蜜环菌属真菌CPCC 400891中倍半萜合成酶多样性与功能研究

Diversity and functional research of sesquiterpene synthases in fungus Armillaria mellea CPCC 400891

摘要

本论文以蜜环菌属（Armillaria mellea）真菌CPCC 400891为研究对象，基因组挖掘分析发现该菌株基因组中含有18个倍半萜合成酶编码基因，但其功能却鲜有报道。采用色氨酸营养缺陷型表达载体pYET，并以酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）BJ5464为宿主菌分别表达蜜环菌来源的18个倍半萜合成酶编码基因（Arm_STS1⁃Arm_STS16）。结合气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography⁃mass spectrometer，GC⁃MS）分析平台，对构建的重组菌（BJ⁃Arm_STS1⁃BJ⁃Arm_STS16）发酵产物进行采集分析。结果显示，蜜环菌CPCC 400891来源的12个倍半萜合成酶归属于新的类群：亚家族Ⅳ。同时，10个倍半萜合成酶在酿酒酵母中确定表达。根据美国国家标准与技术研究院（NIST）的标准参考数据库（https：//webbook.nist.gov/）检索比对，共鉴定17个倍半萜（醇）分子，包括α⁃雪松烯、β⁃雪松烯、罗汉柏烯、杜松萜烯、β⁃花柏烯和毕橙茄醇等。GC⁃MS检测分析发现，亚家族Ⅳ类群倍半萜合成酶均能合成多个（种）倍半萜分子。综上所述，本研究为后续改造并优化特定倍半萜合成酶，从而为深入开展STSs的催化机制研究奠定基础，也为从蘑菇类大型真菌中发现更多新颖的倍半萜合成酶提供依据和思考。

Abstract

Genome mining revealed that the genome of Armillaria mellea CPCC 400891 includes eighteen sesquiterpene synthases （STSs） encoding genes， but their functions have been rarely reported. Herein， the eighteen STSs⁃encoding biosynthetic genes （Arm_STS1⁃Arm_STS16） were expressed respectively in heterologous host Saccharomycescerevisiae BJ5464， in which the tryptophan auxotrophic vector pYET served as an expressing plasmid. Eighteen genetically engineered yeast strains （BJ⁃Arm_STS1⁃BJ⁃Arm_STS16） were investigated on gas chromatography⁃mass spectrometer （GC⁃MS） analytic platform. Among eighteen sesquiterpene biosynthetic genes recovered from the genome， twelve derived STSs were categorized into new subfamily diverse clade Ⅳ. Moreover， among eighteen STSs coding genes， ten were successfully expressed in yeast. Based on mass spectrometry analysis with NIST chemistry webbook standard reference database （https：//webbook.nist.gov/）， seventeen sesquiterpenes and sesquiterpene⁃derived alcohols including α⁃himachalene， β⁃himachalene， cis⁃thujopsene， β⁃cadinene， β⁃chamigrene， and β⁃cadinol were identified. Additionally， GC⁃MS analysis revealed that the STSs of group clade Ⅳ could produce several sesquiterpenes. Our report could lay foundation for further optimizing specific sesquiterpene synthases and investigating catalytic mechanism of STSs. This study also provides reference and understandings for mining more new STSs from large fungi mushrooms.

Graphical abstract

关键词

蜜环菌属 / 基因组挖掘 / 倍半萜合成酶 / 异源表达 / 分子系统进化树 / 功能鉴定

Key words

Armillaria / genome mining / sesquiterpene synthase / heterologous expression / phylogenetic tree / functional identification

0 引 言

蜜环菌属真菌〔Armillaria mellea （Vahl. ex Fr.） Quel.〕隶属于担子菌亚门（Basidiomycotina）口蘑科（Tricholomataceae）蜜环菌属（Armillaria）^［1］。蜜环菌又名榛蘑、青冈蕈，是一种药食兼用的高等真菌，广泛分布于世界热带和温带的森林地区。蜜环菌含有特征性化学成分原伊鲁烷（protoilludane）型倍半萜醇芳香酸酯类，以及二萜、甾醇、多糖、黄酮、有机酸、腺苷类等多种类型次级代谢产物^［2］。药理研究表明，蜜环菌发酵物主要具有镇静、催眠、抗惊厥、改善晕眩综合症、保护心脑血管和增强免疫等作用^［3］。1982年从人工发酵的蜜环菌菌丝体中分离得到第一个原伊鲁烷型倍半萜醇芳香酸酯类化合物蜜环菌酯A（melleolide A）^［4］。此后，有学者从蜜环菌菌丝体中分离得到17个同系物，包括蜜环菌甲素（armillarin），蜜环菌戊素（melleolide）和蜜环菌庚素（armillarikin）等^［5，6］。2022年，通过OSMAC（one strain many compounds）激活策略从蜜环菌（A. tabescens） CPCC 401429中分离鉴定14个化合物，其中7个为新化合物，首次从蜜环菌属菌株中分离出armillamides类化合物^［7］。同时，melleolide类杂萜分子具有显著的生物学活性，比如蜜环菌丁素（armillaridin）等能较好地抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）活性^［8~10］，而蜜环菌庚素能抑制人白血病K562、U973、HL⁃60细胞生长并诱导细胞凋亡^{［11，12］}，对人结肠癌HCT⁃116细胞、人急性淋巴白血病细胞、人白血病T细胞和人乳腺癌MCF⁃7细胞具有细胞毒性^［13］。

倍半萜合成酶（STSs）可催化线性的前体法尼基焦磷酸（FPP）合成含15个碳原子的具有链状和环状等结构的萜类化合物^{［14，15］}。倍半萜合成酶引发级联的碳正离子反应、环化和重排反应，从而合成多种骨架新颖的倍半萜分子。同时，这些倍半萜分子又成为微生物天然产物活性分子的重要结构单元，包括毛韧革菌（Stereum hirsutum）中分离的sterhirsutins类^［16］和蜜环菌中分离的melleolides类化合物等^［7］。基因组数据显示，蘑菇类大型真菌含有丰富的倍半萜合成酶编码基因（簇），平均10~20个^［17~19］。针对这些倍半萜合成酶的功能表征也成为近些年天然产物生物合成研究的热点问题，大肠杆菌（Escherichiacoli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）都是常用的表达宿主^{［19，20］}。利用酿酒酵母BJ5464宿主系统，从虎乳灵芝（Lignosus rhinocerotis）中表达杜松烷型倍半萜（+）-torreyol和α⁃cadinol，其中GME3634和GME3638都可以产生多个倍半萜分子^［20］。从柱状田头菇（Agrocybe aegerita）基因组中鉴定出11个倍半萜合成酶编码基因，利用大肠杆菌成功表达9个，其中，Agr6负责原伊鲁烷倍半萜烯的生物合成，Agr2负责viridiflorene/viridiflorol的生物合成，而Agr3，Agr4，Agr8和Agr9可产生多个不同的倍半萜分子^［19］。

依据antiSMASH为基础的生物信息学挖掘显示，该菌株基因组除编码melleolides类杂萜分子的生物合成基因簇外，还携带17个倍半萜合成酶编码基因，表明该菌株倍半萜类化合物的代谢谱可能很丰富并具有化学多样性。为进一步探究这些可能生物合成元件的功能和代谢潜力，本文利用酿酒酵母BJ5464⁃NpgA为宿主菌，对18个STSs编码基因（Arm_STS1⁃Arm_STS16）进行密码子优化并异源表达。结合气相色谱⁃质谱联用分析和NIST标准参考数据库（https：//webbook.nist.gov/）检索比对，对菌株CPCC 400891中倍半萜合成酶（系）的功能、合成倍半萜化合物分子的结构作了初步鉴定和表征。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 材料

蜜环菌菌株（A. mellea） CPCC 400891购自德国微生物菌种保藏管理中心（DSM 373），现保存于中国药学微生物菌种保藏管理中心。大肠杆菌Trans1⁃T1用作基因克隆宿主菌，酿酒酵母BJ5464⁃NpgA用于制备酵母重组和蛋白表达宿主菌。pYET为酵母表达质粒。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）24 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 L，PDB培养基购自美国BD公司）。液体培养基（MEP）：麦芽糖提取物 4 g，黄豆粉0.4 g，去离子水200 mL，1×10⁵ Pa灭菌30 min。LB培养基，YPD培养基，色氨酸营养缺陷型培养基（SD⁃TRP）分别购自索莱宝公司，BD和北京酷来搏技术有限公司。

1.1.2 试剂与仪器

L⁃亮氨酸，尿嘧啶和氨苄霉素等购自Amresco等公司。Q5高保真DNA Taq聚合酶、限制性内切酶Nde I等购自NEB公司。高压灭菌锅（日本Sanyo公司），高速冷冻离心机（美国Thermo公司），7890B/5977A型气相色谱⁃质谱联用仪（GC⁃MS），DB⁃WAX型毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）（美国Agilent公司），SPME萃取头（50/30 μm DVB⁃CAR⁃PDMS）（美国Supelco公司）。胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Axygen公司，Frozen⁃EZ酵母转化试剂盒购自ZYMO公司，酵母质粒提取试剂盒购自索莱宝公司。

菌株与构建基因工程菌见表1。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析与分子系统进化树构建

微生物次级代谢产物合成基因簇预测通过antiSMASH^［22］和Softberry（http：//www.softberry.com/）在线数据库分析。蛋白功能注释用BLAST 程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blastp/）在GenBank蛋白数据库中进行氨基酸序列的同源性搜索。氨基酸序列使用MAFFT v7.471 FFT⁃NS⁃2算法进行多序列比对^［23］，对排后的数据集使用MEGA 7作进一步优化处理^［24］。数据集使用模型搜寻软件ModelFinder^［25］进行系统发育最佳模型选择（基于AIC标准）。经计算氨基酸序列的最佳进化模型为vt+GAMMA+I。MrBayes v3.2.6^［26］用于数据集的系统发育分析，运行代数设置为10000000，采样频率设置为100，热链温度设置为0.2，其余参数为默认值，当聚合诊断值少于0.01时视为达到聚合点停止运算。所有采样树的前25%视为burn⁃in fraction。生成的贝叶斯树使用FigTree v1.4.4软件（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）可视化并在Adobe Illustrator作进一步编辑。

1.2.2 基因组gDNA提取

将菌株接种于含100 mL PDB液体培养基中，28 °C，200 r/min的摇床上培养3 d。过滤出菌丝体，再用无菌水洗涤1~2次，用灭菌的滤纸包住放置晾干。称取0.1 g菌丝体，在液氮中研磨，分装于1.5 mL离心管中，加入700 µL LETS基因组提取缓冲液（0.1 mol/L LiCl，20 mmol/L EDTA pH 8.0，10 mmol/L Tris⁃HCl pH 8.0，0.5% SDS）^［27］，50 °C水浴中保温10 min。加入Tris饱和酚与氯仿各300 µL，充分混匀，静置5 min，12 000 r/min离心10 min吸取上清500 µL，加入等体积的异丙醇混匀，12 000 r/min离心5 min，用75%乙醇洗涤一次。12 000 r/min离心2 min，弃上清，晾干后加入50 µL去离子水，加入1 µL RNase（10 mg/mL），37 °C保温20 min，0.8%的琼脂糖电泳检测。

1.2.3 基因合成、PCR扩增，克隆与测序

倍半萜合成酶编码STSs基因密码子优化与基因合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。PCR扩增体系为50 µL：Phanta^®高保真聚合酶（诺维赞）0.5 µL，5×SF缓冲液 10µL，dNTP Mix 2 µL，引物各2 µL，质粒模板2 µL，去离子水31.5 µL。1%琼脂糖凝胶电泳检测，切目的条带，用胶回收试剂盒回收PCR基因片段。菌落PCR筛选阳性克隆子送至生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.4 酵母感受态制备、转化和质粒提取

将酵母细胞划线接种于YPD平板上（2%琼脂粉），保温箱30 °C培养。挑单菌落接种于YPD液体培养基中，30 °C，250 r/min摇床过夜培养。将上述菌液接种到10 mL的YPD培养基中，调整OD_{600 nm}至0.2~0.4，30 °C，250 r/min振荡培养OD_{600 nm}至0.6~1.0，1 000 r/min，5 min离心收集菌体，加入10 mL的Solution I重悬酵母细胞，重复离心步骤，加入1 mL的Solution II重悬细胞，并分装至1.5 mL离心管中，-80 °C保存。将PCR回收产物10 µL、线性化载体pYET 5 µL加入酿酒酵母感受态细胞中，加入500 µL的Solution Ⅲ，涡悬混匀，30 °C孵育1 h，期间涡悬1~3次。将上述菌液涂布色氨酸营养缺陷型（Trp^-）培养平板上，30 °C培养过夜。酵母质粒提取操作步骤详见说明书。

1.2.5 菌株发酵

将对照菌株BJ⁃YET和重组菌BJ⁃Arm_STS1⁃BJ⁃Arm_STS 16接种于SD⁃TRP营养缺陷型培养基，28 °C培养箱培养至72 h。将重组菌和对照菌株分别接种于10 mL的SD⁃TRP营养缺陷型液体培养基30 °C，振荡培养48 h得到种子液（200 r/min）。取种子液5 mL加入到灭菌后的YPD液体培养基中，30 °C，200 r/min振荡培养4 d。

1.2.6 样品处理与GC⁃MS上样分析

发酵完成后，准确称量5.0 g样品，置于20 mL顶空瓶中，55 ℃平衡15 min，使用SPME萃取头在55 ℃萃取40 min。GC⁃MS分析由北京工商大学食品风味化学重点实验室7890B/5977A型GC⁃MS联用仪平台完成。

气相条件：萃取纤维插入GC进样口，250 ℃条件下解析5 min。升温程序为起始温度50 ℃，保持5min后，以3 ℃/min的速率升温至90 ℃，以2 ℃/min的速率升温至150 ℃，再以8 ℃/min的速率升温至230 ℃。后运行温度为230 ℃，时间为5 min。

质谱条件：采用EI离子源和70 eV的电子能量，传输线温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，溶剂延迟6 min，全扫描模式，质量扫描范围m/z为50~350 amu。

2 结果与分析

2.1 倍半萜合成酶编码基因挖掘及生物信息学分析

AntiSMASH数据库可用作微生物天然产物生物合成基因簇查询和预测^［22］。对蜜环菌CPCC 400891的基因组分析发现，目标菌株共含有29个生物合成基因簇，包括聚酮类4个，非核糖体多肽类7个，萜类15个，杂萜类1个和其他类5个。进一步结合本地BLAST分析，共获得18个倍半萜生物合成基因（簇）。如图1所示，这些基因（簇）类型包含两种情况：①倍半萜合成酶编码基因单独存在，如Arm_STS1，Arm_STS2，Arm_STS8，Arm_STS9，Arm_STS11等；②倍半萜合成酶编码基因与其他基因连锁成簇，比如Arm_STS3，Arm_STS4，Arm_STS14，Arm_STS15等。其中，Arm_STS15与P450氧化酶、短链脱氢酶和聚酮合成酶等编码基因连锁，共同负责杂萜melleolides类化合物的生物合成（图1）。

2.2 倍半萜合成酶分子系统进化树构建

为明确蜜环菌CPCC 400891基因组STSs编码基因（Arm_STS1⁃Arm_STS16，accession no. OQ183210⁃OQ183227）编码倍半萜合成酶的进化关系和地位归属，我们构建了STSs的分子系统进化树。从JGI（https：//genome.jgi.doe.gov/）和GenBank数据库中下载同源倍半萜合成酶序列。STSs序列来自于包括斜盖菇属真菌（Clitopilus pseudopinsitus）、荧光类脐菇（Omphalotus olearius）、柱状田头菇、茶树菇（Agrocybe aegerita）、凹痕粉孢革菌（Coniophora puteana）、灰盖拟鬼伞（Coprinopsis cinerea）、褐腐菌（Postia placenta）、虎乳灵芝、毛韧革菌、蚁巢伞属菌（Termitoymces sp.）、松根异担孔菌（Heterobasidion annosum）、砖红韧黑伞（Hypholoma sublateritium）、红缘拟层孔菌（Fomitopsis pinicola）和高卢蜜环菌（A. gallica）等担子菌纲真菌。分子系统进化树如图2所示，蜜环菌CPCC 400891的倍半萜合成酶大致分为3个亚类：①Arm_STS15负责合成Δ6⁃原伊鲁烷倍半萜烯，与蜜环菌来源的Pro1聚为一支，编码基因arm_STS15为melleolides类化合物生物合成基因簇的重要结构基因。②Arm_STS2，Arm_STS3，Arm_STS5，Arm_STS16可能负责合成衣兰油烯（γ⁃muurolene）/杜松萜烯（β⁃cadinene）类倍半萜分子的生物合成，该类亚家族倍半萜合成酶可能负责多种倍半萜分子的生物合成，如茶树菇来源的Agr8和Agr9可能生成衣兰油烯，杜松萜烯和β⁃selinene等^［19］。③包括Arm_STS4和Arm_STS6等12个倍半萜合成酶归属于亚家族IV，该亚家族倍半萜合成酶目前报道比较少^［19］。因此，对该亚家族倍半萜合成酶功能的研究也更有意义。

2.3 倍半萜合成酶功能鉴定和产物分析

将18株蜜环菌来源的倍半萜合成酶重组菌（BJ⁃Arm_STS1⁃BJ⁃Arm_STS16）和1株对照菌（BJ⁃CK）分别接种于SD⁃TRP营养缺陷型培养基和YPD发酵培养基培养后，样品经GC⁃MS分析。通过样品的质谱图和相关信息，就可以得到样品的定性定量结果。结果表明，有10株重组菌能够检测到分子量［m/z=204， C₁₅H₂₄］、［m/z=222， C₁₅H₂₆O］或［m/z=202， C₁₅H₂₂］，包括BJ⁃Arm_STS3，BJ⁃Arm_STS5，BJ⁃Arm_STS8，BJ⁃Arm_STS9，BJ⁃Arm_STS10，BJ⁃Arm_STS12，BJ⁃Arm_STS14a，BJ⁃Arm_STS14b，BJ⁃Arm_STS15和BJ⁃Arm_STS16（表2）。同时，另外8株重组菌和对照菌均未能检测到相关分子量，说明蜜环菌来源的10个倍半萜合成酶可在酿酒酵母宿主菌中表达成功，10株重组菌共检测到17种倍半萜分子，包括雪松烯（α⁃himachalene和β⁃himachalene）、罗汉柏烯（cis⁃thujopsene）、原伊鲁烷倍半萜烯（Δ6⁃protoilludene）、β⁃榄香烯（β⁃elemene）、杜松萜烯（β⁃cadinene）、β⁃花柏烯（β⁃chamigrene）、古巴烯（β⁃copaene）和甘香烯（elixene）等。同时，GC⁃MS也检测到韦得醇（widdrol）、毕橙茄醇（β⁃cadinol）和顺⁃Z⁃α⁃环氧化红没药烯（cis⁃Z⁃α⁃bisabolene epoxide）和花侧柏烯（+）⁃cuparene等（图3）。利用酿酒酵母对虎乳灵芝中倍半萜合成酶GME3638异源表达也检测到榧烯醇和毕橙茄醇的存在^［20］，说明宿主细胞酿酒酵母中内源的细胞色素P450等氧化酶可能会对前体倍半萜分子（C₁₅H₂₄）进一步催化，从而生成韦得醇、毕橙茄醇和花侧柏烯等化合物。

如表2所示，重组菌BJ⁃Arm_STS3和BJ-Arm_STS16产生α⁃雪松烯，BJ⁃Arm_STS8发酵产生β⁃雪松烯。BJ⁃Arm_STS5发酵主产物为β⁃雪松烯（45.57%），同时，Arm5也能合成少量的甘香烯和β⁃花柏烯（图4A）。重组菌BJ⁃Arm15除合成原伊鲁烷倍半萜烯外，仍能合成少量罗汉柏烯和β⁃古巴烯。有意思的是，属于倍半萜合成酶IV亚家族的Arm_STS9，Arm_STS 10，Arm_STS12，Arm_STS14a和Arm_STS14b在酿酒酵母宿主系统中也表达，该亚家族的STSs的代谢产物更加复杂，一般3~6种倍半萜化合物。比如重组菌BJ-Arm_STS12发酵主产物为罗汉柏烯（72.46%），还产生较大量的β雪松烯（17.85%）和少量的菖蒲二烯（acoradiene）、雪松烯cedrene⁃V6和α⁃雪松烯（图4B~4D）。重组菌BJ⁃Arm_STS14b可发酵产生花侧柏烯、α⁃雪松烯、β⁃雪松烯、4，10⁃二甲基⁃7⁃异丙基⁃双环［4.4.0］⁃1，4⁃癸间二烯和韦得醇等。因此，该亚家族倍半萜合成酶的功能更复杂，可能蕴含新颖的酶学催化机制。

3 讨 论

本研究利用基因挖掘策略、酿酒酵母异源表达系统、GC⁃MS检测和NIST数据库检索技术对蜜环菌CPCC 400891基因组倍半萜合成酶（STSs）编码基因进行功能鉴定，成功表达10个，其中多个STSs的代谢产物为多个（种）倍半萜分子。截至目前，国际上多个研究团队已成功通过大肠杆菌或酿酒酵母宿主系统，将斜盖菇属真菌，荧光类脐菇，凹痕粉孢革菌，褐腐菌，虎乳灵芝和柱状田头菇中部分STSs成功表达^{［18~20， 28，29］}。随着分子生物学与测序技术的发展，担子菌纲中数量众多的大型真菌的基因组测序完成并公布，基因组数据分析表明目前只有很少的基因簇编码的代谢产物能够确定，而大多数基因（簇）在实验室条件下处于“沉默”状态，其所编码的天然产物“暗物质”是正待开发的巨大宝藏^{［30，31］}。随着担子菌纲中功能鉴定的STSs数量不断增加，作为在次级代谢过程中扮演重要角色的倍半萜合成酶（系）在大型真菌生命过程中具有哪些生态功能？哪些机制控制STSs的功能进化？STSs是局限于特定的类群还是广泛分布等？回答这些问题需要对大量的倍半萜合成酶进行功能表征。

微生物天然产物已被证明是新药发现和药物创新的源泉。作为21世纪生命医学领域催动原创突破和学科融合的前沿学科，合成生物学的崛起可突破天然药物发现的瓶颈，通过设计新的生物合成途径，从而助力药物研发。因此，合成生物学技术的发展迫切需要对更多生物合成元件的挖掘、筛选和定向进化，针对特定产物倍半萜合成酶的生物信息挖掘分析和功能预测将有助于获取理想的候选合成元件。由于大多数担子菌纲真菌在遗传转化上难以操作，因此需要开发异源表达系统进行蛋白表达和化合物生物合成途径重建^［32~36］。采用酵母宿主细胞对倍半萜合成酶的生物学功能进行系统研究，可丰富倍半萜合成酶功能信息数据库及萜类化学分子库，为后续萜类的合成生物学研究提供丰富的功能元件。本研究首次利用酿酒酵母异源表达系统通过对蜜环菌属来源的倍半萜合成酶做功能研究，表明蜜环菌属来源的倍半萜合成酶（系）多归属于亚家族Ⅳ。该类群倍半萜合成酶报道较少，属于新的类群。我们对蜜环菌来源的STSs的研究丰富了STSs中该亚家族倍半萜合成酶（系）的数量。同时，该类群倍半萜合成酶（如Arm_STS12，Arm_STS14b等）功能复合新颖，均能合成多个（种）倍半萜分子。这也为我们后续借助代谢工程策略优化特定STSs，为深入开展STSs的生物学功能和催化机制的研究奠定基础。

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基金资助

国家自然科学基金(31872617)

中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2021-I2M-1-055)

中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2019-I2M-1-005)

北京协和医学院基本科研业务费(3332018097)