如吲哚）的作用^［66~69］。2005年，研究人员发现来自门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）KR1的T4MO能催化吲哚产生靛蓝，且发现酶活性位点的修饰可改变其产物，如新的色素和其他具有潜在商业和医疗用途的吲哚氧化产物^［70］。

2.1.6 其他单加氧酶

目前报道的参与靛蓝生物合成的单加氧酶还包括二甲苯单加氧酶、2，4⁃二氯苯酚羟化酶、萜类环化酶等。二甲苯单加氧酶（XMO）是由两种不同的蛋白组成，即xylA和xylM基因的产物，分别作为电子转移蛋白和末端羟化酶发挥作用^［71］。1986 年，有研究发现来自恶臭假单胞菌mt⁃2的xyl参与靛蓝的合成^［45］。2015年，陈健峰等首次发现2，4⁃二氯苯酚羟化酶能将色氨酸转化合成靛蓝^［47］。2021年，研究者利用萜类环化酶XiaI构建了一个新型高效的靛蓝染料生产系统，重组菌XiaI⁃Fre⁃TnaAB⁃KatE能够以吲哚为底物生成靛蓝^［48］（表1）。

2.2 双加氧酶

双加氧酶反应是在双加氧酶作用下，将两个氧原子引入到芳香环上形成二羟基类物质的过程。目前发现的参与靛蓝生物合成的双加氧酶主要包括萘双加氧酶、四氢化萘双加氧酶及甲苯双加氧酶等。

2.2.1 萘双加氧酶

萘双加氧酶（NDO；E.C.1.14.13.8）是由一条短的电子传递链组成的多组分酶系统。典型的NDO由三个组分组成，包括铁氧还蛋白、铁氧还蛋白还原酶和铁硫蛋白（ISP）。其中ISP由大亚基和小亚基组成，电子通过铁氧化蛋白还原酶和铁氧化还原蛋白由NADH传递至铁硫蛋白的大、小亚基。铁氧还蛋白的电子通过位于相邻α亚单位12Å距离处的Rieske［2Fe⁃2S］中心传递到铁中。在靛蓝的生物合成过程中，NDO只参与转化过程的第一步，即吲哚的双加羟，随后的产物都是由不稳定的中间产物自发形成靛蓝。1983年，有学者从恶臭假单胞菌PpG7中克隆了质粒NAH7片段，在大肠杆菌HB101中表达，重组大肠杆菌在营养培养基中产生了靛蓝^［19］；随后，研究人员相继发现来自恶臭假单胞菌NCIB9816、恶臭假单胞菌34、荧光假单胞菌62、壬二酸假单胞菌57、鞘氨醇单胞菌107、假单胞菌J26、丛毛单胞菌MQ菌株的NDO均能将吲哚转化为靛蓝^{［51，53，55，56］}。

2.2.2 其他双加氧酶

四氢化萘双加氧酶和甲苯双加氧酶（TDO）也具有靛蓝生物合成功能，但目前的研究较少。2005 年，研究人员从鞘脂单胞菌（Sphingomonas macrogolitabida ）TFA菌株中克隆出编码四氢化萘双加氧酶的基因thnAlA2A3A4并转化至大肠杆菌中，检测到了靛蓝^［57］。2010年，研究者发现甲苯诱导的恶臭假单胞菌F1中TDO的表达可以催化吲哚产生靛蓝^［58］。

3 靛蓝生物合成酶的结构基础及改造

酶的功能由组成其的氨基酸的种类、数目、排列顺序和肽链空间结构共同决定^［72］。为了提高靛蓝生物合成酶的催化效率，研究人员尝试通过蛋白结构理性设计的方法用以提高催化的精确性和有效性，从而提升靛蓝的产量。

3.1 黄素蛋白单加氧酶

2008年，来自噬甲基菌SK1（Methylophaga sp.） SK1的FMO（mfmo）（PDB：2VQ7）的蛋白晶体结构（2.6 Å分辨率）得以解析。它的氨基酸序列含3个特征基序：FAD结合序列——负责结合FAD，通用序列为GXGXXG；NADPH结合序列——负责稳定结合NADPH形成酶⁃FAD⁃NADP⁺的复合体，通用序列为GXGXX（A/G）；FMO识别序列——负责捕获底物，通用序列是FXGXXXHXXX（Y/F）。该蛋白由一个较大的FAD结合域和一个较小的NADPH结合域组成（图3）。两个结构域均显示出典型的罗斯曼折叠^［73］（由两个重复的部分组成，每个部分包含6个平行的β折叠与两对α螺旋形成β⁃α⁃β⁃α⁃β的拓扑结构），并在氨基酸残基170和280附近通过多肽链圈将两个结构域的接口相连。2019年，Loncar等借助计算机辅助蛋白质设计以mfmo结构为基础进行理性设计和定向突变，突变体（C78I）催化吲哚产生靛蓝的k_cat提高了1.5倍^［74］。近期，有学者对mfmo进行半理性设计和高通量筛选获得突变体，抑制靛蓝生物合成并激活旁路靛玉红途径，突变体（K223R/D317S）催化吲哚产生靛玉红的效率提高了6.6倍^［75］。

3.2 苯丙酮单加氧酶

与mfmo类似，来自嗜高温放线菌（Thermobifida fusca）的PAMO（PDB：1W4X；2YLR）的蛋白结构（图4）由FAD结构域（残基10~158和390~542）和NADPH结构域（残基159~389）组成，且具有典型的罗斯曼折叠。FAD结构域含有3个C端α螺旋，且不存在于二硫键氧化还原酶的相应结构域中；NADPH结构域在βαβ单位后方有120个氨基酸（残基220~340）插入在NADPH结合位点的中心，插入的氨基酸形成α螺旋亚结构域，与FAD结构域相互作用，形成活性位点的一部分^{［47，76］}。2007年，研究者对其结构进行理性设计和定点突变，发现突变体M446G获得了催化吲哚合成靛蓝的能力^［49］。2022年，研究人员通过多轮迭代饱和突变获得了PAMO的突变体PAMO_HPCD，并以色氨酸为底物生产靛蓝，产量达到3 g/L（表1），这是迄今为止通过生物合成生产靛蓝的最高产量^［50］。蛋白结构分析显示这些突变位点位于FAD结合域中且靠近活性位点，因此对催化效率产生了重要影响^［77］。

3.3 P450单加氧酶

来自巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium）的P450 BM3（CYP102A1）由血红素域和黄素域两个结构域组成（图5），其中血红素域（残基20~458）负责催化功能，黄素域（残基479~630）负责从NADPH得到电子并传递到血红素域参与反应^［78］。2000年，研究人员发现P450 BM3经定向进化后的三突变酶（A74G/F87V/L188Q）获得了催化吲哚生成靛蓝的功能^［79］。随后，研究人员以此为基础进行突变设计获得三个单突变酶（D168H、D168L、E435T）^［80］和一个双突变酶E435T/D168L^{［81，82］}，进一步提升了该酶的催化活性，k_cat/K_m提高了5~8倍。近期，研究者利用P450 BM3构建了过氧化氢依赖的催化体系氧化吲哚生成靛蓝，最终发现F87G/T268A突变体能高效（k_cat /K_m=1 388 mM^-1·min^-1）催化吲哚氧化^［83］。另外，研究人员通过定向进化将来源于人的P450 2A6进行随机突变，获得的双突变酶L240C/N297Q生产靛蓝的能力远远高于野生型菌株，催化效率提高了4倍^［84］。

3.4 2⁃羟基联苯⁃3⁃单加氧酶

2⁃羟基联苯⁃3⁃单加氧酶（HbpA；EC 1.14.13.44）是由分子量为256 kDa的均四聚体组成的FAD依赖型单加氧酶，在NADH和分子氧的存在下能催化各种2⁃取代酚的邻羟基化^［46］。2015年，HbpA的蛋白晶体结构（PDB：4CY8，分辨率2.3~2.5 Å）得以解析，其单体分子分为三个结构域：FAD结合结构域（残基1~77，99~199，294~436）；底物结合结构域（残基78~98，200~293）和C端结构域（残基437~586）（图6）。其中FAD结合域由罗斯曼折叠和甘氨酸残基GXGXXG的保守基序组成；底物结合结构域位于FAD的异咯嗪环上方；C端结构域具有硫氧还蛋白折叠^［85］，其作用是参与四级结构的形成^［86］。2002年，研究人员对来自土壤中壬二酸假单胞菌（Pseudomonas azelaica）HBP1的HbpA进行定向进化^［87］，突变酶HbpA_ind（D222V和V368A双突变）获得催化吲哚生成靛蓝的能力^［46］。HbpA的高分辨率晶体结构分析显示，D222V可能促进了底物在蛋白中的正确定位，而V368A则影响了催化效率^［86］。

4 总结与展望

综上所述，目前已经有多种不同类型的靛蓝生物合成酶被发现，它们多来源于微生物。植物作为靛蓝提取的主要来源，被认为存在高效率的靛蓝生物合成酶，然而相关研究却报道较少，目前仅发现蓼蓝fmo参与靛蓝的生物合成。当前，植物基因组学及相关技术的飞速发展为植物中功能基因的快速挖掘带来了前所未有的机遇，可以预见植物来源的靛蓝生物合成酶将被陆续鉴定并受到广泛关注。同时，目前已经有一些靛蓝生物合成酶的蛋白晶体结构得到解析，如CYP 2A6、2E1^［88］，SMO^［89］，T4MO^［90］等，将为全面解析靛蓝生物合成酶的催化机制，并开展以提升靛蓝产量为目的的蛋白理性设计和定向改造，获得专属性强、催化效率高的新型靛蓝生物合成酶奠定基础。靛蓝生物合成酶新资源的开发及现有酶的结构改造与设计都将成为现阶段靛蓝生物合成酶研究的重点，有望从源头推进靛蓝生物合成的工业化进程。

然而，需要指出的是，如何使得靛蓝生物合成满足工业化要求仍面临着巨大的挑战，主要体现如下：首先，酶反应体系昂贵，常用的合成底物吲哚、色氨酸和辅酶价格昂贵，需要寻找更廉价的原材料进行靛蓝生物合成^［20］；其次，产物纯度较低，大部分合成过程中都会生成副产物（靛玉红等吲哚氧化产物）^［75］，导致后续纯化分离的成本较高；此外，由于当前生物过程系统的机械平台尚未完善^［91］，导致大规模工业化生产难度较大。

尽管如此，靛蓝生物合成酶作为靛蓝生物合成的高效催化元件，对于推进工业化进程、缓解化学合成造成的环境污染以及种植栽培带来的土地供应等问题，仍具有重要的应用前景，值得深入研究。

参考文献

[1] Splitstoser J C, Dillehay T D, Wouters J, et al. Early pre⁃Hispanic use of indigo blue in Peru [J]. Sci Adv, 2016, 2(9): 2375⁃2548.

[2] 王艺涵,金艳,陈周全,等.蓝草类药材的本草考证[J].中国中药杂志,2020, 45(23): 5819⁃5828.

[3] Wang Y H, Jin Y, Chen Z Q, et al. Textual research on medicinal blue herbs [J]. China J. Chin. Mater. Med., 2020, 45(23): 5819⁃5828.

[4] Kaplan G, Seferoğlu Z. The Synthetic approaches for preparation of indigo and applications in denim industry [J]. Curr Org Chem, 20(4): 361⁃364.

[5] Wu M, Chen Y, Peng P, et al. Optimization of dark dyeing poly (lactic acid) yarn with indigo dyes applied to denim fabric [J]. Text. Inst, 2022: 81⁃84.

[6] Das B C, Reji N, Philip R. Optical limiting behavior of the natural dye extract from Indigofera tinctoria leaves [J]. Opt Mater, 2021, 114: 110925.

[7] Ju⁃Sub K. Effects of hair dyeing and change of hair texture by indigo dye [J]. Journal of the Korean Society of Applied Science and Technology, 2021, 38(1): 9⁃18.

[8] Lee W K, Sung E J, Moon J R, et al. Performance analysis of ink for digital textile printing using natural indigo [J]. Journal of the Korean Society of Dyeing and Processing, 2021, 33(4): 202⁃209.

[9] 李静娜,黄常刚,梁高道,等.固相萃取⁃高效液相色谱法测定食品中的靛蓝和亮蓝[J].卫生研究,2017, 46(2): 318⁃323.

[10] Li J N, Huang C G, Liang G D, et al. Determination of indigo and brilliant blue in different types of food products by high performance liquid chromatography with solid phase extraction [J]. Journal of Hygiene Research, 2017, 46(2): 318–323.

[11] 林琳, 刁勇, 周心怡, 等. 靛蓝的生物活性研究进展[J]. 染料与染色, 2019, 56(4): 16⁃18.

[12] Lin L, Diao Y, Zhou X Y, et al. Advances in biological activity of indigo [J]. Dyestuffs and Coloration., 2019, 56(4): 16⁃18.

[13] 赖家文,林丽云,王东翔,等.靛蓝对脂多糖诱导的THP⁃1细胞的抗炎作用[J].中国皮肤性病学杂志,2023, 37(2): 134⁃138.

[14] Lai J W, Lin L Y, Wang D X, et al. Anti⁃inflammatory effect of indigo on lipopolysaccharide⁃induced THP⁃1 cells [J]. The Chinese Journal of Dermatovenereology, 2023, 37(2): 134⁃138.

[15] Liu N, Zhang G X, Niu Y T, et al. Anti⁃inflammatory and analgesic activities of indigo through regulating the IKK beta/I kappa B/NF⁃kappa B pathway in mice [J]. Food Funct, 2020, 11(10): 8537⁃8546.

[16] Fernie A R. Decoding indigo: the chromosome‐scale genome of Strobilanthes cusia a highly pigmented plant important to diverse ethnic cultures in Asia [J]. Plant J, 2020, 104(4): 861⁃863.

[17] Zhang Y M, Su Y, Dai Z W, et al. Integration of the metabolome and transcriptome reveals indigo biosynthesis in Phaius flavus flowers under freezing treatment [J]. PeerJ, 2022, 10: e13106.

[18] Mlinarić S, Pfeiffer T, Krstin L, et al. Adaptation of Amorpha fruticosa to different habitats is enabled by photosynthetic apparatus plasticity [J]. Photosynthetica, 2021, 59(1): 137⁃147.

[19] 潘金火,李国荣.四种大青叶药材中靛蓝、靛玉红的含量比较[J].中药材,2000(5): 254⁃255.

[20] Pang J H, Li G R.Comparison of indigo and indirubin in four large green leaf medicinal herbs [J].Chin Med Mat, 2000(5): 254⁃255.

[21] 吴祺.拜耳与合成靛蓝[J].化学通报,2001, 64(8): 527⁃529.

[22] Wu Q. Bayer and synthetic indigo [J]. Chemistry, 2001, 64(8): 527⁃529.

[23] 姚继明,吴远明.靛蓝染料的生产及应用技术进展[J].精细与专用化学品, 2013, 21(4): 13⁃18.

[24] Yao J M, Wu Y M. Progress in production and application of indigo blue [J].Fine and Specialty Chemicals, 2013, 21(4): 13⁃18.

[25] Hsu T M, Welner D H, Russ Z N, et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy [J]. Nat Chem Biol 2018, 14(3): 256⁃261.

[26] Ensley B D, Ratzkin B J, Osslund T D, et al. Expression of naphthalene oxidation genes in Escherichia coli results in the biosynthesis of indigo [J]. Science, 1983, 222(4620): 167⁃169.

[27] 马桥,曲媛媛,张旭旺,等.靛蓝的微生物合成研究新进展[J].应用与环境生物学报, 2012, 18(2): 344⁃350.

[28] Ma Q, Qu Y Y, Zhang X W, et al. Recent advances in microbial synthesis of indigo [J]. Chin J Appl Environ Biol, 2012, 18(2): 344⁃350.

[29] Fabara A N, Fraaije M W. An overview of microbial indigo⁃forming enzymes [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2020, 104(3): 925⁃933.

[30] 杜灵燕,岳建明,马金旺,等.高产靛蓝色素大肠杆菌工程菌构建及其发酵转化条件[J].中国食品学报, 2017, 17(3): 64⁃72.

[31] Du L Y, Yue J M, Ma J W, et al. Construction of gene engineering bacterium and optimization of fermentation conditions for high production of indigo from tryptophan [J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology Technol, 2017, 17(3): 64⁃72.

[32] 程雷,尹胜,孙宝国,等.高产靛蓝色素大肠杆菌基因工程菌的构建及其发酵条件优化[J].食品科学, 2016, 37(23): 184⁃190.

[33] Cheng L, Yin S, Sun B G, et al. Construction of genetically engineered E. coli and optimization of its fermentation conditions for high⁃level production of indigo [J]. Food Sci, 2016, 37(23): 184⁃190.

[34] Gursky L J, Nikodinovic⁃Runic J, Feenstra K A, et al. In vitro evolution of styrene monooxygenase from Pseudomonas putida CA⁃3 for improved epoxide synthesis [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85(4): 995⁃1004.

[35] Marconi A M, Beltrametti F, Bestetti G, et al. Cloning and characterization of styrene catabolism genes from Pseudomonas fluorescens ST [J]. Appl Environ Microbiol, 1996, 62(1): 121⁃127.

[36] Cheng L, Yin S, Chen M, et al. Enhancing indigo production by over⁃expression of the styrene monooxygenase in Pseudomonas putida [J]. Curr Microbiol, 2016, 73(2): 248⁃254.

[37] Du L, Yue J, Zhu Y, et al. Production of indigo by recombinant Escherichia coli with expression of monooxygenase, tryptophanase, and molecular chaperone [J]. Foods, 2022, 11(14): 2117.

[38] 张旭旺,张强,曲媛媛,等.苯酚羟化酶生物转化吲哚及甲基吲哚研究[J].大连理工大学学报,2013, 53(3): 346⁃353.

[39] Zhang X W, Zhang Q, Qu Y Y, et al. Research on biotransformation of indole and methylindoles by phenol hydroxylase [J]. J Dalian Univ Techno, 2013, 53(3): 346⁃353.

[40] Horinouchi M, Kasuga K, Nojiri H, et al. Cloning and characterization of genes encoding an enzyme which oxidizes dimethyl sulfide in Acinetobacter sp. strain 20B [J]. FEMS Microbiol Lett, 1997, 155(1): 99⁃105.

[41] Doukyu N, Nakano T, Okuyama Y, et al. Isolation of an Acinetobacter sp. ST⁃550 which produces a high level of indigo in a water⁃organic solvent two⁃phase system containing high levels of indole [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2002, 58(4): 543⁃546.

[42] Kim J Y, Kim J⁃K, Lee S O, et al. Multicomponent phenol hydroxylase⁃catalysed formation of hydroxyindoles and dyestuffs from indole and its derivatives [J]. Lett Appl Microbiol, 2005, 41(2): 163⁃168.

[43] Shi S, Ma F, Sun T, et al. Biotransformation of indole to indigo by the whole cells of phenol hydroxylase engineered strain in biphasic systems [J]. Appl Biochem Biotechnol, 2013, 169(4): 1088⁃1097.

[44] 曹湘禹. 苯酚羟化酶基因工程菌合成靛蓝及其同系物的特性研究[D].大连: 大连理工大学,2013.

[45] Cao X Y. Characterization of a novel phenol hydroxylase in indoles biotransformation from a Arthrobacter sp. strain W1 [D]. Dalian: Dalian Univ. Technol., 2013.

[46] Choi H S, Kim J K, Cho E H, et al. A novel flavin⁃containing monooxygenase from Methylophaga sp strain SK1 and its indigo synthesis in Escherichia coli [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 306(4): 930⁃936.

[47] Han G H, Shin H⁃J, Kim S W. Optimization of bio⁃indigo production by recombinant E. coli harboring fmo gene [J]. Enzyme Microb. Technol, 2008, 42(7): 617⁃623.

[48] Singh A, Singh Chauhan N, Thulasiram H V, et al. Identification of two flavin monooxygenases from an effluent treatment plant sludge metagenomic library [J]. Bioresour Technol, 2010, 101(21): 8481⁃8484.

[49] Ameria S P L, Jung H S, Kim H S, et al. Characterization of a flavin⁃containing monooxygenase from Corynebacterium glutamicum and its application to production of indigo and indirubin [J]. Biotechnol Lett, 2015, 37(8): 1637⁃1644.

[50] Kim H S, Cha S H, Suk H Y, et al. Complete genome sequence of indigo⁃producing bacterium Celeribacter sp. strain TSPH2 [J]. Genome Announc, 2017, 5(45): e01124⁃17.

[51] Inoue S, Morita R, Minami Y. An indigo⁃producing plant, Polygonum tinctorium, possesses a flavin⁃containing monooxygenase capable of oxidizing indole [J]. Biochem Bioph Res Co, 2021, 534: 199⁃205.

[52] Kim J, Lee P, Jung E, et al. In vitro characterization of CYP102G4 from Streptomyces cattleya: a self⁃sufficient P450 naturally producing indigo [J]. Biochim Biophys Acta, 2018, 1866(1): 60–67.

[53] Lu Y, Mei L. Co⁃expression of P450 BM3 and glucose dehydrogenase by recombinant Escherichia coli and its application in an NADPH⁃dependent indigo production system [J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2007, 34(3): 247⁃253.

[54] 陆燕. 重组P450 BM3工程菌制备靛蓝过程优化、P450 BM3⁃GDH共表达体系建立及其在靛蓝制备中的应用研究[D].杭州: 浙江大学,2007.

[55] Lu Y. Optimization of indigo preparation process of recombinant P450 BM3 engineering bacteria, establishment of P450 BM3⁃GDH co⁃expression system and its application in indigo preparation [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2007.

[56] Yen K M, Karl M R, Blatt L M, et al. Cloning and characterization of a Pseudomonas mendocina KR1 gene cluster encoding toluene⁃4⁃monooxygenase [J]. J Bacteriol, 1991, 173(17): 5315⁃5327.

[57] Rui L, Reardon K F, Wood T K. Protein engineering of toluene ortho⁃monooxygenase of Burkholderia cepacia G4 for regiospecific hydroxylation of indole to form various indigoid compounds [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 66(4): 422⁃429.

[58] Mermod N, Harayama S, Timmis K N. New route to bacterial production of indigo [J]. Nat Biotechnol, 1986, 4(4): 321⁃324.

[59] Meyer A, Würsten M, Schmid A, et al. Hydroxylation of indole by laboratory⁃evolved 2⁃hydroxybiphenyl 3⁃monooxygenase [J]. J Biol Chem, 2002, 277(37): 34161⁃34167.

[60] 陈健峰,徐天虹,梁谏婷,等.2,4⁃二氯苯酚羟化酶在大肠杆菌中的表达及靛蓝的生物合成[J].药物生物技术,2015, 22(6): 476⁃479.

[61] Chen J F, Xu T H, Liang J T, et al. Cloning and expression of 2,4⁃dichlorophenol hydroxylase and indigo biosynthesis in Escherichia Coli [J]. Pharm Biotechnol, 2015, 22(6): 476⁃479.

[62] Yin H, Chen H, Yan M, et al. Efficient bioproduction of indigo and indirubin by optimizing a novel terpenoid cyclase XiaI in Escherichia coli [J]. ACS Omega, 2021, 6(31): 20569⁃20576.

[63] Torres Pazmino D E, Snajdrova R, Rial D V, et al. Altering the substrate specificity and enantioselectivity of phenylacetone monooxygenase by structure⁃inspired enzyme redesign [J]. Adv Synth Catal, 2007, 349(8⁃9): 1361⁃1368.

[64] Núñez⁃Navarro N, Salazar Muñoz J, Castillo F, et al. Discovery of new phenylacetone monooxygenase variants for the development of substituted indigoids through biocatalysis [J]. Int J Mol Sci, 2022, 23(20): 12544.

[65] Kurkela S, Lehväslaiho H, Palva E T, et al. Cloning, nucleotide sequence and characterization of genes encoding naphthalene dioxygenase of Pseudomonas putida strain NCIB9816 [J]. Gene, 1988, 73(2): 355⁃362.

[66] Boyd C, Larkin M J, Reid K A, et al. Metabolism of naphthalene, 1⁃naphthol, indene, and indole by Rhodococcus sp. strain NCIMB 12038 [J]. Appl Environ Microbiol, 1997, 63(1): 151⁃155.

[67] Dagher F, Déziel E, Lirette P, et al. Comparative study of five polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacterial strains isolated from contaminated soils [J]. Can J Microbiol, 1997, 43(4): 368⁃377.

[68] Pathak H, Madamwar D. Biosynthesis of indigo dye by newly isolated naphthalene⁃degrading strain Pseudomonas sp. HOB1 and its application in dyeing cotton fabric [J]. Appl Biochem Biotechnol, 2010, 160(6): 1616⁃1626.

[69] Mercadal J P R, Isaac P, Siñeriz F, et al. Indigo production by Pseudomonas sp. J26, a marine naphthalene⁃degrading strain [J]. J Basic Microbiol, 2010, 50(3): 290⁃293.

[70] Qu Y, Zhang X, Ma Q, et al. Microbial community dynamics and activity link to indigo production from indole in bioaugmented activated sludge systems [J]. PloS One, 2015, 10(9): e0138455.

[71] Royo J L, Moreno⁃Ruiz E, Cebolla A, et al. Stable long⁃term indigo production by overexpression of dioxygenase genes using a chromosomal integrated cascade expression circuit [J]. J Biotechnol, 2005, 116(2): 113⁃124.

[72] Da Silva M L B, Alvarez P J J. Indole⁃based assay to assess the effect of ethanol on Pseudomonas putida F1 dioxygenase activity [J]. Biodegradation, 2010, 21(3): 425⁃430.

[73] 程雷. Pseudomonas putida B4 中靛蓝色素合成代谢调控机制研究[D]. 北京: 中国农业大学,2016.

[74] Cheng L. Research on the synthetic metabolism and regulation mechanisms of indigo in Pseudomonas putida B4 [D]. Beijing: China Agricultural University, 2016.

[75] Tischler D, Kumpf A, Eggerichs D, et al. Styrene monooxygenases, indole monooxygenases and related flavoproteins applied in bioremediation and biocatalysis [J]. Enzymes, 2020, 47: 399⁃425.

[76] O'Connor K E, Dobson A D, Hartmans S. Indigo formation by microorganisms expressing styrene monooxygenase activity [J]. Appl Environ Microbiol, 1997, 63(11): 4287⁃4291.

[77] Van Hellemond E W, Janssen D B, Fraaije M W. Discovery of a novel styrene monooxygenase originating from the metagenome [J]. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(18): 5832⁃5839.

[78] Shingler V, Franklin F C, Tsuda M, et al. Molecular analysis of a plasmid⁃encoded phenol hydroxylase from Pseudomonas CF600 [J]. J Gen Microbiol, 1989, 135(5): 1083⁃1092.

[79] Doukyu N, Toyoda K, Aono R. Indigo production by Escherichia coli carrying the phenol hydroxylase gene from Acinetobacter sp strain ST⁃550 in a water⁃organic solvent two⁃phase system [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 60(6): 720⁃725.

[80] Gillam E M, Aguinaldo A M, Notley L M, et al. Formation of indigo by recombinant mammalian cytochrome P450 [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1999, 265(2): 469⁃472.

[81] Oppenheim S F, Studts J M, Fox B G, et al. Aromatic hydroxylation catalyzed by toluene 4⁃monooxygenase in organic solvent/aqueous buffer mixtures [J]. Appl Biochem Biotechnol, 2001, 90(3): 187⁃197.

[82] Whited G M, Gibson D T. Toluene⁃4⁃monooxygenase, a three⁃component enzyme system that catalyzes the oxidation of toluene to p⁃cresol in Pseudomonas mendocina KR1 [J]. J Bacteriol, 1991, 173(9): 3010⁃3016.

[83] Pikus J D, Studts J M, Achim C, et al. Recombinant toluene⁃4⁃monooxygenase: catalytic and Mössbauer studies of the purified diiron and rieske components of a four⁃protein complex [J]. Biochemistry, 1996, 35(28): 9106⁃9119.

[84] Studts J M, Mitchell K H, Pikus J D, et al. Optimized expression and purification of toluene 4⁃monooxygenase hydroxylase [J]. Protein Expr Purif, 2000, 20(1): 58⁃65.

[85] McClay K, Boss C, Keresztes I, et al. Mutations of toluene⁃4⁃monooxygenase that alter regiospecificity of indole oxidation and lead to production of novel indigoid pigments [J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(9): 5476⁃5483.

[86] Shaw J P, Harayama S. Purification and characterisation of the NADH:acceptor reductase component of xylene monooxygenase encoded by the TOL plasmid pWW0 of Pseudomonas putida mt⁃2 [J]. Eur J Biochem, 1992, 209(1): 51⁃61.

[87] Sinha R, Shukla P. Current trends in protein engineering: updates and progress [J]. Curr Protein Pept Sci, 2019, 20(5): 398⁃407.

[88] Rao S T, Rossmann M G. Comparison of super⁃secondary structures in proteins [J]. J Mol Biol, 1973, 76(2): 241⁃256.

[89] Lončar N, van Beek H L, Fraaije M W. Structure⁃based redesign of a self⁃sufficient flavin⁃containing monooxygenase towards indigo production [J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(24): 6148.

[90] Sun B Y, Sui H L, Liu Z W, et al. Structure⁃guided engineering of a flavin⁃containing monooxygenase for the efficient production of indirubin [J]. Bioresour, 2022, 9(1): 70.

[91] Malito E, Alfieri A, Fraaije M W, et al. Crystal structure of a Baeyer⁃Villiger monooxygenase [J]. PNAS. 2004, 101(36): 13157⁃13162.

[92] Parra L P, Acevedo J P, Reetz M T. Directed evolution of phenylacetone monooxygenase as an active catalyst for the Baeyer⁃Villiger conversion of cyclohexanone to caprolactone [J]. Biotechnol Bioeng, 2015, 112(7): 1354⁃1364.

[93] Joyce M G, Ekanem I S, Roitel O, et al. The crystal structure of the FAD/NADPH⁃binding domain of flavocytochrome P450 BM3: Crystal structure of the P450 BM3 FAD domain [J]. FEBS J, 2012, 279(9): 1694.

[94] Li Q S, Schwaneberg U, Fischer P, et al. Directed evolution of the fatty⁃acid hydroxylase P450 BM⁃3 into an indole⁃hydroxylating catalyst [J]. Chemistry, 2000, 6(9): 1531⁃1536.

[95] 李红梅. 细胞色素P450 BM⁃3体外定向进化及突变酶性能的研究[D]. 杭州: 浙江大学,2006.

[96] Li H M. In vitro directed evolution and characterization of cytochrome P450 BM⁃3 variants [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2006.

[97] 张彭湃,胡升,黄俊,等.定点突变提高细胞色素P450 BM⁃3吲哚羟基化能力[J].化工学报, 2013, 64(9): 3331⁃3337.

[98] Zhang P P, Hu S, Huang J, et al. Improving indole⁃hydroxylation ability of cytochrome P450 BM⁃3 by site⁃directed mutagenesis [J]. CIESC Journal, 2013, 64(9): 3331⁃3337.

[99] 张彭湃. 面向靛蓝生物制备的细胞色素P450 BM⁃3分子改造[D]. 杭州: 浙江大学,2013.

[100] Zhang P P, Molecular engineering of cytochrome P 450 BM⁃3 for the biosynthesis of indigo [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2013.

[101] Li Y, Lin Y, Wang F, et al. Construction of biocatalysts using the P450 scaffold for the synthesis of indigo from indole [J]. Int J Mol Sci, 2023, 24(3): 2395.

[102] Nakamura K, Martin M V, Guengerich F P. Random mutagenesis of human cytochrome p450 2A6 and screening with indole oxidation products [J]. Arch Biochem Biophys, 2001, 395(1): 25⁃31.

[103] Martin J L. Thioredoxin —a fold for all reasons [J]. Structure, 1995, 3(3): 245–250.

[104] Kanteev M, Bregman⁃Cohen A, Deri B, et al. A crystal structure of 2⁃hydroxybiphenyl 3⁃monooxygenase with bound substrate provides insights into the enzymatic mechanism [J]. BBA Proteins Proteom, 2015, 1854(12): 1906⁃1913.

[105] Meyer A, Schmid A, Held M, et al. Changing the substrate reactivity of 2⁃hydroxybiphenyl 3⁃monooxygenase from Pseudomonas azelaica HBP1 by directed evolution [J]. J Biol Chem, 2002, 277(7): 5575–5582.

[106] DeVore N M, Meneely K M, Bart A G, et al. Structural comparison of cytochromes P450 2A6, 2A13, and 2E1 with pilocarpine [J]. FEBS J, 2012, 279(9): 1621⁃1631.

[107] Ukaegbu U E, Kantz A, Beaton M, et al. Structure and ligand binding properties of the epoxidase component of styrene monooxygenase [J]. Biochemistry, 2010, 49(8): 1678⁃1688.

[108] Bailey L J, McCoy J G, Phillips G N, et al. Structural consequences of effector protein complex formation in a diiron hydroxylase [J]. PNAS, 2008, 105(49): 19194⁃19198.

[109] Linke J A, Rayat A, Ward J M. Production of indigo by recombinant bacteria [J]. Bioresour Bioprocess, 2023, 10(1): 20.

基金资助

国家自然科学基金项目(32170402)

国家自然科学基金项目(81874335)

重点研发计划“中药现代化专项”(2022YFC3501700)

上海市优秀学术带头人计划(23XD1423500)