大蒜内生菌对植物病害防治的研究进展

Research progress of garlic endophytes for plant disease control

摘要

大蒜以其杀菌抑菌作用闻名，研究发现其体内也富含微生物资源，这些微生物的存在对大蒜的功效有重要影响。大蒜内生菌通过自身含有的胞外多糖或者分泌的抗生素等物质可以直接或间接遏制病原微生物的产生，诱导植物产生系统抗性，减少植物病害的发生。本文就植物内生菌的来源、大蒜内生菌的分离与鉴定以及大蒜内生菌对植物病害影响等方面，阐述大蒜内生菌在防治植物病害方面的研究成果。同时，对大蒜内生菌在植物病害生物防治中的应用前景及存在的问题进行了讨论，以期为大蒜内生菌资源的开发利用提供参考。

Abstract

Garlic is known for its bactericidal and bacteriostatic properties. Studies have found that garlic is also rich in microorganisms， which play an important role in the efficacy of garlic. The endophytic bacteria of garlic can inhibit the pathogenic microorganisms directly and indirectly， induce the system to produce resistance and reduce the occurrence of plant diseases through the exopolysaccharides or secreted antibiotics and other substances. In this paper， the source of endophytes in plants， the isolation， identification and the effects of endophytes in garlic on plant diseases are discussed. At the same time， the application prospect and existing problems of garlic endophytes in plant disease biological control are discussed in order to provide reference for the development and utilization of garlic endophyte resources.

关键词

大蒜 / 内生菌 / 植物病害 / 生物防治

Key words

garlic / endophyte / plant disease / biological control

0 引 言

植物病害是影响农作物稳定高产的主要原因之一，如小麦条锈病对小麦叶片和叶鞘的损伤使得小麦减产40%，甚至绝产^［1］。目前，针对植物病害采取的防治手段还是以化学方法为主，但化学方法存在许多弊端，不但污染环境，而且也会危及人类的身体健康。因此，寻找无污染、绿色安全的生物防治方法成为当前人们的研究热点。近年来，人们发现植物体中含有丰富的内生细菌，已从大蒜^［2］、柑橘^［3］、小麦^［4］、柠檬^［5］、花生^［6］、水稻^［7］、棉花^［8］、红豆杉^［9］、番茄^［10］、马铃薯^［11］等50多种植物体内分离鉴定出多个属的内生菌，几乎所有健康植物体内均含有内生菌^［12］。这些内生菌在植物体内的特殊环境中存活，在不断演化的过程中与寄主形成了互惠共生的良好关系，且有研究表明，感染了内生菌的植株与未感染植株相比，更具抗逆、抗胁迫、抗病害等优势，生存能力也更顽强^［13］。大蒜不同于其他普通蔬菜，其鳞茎有药用价值，食用可助消化，刺激食欲，具有良好的生物活性、保健效果和药用价值。大蒜除作为烹饪调味品外，还常被用于医药领域。古时就有记载，大蒜可以祛风利尿、消渴止血^［14］。现代研究表明，大蒜还具有抗菌、抗病毒^［15］、抗氧化^［16］、抗衰老^［17］等多种功效。大蒜因其药用特性和抗微生物活性被广泛关注^［18~20］，因其体内含硫化合物的存在，能够抗菌消炎，抑制和杀灭多种细菌、真菌和病毒^［21~24］。因此，人们常称大蒜为天然广谱植物抗菌药。大蒜内生菌能产生抑菌活性物质，抗菌活性高、抗菌谱广，能引起植物的抗感染免疫反应，在植物生长和抗病方面有裨益^［25］。目前，全球针对大蒜抗菌相关的研究大多停留在对大蒜提取物的研究上，而涉及到大蒜内生菌方面的研究不多，针对大蒜内生菌对植物病害防治的研究进展也缓慢。本文就植物内生菌的来源、大蒜内生菌的分离与鉴定以及大蒜内生菌对植物病害防治作用等方面进行了总结和讨论，以期为大蒜内生菌资源的开发与利用提供一定的参考。

1 植物内生菌的来源

1.1 植物内生菌的分类

内生菌（endophyte）是指在健康植物组织内存在且对宿主植物不产生明显的感染症状的微生物，主要有细菌、真菌和放线菌^{［26，27］}。有研究表明，几乎植物的所有组织包括根、茎、叶、花、果实和种子等都发现有内生菌的存在。目前，农业上对小麦^［4］、水稻^［7］、棉花^［8］、玉米^［28］、甜菜^［29］等植物体内的内生菌研究较多，这些内生菌在固氮、促进生长以及抗病、抗虫害等方面对宿主植物有裨益^［30］。目前，地球上发现有超过40万种^［31］植物，由于植物内生菌与植物之间存在专一性。地球上的内生菌大概有100万种，但现在只有不到十分之一的植物内生菌被发现并记录在册^［32］，对植物内生菌进行深入研究任务繁重且艰辛。

1.2 植物内生菌的传播方式

植物内生菌的传播方式主要有三种^［32］。第一种是垂直传播，相同种属的植物经种子传播；第二种是水平传播，外界微生物经由植物细胞纤维素的降解活动进入到宿主细胞体内；第三种方式是通过植物根部的缝隙进入到植物内，两者之间互惠互利，协同共生，形成了共赢的局面，并且这种局面使得植物的抗逆能力^［33~36］得到了提升。

1.3 植物病害的生物防治机制

① 分泌代谢产物：植物内生菌通过代谢活动会分泌出抗生素类^［37］、生物碱类^［38］、水解酶类^［39］等活性物质，这些物质对致病菌具有抵抗作用。

② 竞争生存空间：内生菌处于植物内部或者植物附近的环境时，会与病原菌抢夺生存空间，影响了病原菌的正常生命活动，在一定程度上减轻病原菌对植物的威胁。而相处在同一生存空间时，内生菌也会争夺病原菌的养分，病原菌得不到充分的营养物质，生长速度减慢或停滞不前从而引起死亡。

③ 促进生长，间接促进抗病：植物内生菌对于调节植物的生长、抑菌等有较大影响^［40］。有研究者在研究银杏内生菌的抑菌活性实验中提到，银杏很少发生病害的原因与其体内存在具有抑菌活性的内生菌有关^［41］。内生菌和宿主植物长期共生期间，其对植物的生长起促进作用，会促进植物体分泌如赤霉素、植物生长素等调节因子来调节植物的生长，从而让植物的生长处于更好的趋势。

2 大蒜内生菌的研究现状

2.1 大蒜的历史

大蒜（garlic）别名独蒜、胡蒜、独头蒜，是百合科（Liliaceae）葱属（Allium L.）草本植物，多年生，可形成鳞茎，鳞茎被称作蒜头，就是一般所说的大蒜。大蒜形状扁球形、圆锥形，外表皮以灰白色为主，里面还有一层鳞皮，剥去表皮，里面一般有6~10个蒜瓣，一个紧靠一个，呈轮盘形状，底部有很多须根。我国种植大蒜的历史悠久，是世界上种植大蒜的第一大国，年种植面积超53万hm²，占全球50%以上^［42］。

大蒜有浓郁的气味，生吃会感到辛辣，虽作为辅料，但其营养价值和食疗保健功能备受青睐^［43］。大蒜除有多种矿物质、维生素及氨基酸等营养成分外^［44］，还含有含硫化合物等化学成分^［45］。有研究表明，与韭菜油提取物相比，大蒜油具有更强的抗真菌活性，对白色念珠菌（Candida albicans）具有最大抑制区（13.50 mm）、最小抑菌浓度（MIC）（0.40 μg/mL）和最小杀菌浓度（MFC）（0.75 μg/mL）。因此，大蒜鳞茎的油提取物表现出显著的生物活性，可用作药物和保健品成分的来源^［46］。

2.2 大蒜内生菌的分离与鉴定

科学家们对大蒜能够抗菌杀菌的来源进行了探索，发现大蒜内除了有许多活性物质外，还有丰富的内生菌资源。近年来的一些研究成果表明，从大蒜中提取出来的物质能抑制和杀死多种常见的革兰氏阳性和阴性菌^［47］。从大蒜鳞茎中分离得到19株内生细菌，无放线菌和真菌。19株均为杆菌，其中7株为革兰氏阳性菌，12株为革兰氏阴性菌。他们分别进行以番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）等5种病原真菌为靶标菌和以枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）等5株病原细菌为靶标菌的拮抗作用测定，发现这19株内生细菌对病原真菌或细菌均有广谱抗菌作用^［48］。为了进一步探索大蒜的生物防治应用，又有研究学者对广西产的大蒜鳞茎进行了研究，从中分离出28株有效内生菌，多为细菌，说明大蒜中也存在放线菌和真菌，其中5株内生细菌的代谢产物对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）有较好的抑菌作用^［49］。以常规分离培养方法对黑蒜加工过程中大蒜总菌和内生菌的数量变化规律进行了研究^［50］，发现大蒜表面及内部没有严格意义的真菌存在，但有大量的好氧和厌氧菌。而在一项筛选大蒜产香内生菌的研究中，有学者分离纯化得到了一株有苹果香味的内生真菌，对这株真菌进行了ITS序列分析，鉴定其为白地霉菌（Geotrichum candidum Link）^{［2，51，52］}。

为得到更多大蒜内生菌的基本信息，给植物病虫害的生物防治提供新的菌种资源，研究者们从来自江苏徐州、山东金乡等10个不同地区、不同品种的大蒜蒜瓣中成功分离出102株大蒜内生菌，其中细菌92株，主要为芽胞杆菌属（Bacillus Cohn）和假单胞菌属（Pseudomonas）；真菌3株，都是霉菌；放线菌7株。通过抑菌活性实验发现，其中有19株内生菌对至少5种病原真菌有拮抗作用，而有一种菌株的拮抗性最强，对白腐小核菌（Sclerotium cepivorum）的抑菌率达到90.24%，对其他病原菌的抑制率均在70%左右^［53］。以上研究结果表明，大蒜内生菌多为细菌，芽胞杆菌属占绝大部分，也说明了大蒜内生细菌和放线菌对多种植物病原真菌的生长有抑制作用，具有很好的生防潜力。

3 大蒜内生菌对植物病害防治的研究现状

3.1 大蒜内生细菌对植物病害的防治

采用传统培养法对大蒜及黑蒜内生菌进行分离鉴定时发现，内生细菌中枯草芽胞杆菌、甲基营养芽胞杆菌（Bacillus methylotrophicus）、解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是大蒜的优势菌^［54］。大蒜内所含有的枯草芽胞杆菌可以合成脂肽类抗生素、风菌素、枯草菌表面活性剂等，这些物质可以直接抑制多种病原真菌的合成，保护植物免受侵袭^［55］。而芽胞杆菌因其繁殖快、分布广、抗逆性高、生命力顽强且具有抑菌作用而受到从事生物防治工作的研究者们的关注^{［56，57］}。其中枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）这三类芽胞杆菌是当前生防芽胞杆菌的主要研究对象。解淀粉芽胞杆菌可以通过分泌多种抗菌物质对植物病虫害进行防治^［58］。白地霉菌液和解淀粉芽胞杆菌菌液混合后对黄瓜枯萎病的防治效果达50.2%^［59］。此外，生防芽胞杆菌还可以被用来防治农业上的棉花黄萎病。目前，已研发出枯草芽胞杆菌可湿性粉剂，只需在播种前使用该药品拌种，防效可达80%^［60］。芽胞杆菌在防治细菌病害如黄瓜细菌性角斑病、番茄青枯病方面也有效果^［61］。在防治大蒜白腐病的研究^［62］中，研究者们从大蒜健康球茎内分离出了35株内生菌，其对大蒜白腐病起到抑制作用，降低了菌丝的生长，在体外形成了抑制区；其以14株鲁氏不动杆菌（Acinetobacte）为主，其次是8株暹罗芽胞杆菌（Bacillus siamensis）、2株枯草芽胞杆菌、2株铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、3株贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）和1株沙福芽胞杆菌（Bacillus safensis）。其中有16株大蒜内生菌的抑制率超过了50%，5株的抑制率小于25%。大蒜内生细菌在植物体内长期稳定定殖并传导，不易受外界环境条件的干扰，并能抵御病虫侵袭，是宝贵的天然生物资源。而在一项研究中，研究者们利用从大蒜（葱属）中分离的假单胞菌株，介导合成了银纳米颗粒（AgNPs），抑制了小麦头枯萎病^［63］。研究发现，AgNPs对小麦镰刀菌（Fusarium sp.）菌丝生长的抑制作用随着浓度的增加而增加，抑制了孢子的萌发和芽管的生长，且AgNPs的存在会使小麦镰刀菌菌丝表现出异常结构；AgNPs的浓度越高，菌体内DNA和蛋白质的泄漏越加剧。研究首次进行了AgNPs的生物合成。生物合成的AgNPs对小麦头疫病病原菌具有较强的抗真菌活性。这可能部分归因于它们抑制孢子萌发、芽管生长、霉菌毒素的产生和细胞膜的损伤。合成的AgNPs可以使小麦植株不受真菌侵染，具有巨大的保护潜力。虽然大蒜内生细菌对引起植物病害的病原菌的防治机制还有待进一步探索，但从目前已有的研究结果推测，大部分的大蒜内生细菌是通过自身合成的脂肽类抗生素、风菌素、枯草菌表面活性剂等物质，直接抑制多种病原真菌的合成。因此，其在保护植物不受病害侵袭方面有巨大的发展潜能。随着人们对自然环境保护意识的不断加强及现代农业逐步向生态型农业发展，未来用大蒜内生细菌替代化肥和农药来防治植物病虫害，既保持了植物微生态系统的生物多样性，又实现了农业的可持续发展。

3.2 大蒜内生真菌对植物病害的防治

在一项关于1株大蒜内生真菌的分离鉴定及抗病原真菌活性的研究中^［2］，曾分离得到一株白地霉菌，它能抑制大蒜白腐小核菌，进一步研究发现，是因为其胞外多糖具有抑菌效果。从大蒜蒜瓣中分离出3株真菌^［53］，其中的淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）能够通过侵染线虫的卵及幼虫来降低南方根结线虫90%的孵化率^［64］。目前，淡紫拟青霉已经被用于蔬菜、香蕉等多种植物线虫病害的防治。目前，我们对于大蒜内生真菌对植物病害的生防机制还知之甚少，大胆设想或许从已知的胞外多糖的独特抑菌功效着手研究新型的生物防治方法去解决农业的病虫害问题，不失为一个有研究潜力的方向，希望未来科研学者们能对大蒜体内的真菌资源进行更深层的研究，并将它们应用于植物病害的防治研究中，减少使用化学手段防治对环境造成的影响。

3.3 大蒜内生放线菌对植物病害的防治

放线菌作为宝贵的微生物资源，是天然抗生素等生物活性物质的主要生产菌，生防放线菌中含有链霉素、阿维菌素、伊维菌素、春雷霉素和井冈霉素等。有研究发现，它们在农业病虫害的防治中占有重要地位^［65］。放线菌一般通过两种途径对致病菌发挥生防作用，一种是在寄主植物组织内诱发其产生抗性或产生抑菌物质，从而影响病原菌的生长繁殖，最后致其死亡；另一种是通过竞争、捕食和寄生作用，降低病原菌的致病性、侵染效率，导致病原体的致病性下降^［66］。在一项对6株生防放线菌的生物学习性及防病抑菌作用的研究中发现^［67］，其中有4株放线菌菌株的发酵液对苹果灰霉病的控制作用超过80%，但它们的菌悬液控制效果普遍较差，关于这几株放线菌具体的抑菌机制仍需更深入的探索。研究者推测，这几株放线菌是通过活体竞争来抑制病原菌。很多放线菌，尤其是链霉菌（Streptomyces），已被报道用于生物防治黄瓜枯萎病^［68］、马铃薯疮痂病^［69］、番茄枯萎病^［70］、香蕉枯萎病^［71］等。一些生防链霉菌可通过产生异丙托品（isatropolone C）的抗生素有效防治马铃薯疮痂病的发生^［72］。由禾顶囊壳小麦变种侵染引起的小麦全蚀病，对小麦的生产造成了威胁，而生防放线菌（Actinomycetes）可使小麦全蚀病发病率减少70%以上^［73］。在大蒜健康球茎中也分离出3株罗氏链霉菌（S. rochei）、1株黄绿链霉菌（S. flavoviridis）和1株西塘链霉菌（S. setonii），可以抑制大蒜白腐病病原体菌丝的生长，降低大蒜白腐病的发病率，且抑制率都超过19%^［62］。目前，对于大蒜放线菌在生防植物病害方面的具体作用机制依旧处于探索阶段，只有一些研究结果让我们了解到，大蒜放线菌可能通过寄生于病原体或者与病原体竞争影响病原体菌丝的正常生长来抑制它们对植物的侵袭，但更多的支撑性证据仍有待发现。虽然针对大蒜内生放线菌防治植物病害的研究开展缓慢，但转基因技术的发展给生防大蒜内生放线菌带来了发展机会，前人对其他生防放线菌的多项研究表明，从生防制剂入手开展对大蒜内生放线菌的研究，未来可能对农业病害防治和环境保护起重要作用。

4 展 望

对植物病害的防治，目前主要采用的方法还是以喷洒灌溉农药为主的化学手段，对大多数的农业生产来说，这种方法既经济实惠，又见效快。但产生的副作用也很明显，要付出生态环境被破坏的代价。植物内生菌资源丰富且宝贵，不仅可以通过调节植物体内激素含量加快宿主生长速度，还降低了植物病变程度，有利于减少化学试剂对生态环境的污染风险，对全球农业可持续性发展起到推动作用。植物内生菌可以利用生态位竞争或营养竞争、产生诱导抗性抑制病原菌感染，或者合成抗生素类、生物碱类、几丁质类等次生代谢产物抑制病原菌生长，从而防治病虫害。因此，有些研究者认为，利用天然资源中的活性物质取代化学农药进行作物保护的思路已经成为现代研究方向之一^［74］。内生菌与植物存在互惠互利的关系，从植物本身入手，无论是防治植物病害还是保护生态，寻找和开发可以抑制植物病害的新型抑制剂具有重大意义^［75］。随着培养技术的进步，可培养微生物的种类和比例不断提高，将为微生物组和植物功能共生体的种群结构、动态演替和功能研究提供便利。过去几十年，虽然研究者们对不同内生植物的抑菌特性和鉴定做了大量研究，但在开发利用上还存在不足，主要表现在以下几个方面：① 大量的稀有内生抑菌微生物资源有待挖掘，因无法完全复制微生物生长的自然环境条件和其特殊的选择性等缺陷，仍然有大部分内生菌不能或未被培养；② 对有效的抑菌菌株尚未实现其活性代谢产物的工业化生产；③ 分子机制研究还不够深入，现阶段植物内生菌的研究主要停留在组织分离纯化、种属鉴定、次生代谢产物鉴定等阶段，而在内生菌的侵染定殖途径、抗病害机制、抗耐药机制以及宿主与内生菌互作分子机制等方面研究较少。未来研究可将重点放在如何利用可培养的物种建立模型以便更有效地揭示不可培养微生物的功能；搞清楚内生菌与附生菌物质流、信息流和能量流对寄主植物的影响以及寄主植物对这些微生物种群结构的调控机制等。

大蒜在防治植物病虫害方面越来越受关注，科学家们通过使用新的研究思路和技术手段，不断发现越来越多的大蒜内生菌资源，如何利用这些内生菌资源指导实际生产将成为应用的重点。多项研究也揭示了大蒜内生菌能有效减轻真菌、细菌等引起的病害对植物的影响，促进植物的健康生长，提高农作物产量，推动农业发展。但同时也存在一些有待解决的问题，虽然已经有如“百抗”^［76］、“麦丰宁”^［77］一类的生物杀菌剂被推广应用，但这些产品也存在着有效期短、见效慢、易受环境影响等缺点。因此，将生物制剂与化学农药复配来防治植物病害的方法也是一条新思路。然而，相比发达国家，中国在大蒜内生菌方面的研究和应用还处于初步发展阶段，尤其是生防大蒜内生菌的作用机制和应用技术方面还需进一步探讨，对大蒜内生菌基因组学和蛋白组学的研究有待加深，产业开发也处于待发展阶段，希望未来在充分揭示功能共生体的基础上，借助人工智能和信息技术探索大蒜内生菌对寄主的影响，以期在农作物育种计划中设计促进植物健康生长、资源利用效率更高的功能共生体，从而充分发挥大蒜内生菌的功能，减少化学品投入和温室气体排放，实现农业的可持续发展，相信大蒜内生菌在生态型农业的应用前景会越来越广阔。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31801720)

产学研联合研发项目B类(KC21343)