青霉素G酰化酶工业进化的研究进展

Research progress in the industrial evolution of penicillin G acylase

摘要

青霉素G酰化酶是近几十年来β内酰胺类抗生素领域应用最广、开发最成功的酶之一。伴随着β⁃内酰胺类抗生素由化学合成法变更为酶法在中国的大规模产业化，得到了充分的开发与应用，取得了成功。青霉素G酰化酶不但用于水解制备6⁃APA、7⁃ADCA，更重要的是用于氨苄西林、头孢氨苄、阿莫西林、头孢拉定、头孢克洛等抗生素的制备。本文综述了近15年青霉素G酰化酶在我国研究与应用的历史沿革、基因与蛋白质结构、工业应用表达体系、工业评价标准与进化研究，还对各种突变株在具体医药工业领域的开发应用进行了综述，旨在梳理青霉素G酰化酶结构与性能的进化趋势以及在医药工业领域取得的巨大成就，同时也为相关人员在此领域进行深耕提供参考。

Abstract

Penicillin G acylase （PGA） is one of the most widely used and successfully developed enzymes in the field of β⁃lactam antibiotics in recent decades. In China， along with the large⁃scale industrialization of β⁃lactam antibiotics，chemical synthesis methods to enzymatic methods， PGA have been fully developed and applied， and achieved success. Penicillin G acylase is not only used for hydrolysis to prepare 6⁃APA and 7⁃ADCA， but also for semisynthetic antibiotics such as ampicillin， cephalexin， amoxicillin， cefradine and cefaclor. This paper reviews the history， gene and protein structure， industrial expression system， industrial evaluation criteria and evolution of penicillin G acylase research and application in China in the past 15 years. At the same time， the development and application of various mutants of penicillin G acylase in specific pharmaceutical industry fields are also reviewed， aiming to sort out the evolution trend of the structure and performance of penicillin G acylase， its great achievements in the pharmaceutical industry field， and point out the direction for related researchers to delve deeper in this field.

Graphical abstract

关键词

青霉素G酰化酶 / 6⁃APA / 抗生素 / 突变体 / 进化

Key words

penicillin G acylase / 6⁃APA / antibiotic / mutant / evolution

0 引 言

青霉素G酰化酶（penicillin G acylase， 缩写PGA，EC 3.5.1.11）是β⁃内酰胺类抗生素半合成工业生产中最相关和应用最广泛的生物催化剂之一，在医药工业领域占有独特地位。β⁃内酰胺类抗生素是世界抗生素市场上最重要的一类抗生素，其中青霉素占全球抗生素市场的65%，年产量约为3×10⁷ kg，年销售达150亿美元^［1］，这一事实解释了为何人们对β⁃内酰胺酶巨大和持续的兴趣，随着医药行业和人类社会的发展，青霉素G酰化酶的年产量和消费量都在逐年递增，这无疑是对PGA工业产量升级的巨大挑战^［2］。

虽然PGA早已成为β⁃内酰胺类抗生素领域不可替代的大宗工业用酶，但近10年来，由于青霉素产能过剩以及国内限抗等原因，行业略呈萎缩趋势，即便如此，由于青霉素类抗生素高效、低毒、临床应用性广、长期作为全球一线抗感染用药等特点，其市场前景仍然被看好。

早在1950年，PGA就在产黄青霉（Penicillinum chrysogenum） Q176中被发现，作为一种异二聚体丝氨酸水解酶，可以水解青霉素G。PGA具有良好催化酰化以及去酰化特性。自然界中，很多细菌、真菌^［3，4］、酵母菌等都可以产PGA，目前发现有40多种微生物^［1］。现有工业应用的PGA大都源自细菌。细菌来源PGA可分为两大类：革兰氏阴性菌来源和革兰氏阳性菌来源，分别对应胞内表达和胞外表达。胞内表达的菌有粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌（Kluyvera citrophila）、雷氏普罗威登斯菌（Providencia rettgeri）等；胞外表达的菌有巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium）等。

β⁃内酰胺关键中间体——氨基青霉烷酸（6⁃aminopenicillanic acid，缩写6⁃APA）来源于传统的化学合成法，是通过有害的化学试剂将青霉素G脱乙酰化，成本过高且反应条件过于苛刻，会对环境造成污染；相比而言，使用PGA催化更为简单。野生型PGA以倾向水解反应为主，适当控制条件（偏酸性）或者改变序列后可以控制反应倾向于合成。因此，PGA不仅可以水解青霉素G或头孢菌素G生成对应的6⁃APA以及7⁃氨基头孢烯酸（7⁃amino⁃3⁃deacetoxycephalosporanic acid，缩写7⁃ADCA），还可以催化母核6⁃APA（氨苄西林，阿莫西林），7⁃ADCA（头孢环己二烯，头孢氨苄，头孢羟氨苄），7⁃APCA（头孢丙烯），7⁃ACCA（头孢克洛），7⁃APRA（头孢丙烯）以及对应的侧链（酰基供体）合成半合成青霉素（semisynthetic pennicillins，缩写SSPs）和半合成头孢菌素（semisynthetic cephalosporins，缩写SSCs）（见图1，表1）。通过PGA催化活性酰基供体与亲核试剂偶联的新一代头孢菌素的动力学控制的酶法合成是其最新的大规模应用之一。PGA巨大的工业潜力还表现在其定向进化后满足工业过程的特定要求等方面。通过近30年的发展应用，升级改造成酶法合成的β⁃内酰胺类抗生素的原化学合成反应已经全面被PGA催化（固定化）替代。

本文从PGA国内发展应用的历史沿革、基因来源、蛋白质结构等作为出发点，梳理近30年青霉素G酰化酶在中国研究与应用的历史沿革、结构与功能、工业应用表达体系、工业评价标准与进化研究、最新进展，并对其多功能性、生物催化潜力前景等做出预测。

1 中国PGA研究与应用的历史沿革

PGA已有70多年的研究应用历史，根据中国PGA在医药工业中的应用历史、结合多年医药领域经验，将其历史沿革分为以下五个时期。

1.1 60-70年代中期（起步期）至80年代（有一定基础）

在这一时期，国内外开始研究酶法制备6⁃APA。PGA在医药领域显现出的重要性使得各国科研人员多年持续进行相关研究。中国利用固定化大肠杆菌细胞法制备6⁃APA，其比活力很低（2~4 U/g）^［5］，此阶段应用受成本制约。即便如此，中国作为抗生素生产大国，在酶法半合成领域持续不断多年研究积累了众多研发、生产经验，占领了PGA发展与应用的主要阵地。70-80年代中国科学家们逐步也在推进此方面研究，但报道较少。

1.2 1990-2000年（研究期）

PGA研发、应用爆发期与成熟期集中在1990-2017年间，尤其结合青霉素类抗生素的生产周期，在1995-2005年间尤为突出，此阶段集中出现了大量研究论文及专利。

研究领域主要为含有野生型PGA的大肠杆菌等菌株的发酵培养、提取纯化、结晶、性质的研究测试和工业测试，以及PGA基因的定位、序列确定、核心催化氨基酸定位、克隆、定点突变^［6］、确定催化活性必需氨基酸^［7］等方面。在此期间，科研院所、高校中基础研究较多，一些大型抗生素公司开始接触此技术，陆续发表了一些文章^［5，6］

1.3 2000-2010年（研究推广应用期）

随着分子生物学研究的进步以及一些高表达质粒组合方式的开发成功，研究领域向侧重PGA及其突变体在不同宿主体系中的重组表达、大规模制备、工业验证方向转移。此阶段，国内大型抗生素生产公司逐渐开始接触、了解此技术并尝试引进使用，深入评估生物法和化学法间的生产成本差异并启动替代改造。

1.4 2010-2017（成熟以及国外技术冲击期）

由于PGA重要的工业价值，促使科学家们不断推进其研究进展。随着分子生物学、基因工程、生物信息学等技术的持续进步，主要研究偏重在定向进化、定点突变提升该酶的合成或水解性能，用以满足日益增长的抗生素合成工艺需要。在此阶段，PGA在医药抗生素领域的应用已经全面开花。近10年来，市场上PGA突变体更新换代次数较高。针对不同产品，配合其专门母核以及侧链，进化方式等差别，形成不同应用系列的分支。在此时间段，国内技术遭遇DSM、韩国立科等公司领先技术的冲击，国内技术也不断进步，突变体不断迭代，力图与国际领先水平接轨。

1.5 2017⁃至今（稳定期）

通过多年技术迭代、国内外技术冲撞带来的被迫提升后，整体PGA不同应用方向的格局已经稳定化，对于水解反应来说，固定化重复批次已经可达1 000批甚至以上。合成反应侧链和母核比例也有极大程度降低，阿莫西林甚至可以达到惊人的1.02∶1（5年前为1.2∶1~1.3∶1），固定化后也可以达到800甚至以上的使用批次。成本已经压到了历史最低，整体技术达到瓶颈期，国内各个抗生素大厂生产趋于平稳，技术改进动力较小。

2 PGA基因与结构

2.1 来源

不同物种来源PGA同源程度差异较大，例如：大肠杆菌，嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌的PGA都为革兰氏阴性菌，同源性高达87%。雷氏普罗威登斯菌，大肠杆菌，嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌的青霉素酰化酶基因序列同源性为62.5%~96.9%。而黄杆菌（Flavobactrium sp.） 650 PGA与巨大芽胞杆菌 PGA同源程度仅为28%。不同来源的PGA具有不同的酶学参数，对相同底物具有不同的Km，对抑制剂的响应程度也不同。目前广泛使用的青霉素酰化酶主要来源于杆菌和巨大芽胞杆菌^［8］，无色杆菌（Achromobacter sp.） CCM4824及其突变体等。其中，1960年就开始研究的大肠杆菌PGA由于表现出来的高潜力（水解）、最适温度60 ℃以及固定后运行稳定性，80年代进入到作为工业催化剂尝试应用阶段。因此，大肠杆菌PGA是研究最早、催化机理较为清楚的青霉素酰化酶。

2.2 基因与蛋白结构

以大肠杆菌PGA结构为例，早在1999年，在ATCC 11105的天然产PGA大肠杆菌菌株中，发现苯乙酸（PAA）诱导其编码PGA的表达基因pac，而葡萄糖抑制它及其相关的调控元件^［1］已经确定。原始PGA蛋白由α， β 2个亚基组成，而单独的α， β亚基不具有酶活性，一级结构上一段间隔序列（spacer peptide），只有当2者以适当的形式结合后才具有活性^［9］。调控基因包括两个CRP结合位点：⁃35位点和⁃10位点，BRS位点及三个不完全的回文结构末端，3'端存在一个ρ依赖的发夹结构作为终止子。其表达主要受到cAMP结合蛋白，苯乙酸和温度的影响^［10］。

2.3 蛋白的后加工与活性区域

PGA的结构为异二聚体，以研究比较清楚的大肠杆菌PGA来说，大肠杆菌PGA活性形式为由α亚基β亚基组成的异二聚体。pac首先在细胞质中转录并翻译成多肽基前体（即前体PGA），由从N端到C端的四个结构域组成：①26⁃AA（氨基酸）信号肽；②208⁃AAα亚基；③54⁃AA内肽间隔物（spacer peptide）；（4）557⁃AAβ亚基^［11］。信号肽负责将前体穿梭到膜周空间，该区域的突变可导致新生前体PGA在细胞质中的积聚。在易位到周质后，信号肽被去除以形成proPGA的另一种前体。随后，proPGA开始自行折叠，同时自动催化去除周质中α和β亚基之间的间隔区。在周质区去掉连接肽，才能够组装成具有活性的PGA（图2）。根据物种来源不同，亚基大小略有差异，PGA的α亚基一般为23~28 kDa，决定底物专一性，β亚基一般为65~69 kDa，与PGA的催化水解性质有关。不同物种来源的各个亚基大小不同、特性不同、工业进化上应用也不同。

3 青霉素G酰化酶作用机理

1995年，有研究报道了大肠杆菌PGA的1.9A晶体结构^［4］，异二聚体的两条链紧密缠绕在一起。β亚基上N⁃末端的单一氨基酸Serβ1为催化活性中心，而不同于其他丝氨酸蛋白酶与邻近的His形成电荷中继网，其最近的氨基为丝氨酸自身氨基。在一定程度上揭示青霉素G酰化酶具有新型的催化机制，由水分子参与、广义的酸碱催化机制。β⁃亚基（Serβ1）催化残基，被桥接水分子激活。如果脱水，PGA变得不活跃，因此，水必须存在。分析活性中心可以发现，α142M、α146F、β57F、β154T、和β177I位于疏水口袋的两侧部位。β67S位于疏水口袋底部，整个疏水口袋由β1S、β241N的侧链和β23、β69的主链氮原子组成。这些信息为定点突变和计算机模拟的定向进化指明了方向。不同来源的青霉素G酰化酶的催化性质差别较大。运用动力学方法研究了大肠杆菌，嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌，粪产碱菌来源的胞内青霉素G酰化酶的催化反应机制，也对有关底物与酶的结合等步骤进行了研究^［12］。从机理上讲，这种脱酰基过程类似于丝氨酸蛋白酶。酰基供体首先与活性部位的酰基亚基上的酶结合，它对疏水基团高度特异，并使Serβ1酰化，得到酰化酶中间体。反过来，这种复合物受到水分子（水解）或β⁃内酰胺核（合成）的攻击，它与氨基亚基（偏爱水性负电荷基团）相互作用，反应产物即母核或半合成抗生素，最终被释放出来。PGA催化水解和合成的反应机理相同，但反应条件不同^［1］。PGA介导青霉素G在微碱性pH下水解生成6⁃APA和PAA，导致苯乙酰基部分从6⁃APA转移到水。Ser（β1）的羟基对酰胺键的羰基碳进行亲核攻击，从而通过四面体过渡态形成酰基⁃酶复合物的共价中间体。当这种过渡状态通过Asn（β241）和Ala（β69）的另外两个氨基酸的参与，第一种产物6⁃APA从活性位点释放。接下来，酰基酶复合物通过水（或另一亲核试剂）的亲核攻击脱酰基，产生第二种产物PAA和游离酶。鉴于所有步骤都是可逆的，在低水活性和酸性pH条件下，酰基与β⁃内酰胺核的缩合成为可能，产生各种半合成抗生素，这种催化的可逆性进一步巩固了PGA作为生产多种β⁃内酰胺半合成抗生素的通用生物催化剂的重要性。

4 工业应用表达体系

在过去的30年里，与PGA相关的菌株改造、生物发酵等能力的提升，使得大规模生产PGA的技术得到了蓬勃发展与应用。重组DNA技术已广泛应用于细菌PGA的生化鉴定和大规模生产，其中大肠杆菌是其异源表达的主要宿主。由于下游加工在催化剂制造成本中占了相当大的成本（40%~65%），研究人员花费了大量的努力优化PGA序列、表达体系，提高工业用重组菌株的PGA产量，以下为近些年来PGA常用表达系统的评估。

4.1 大肠杆菌宿主

虽然已经有几种微生物宿主可用于异源PGA的生产，但大肠杆菌无疑是最容易获得的宿主系统，基本上所有重组类PGA测定活力时首选表达体系均为大肠杆菌，因为它具有强健的生长特性、对廉价原料的高繁殖力、众所周知的生理和代谢以及基因操作手段，周期短，表达量高。已有数十篇文章，涉及多种手段（质粒构建、诱导表达、分子伴侣、培养条件优化等）报道如何提高PGA在大肠杆菌体系中的表达量^［1］。缺点为IPTG价格昂贵以及该体系非常容易形成包涵体。即便如此，目前以水解6⁃APA为主的PGA仍优先选择大肠杆菌来源PGA作为进化骨架，匹配选择大肠杆菌表达体系。

4.2 枯草芽胞杆菌宿主

枯草芽胞杆菌是一种食品安全用菌株，有研究报道巨大芽胞杆菌PGA在枯草杆菌中分泌表达时，酶活力可达6 U/mL^［13］。2002年，利用重组枯草芽胞杆菌表达大肠杆菌PGA的绝对酶活力已经达到3.75×10⁴ U/L^［14］。后续有科学家报道，生物反应器中枯草芽胞产生PGA可达51 U/mL。由于研究人员选定的测定方法不同，活力也会有一定差异，不能平行比较。此外，枯草芽胞杆菌表达体系现在未作为PGA的工业生产体系来说，实际上这些表达水平现在看来仍过低，现阶段仍不具备大规模工业化价值。

4.3 巴斯德毕赤酵母

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）利用甲醇作为碳源，启动子为pAOX1，适用于高密度表达，可以稳定高产表达各种外源蛋白^［15］。该系统载体选择多样，可以实现胞内或者胞外分泌表达，并且可以体外构建多个拷贝，或内部加压实现基因多拷贝存在。2019年，利用巴斯德毕赤酵母重组表达来自大肠杆菌的Ec⁃PGA，并测定了细胞内外的产物浓度以及基于流式细胞术的细胞活力，这些数据的提供使我们对重组巴斯德毕赤酵母种群在PGA工业化过程中产物分离与提取的了解更加深入^［16］。毕赤酵母体系在PGA水解方面也有一定应用，但需要构建多拷贝表达载体并与基因组重组，活力仍较低。因此，其应用不如大肠杆菌普遍并逐渐被淘汰。

综上所述，大肠杆菌高表达系统通过引入外源基因可以专门用于PGA的大规模生产，该方向主要用于β⁃内酰胺抗生素合成方向PGA的生产，水解系统、主流表达系统为毕赤酵母系统和大肠杆菌系统，合成方向表达体系以大肠杆菌表达系统为工业系统。

5 PGA工业评价标准与进化研究

基因定向进化方法有很多，例如定点突变，DNA shuffing等。2003年，利用DNA shuffing技术，在雷氏普罗威登斯菌PGA基因克隆和表达的基础上，利用DNA家族重排技术构建了上述基因的嵌合体突变库，最终合成活力提升40%^［17］。2022年，开发胰蛋白酶消化与液相色谱⁃串联质谱（LC⁃MS/MS）联用的方法，通过蛋白质组学分析，鉴定了来自八家公司的十二批PGA，并将其分为两类菌株（大肠杆菌和无色杆菌CCM 4824），在六批不同的SSBA中检测到0.01~0.44 ppm的痕量PGA残留蛋白，远低于DSM报告的35 ppm的安全限值^［18］。一般而言，PGA的进化是集中在为了更好地合成反应指标做准备，而水解仅应用不同来源野生型序列就可以达到目的。近15年来，代表性的各个物种进化方式、突变点的专利参见表2^［19~36］。我们可以看到，主流进化方向为合成，涉及的位点主要包括α142⁃146，β24，β56，β177等核心位置。这些位置和前面所述的核心区域重合或者在三级结构上较为临近。水解研究主要以野生型研究以及Codexis公司2020年后释放的一系列专利为主。

5.1 评判指标

从经济角度看，合成反应尽可能降低酰基供体/亲核试剂的摩尔比（S/H）是很重要的。然而，当接近反应物的化学计量比时，活化酰基供体的水解成为至关重要的参数。由于野生型PGA既具有水解能力，也具有合成活力。因此，为了给PGA进化建立标准，通常要测定两个指标：即最适条件下的合成能力（S）以及最适条件下的水解能力（H），并且通过评定S/H比值变化来评判PGA的合成水解倾向。笔者以下叙述目前工业界广泛应用的不同方向PGA进化时使用的几个主要骨架来源与突变点积累情况。

5.2 大肠杆菌PGA进化方向

大肠杆菌PGA研究较早，2000年，将β亚基427位（突变A）和430位（突变B）赖氨酸残基突变为丙氨酸，降低了该酶的等电点，增加了疏水性，从而提高其在酸性和有机溶剂环境中的稳定性，最高可提高166%^［37］。2018年，通过蛋白质工程提高了PGA的立体选择性。与野生型酶相比，含有Fβ24A的突变体对（R）⁃PGME具有98%以上的立体选择性。改进后的酶可用于氨苄西林的合成^［21］，更多内容参见表2。

5.3 无色菌属PGA进化方向

2007年，申请PCT专利，公开并保护全长为2 626 bp的无色杆菌CCM4824来源PGA序列及其重组应用，并保护其在阿莫西林、头孢羟氨苄、氨苄西林、头孢氨苄合成中，中间体6⁃APA，7⁃ACA制备领域的应用^{［38，39］}。2021年，将Ax⁃PGA不同亚基的突变位点（βF24、αR141和αF142）整合到一起，得到三重突变体αR141A/αF142I/βF24G，其在工业生产中表现出更好的性能，活化酰基供体（R）⁃扁桃酸甲酯的（kcat/Km）AD值提高了4.2倍^［40］。值得一提的是，无色杆菌PGA热稳定性更好、与大肠杆菌PGA相比，其在氨苄西林和阿莫西林合成中具有更高的效率（较高的S/H比和产品积累）。

5.4 其他物种PGA等进化方向

有关巨大芽胞杆菌PGA以及其他物种PGA也曾在一段时间为研究热点，具体突变手段、位点参见表2。总体来说，随着时间进展，其他这些物种来源的PGA进化已经被无色菌属菌株骨架所替代。

6 结论与展望

拥有百年发展史的β⁃内酰胺类抗生素对人类健康、社会发展起着举足轻重的促进作用。与此同时，自然界中微生物的耐药性不断增加，推动了天然来源青霉素类、头孢菌素药物类到半合成β⁃内酰胺抗生素研究的发展。对β⁃内酰胺半合成抗生素的高需求，将继续推动PGA新序列的发现、基因工程、进化和大规模生产的生物技术的持续进步。

PGA催化作为一种环境友好和经济的替代化学工艺，在生物工艺中的应用具有重大工业价值。现阶段，制药行业，医药公司对PGA的要求越来越高，主要集中在：

（1）追求更高性能：不断有针对性地寻找进化性能提升的PGA，提高S/H比，降低侧链投量，降低成本。该过程中，微生物基因的多样性为PGA序列选取过程提供了多项选择。工程化、定向进化PGA进一步增加了识别β⁃内酰胺类底物或获得更好的催化特性。例如，提高产物合成的初始速率与活化酰基供体的初始水解速率比，与其对青霉素G水解速率比，增加合成优势等。

（2）固定化技术不断提高：以水解6⁃APA来说，最近，最优指标是固定化批次可达1000批，进一步降低成本（有关固定化的进展见作者另一综述，暂未发表）。

（3）进一步提高既有PGA的生产效率与稳定性。这些也是其大规模工业应用的必然要求。

PGA分子结构和催化机制的深入研究让我们意识到了PGA巨大的工业潜力。21世纪第一个基因组时代的到来，为我们阐明了PGA的蛋白质组学信息，通过对不同青霉素生产突变菌株和条件之间的全蛋白质组比较分析，逆向工程开发增强突变体，为揭开青霉素生产背后的工业秘密做出了贡献^［41］，这种方法与传统基因工程、蛋白质工程、定向进化等手段结合，创造出越来越多性能更强大的PGA不断投入市场，这预示着PGA进化将迎来更加美好的未来。

与此同时，随着我国对抗生素药物分级管理等减抗限抗措施的推行，抗生素市场增速在2017年出现明显下滑。虽然整体仍然保持增长趋势但对PGA的需求会放缓，成本控制会更加严格。另外，结合PGA在非抗生素领域的功能的需求可能进一步拓宽，例如精细化工及医药中间体的手性拆分、特定结构化合物化学修饰后的特异性水解、多肽合成水解等，这就对PGA的分子功能的精细化定向进化提出了更高、更细致的要求。所以，结合抗生素生产、各种中间体的制备、手性药物的拆分等方面多种因素考虑，未来PGA的发展机遇与挑战并存。

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基金资助

河北省高校应用技术研发中心平台项目(2020⁃4)