红树林混合菌群协同降解偶氮染料活性黑5脱色性能研究

Synergistic decolorization of azo dye reactive black 5 by mangrove mixed microbial community

摘要

通过对福建省龙海市海门岛红树林保护区的近海沉积物样品进行富集驯化，得到了能够协同降解偶氮染料活性黑5的混合菌群HMD9⁃Q7。经过生化试验和16S rDNA序列分析，鉴定该混合菌群主要由越南蔷薇菌（Rossellomorea vietnamensis）、转化异源物食烷菌（Alcanivorax xenomutans）和近海生微泡菌（Microbulbifer maritimus）组成。与单一菌株相比较，混合菌群具有显著的脱色效果，可能因其菌株之间存在着相互协同促进作用。该混合菌群对含20~100 mg/L浓度的活性黑5均产生脱色作用。混合菌群HMD9⁃Q7可以广泛利用外加碳源和氮源，如葡萄糖、硝酸铵、牛肉膏等；NaCl浓度在5~30 g/L范围内都可对活性黑5进行脱色；在pH 7和温度30℃条件下脱色率最高。在最优条件下，该混合菌群在60 h内对活性黑5的脱色率可达到85%~90%。该新型混合菌群主要通过生物降解途径来实现对活性黑5的脱色。随着降解反应的发生，活性黑5的最大吸收峰逐渐变小直至完全消失，降解产物吸收峰位于近紫外光区。

Abstract

Through the enrichment and separation of mangrove sediment samples from Haimen Island Mangrove Reserve in Longhai City， Fujian Province， a mixed microbial community HMD9⁃Q7 was obtained and could synergistically degrade azo dye reactive black 5（RB5）. Based on biochemical assays and 16S rDNA sequence analysis， the community was identified as mainly composed of Rossellomorea vietnamensis， Alcanivorax xenomutans， and Microbulbifer maritimus. Compared with single strains， the community had a significant decolorization effect， which may be due to the synergistic promotion between various strains of the community. The community had decolorization effect on RB5 at concentrations of 20-100 mg/L. The community HMD9⁃Q7 could widely utilize external carbon and nitrogen sources， such as glucose， ammonium nitrate， beef extract paste； in the range of NaCl concentrations of 5-30 g/L， the RB5 could be decolored； the decolorization rate was highest under the conditions of pH 7 and temperature of 30 °C. Under the optimal conditions， the decolorization rate of the community on RB5 within 60 hours could reach 85%-90%. The new community mainly achieves decolorization of RB5 through biodegradation pathways， and with the occurrence of degradation reaction， the maximum absorption peak of RB5 gradually becomes smaller until it disappears completely， and the absorption peak of degradation products is located in the near ultraviolet region.

Graphical abstract

关键词

混合菌群 / 协同降解 / 活性黑5 / 脱色性能

Key words

mixed microbial community / synergistic degradation / reactive black 5 / decolorization performance

0 引 言

工业化发展使得染料需求量在印刷、化妆品、纺织、皮革和食品工业领域不断提高，染料的大量使用增加了工业废水的产生。染料的原材料构成多是化工产品，后经过人工合成而成为芳香类化合物^［1］。大量高颜色废水被排放到河流、池塘和渠道，它通过降低光渗透率，大大降低了水生植物的光合潜力^［2］。此外，它还能通过改变pH值，降低溶解氧，增加生物需氧量，极大地破坏水质。由于这些芳香类化合物大多具有毒性，未经处理排放到自然环境中必然造成水体和土壤的污染，尤其是随着地表径流汇入海洋，对近岸海洋生物产生恶劣影响^［3］。较高的毒性物质排放到自然环境中会持续进入食物链，进而危及人类身体健康及卫生系统。

目前，利用微生物处理工业染料废水的应用和研究是前沿热点，因为污水处理中的物理化学方法缺点较多，如对一些复杂的高污泥产物不容易做吸附处理，维护成本高，对于某些化学试剂的絮凝，还会产生大量的次生污染，必须按要求进行安全倾倒处理等。由于其限制较多，所以此类方法只适合在工厂废水处理中应用，很难应用到近海岸的海洋水污染的治理之中。而生物降解是生态友好的，能够完全矿化有机化合物。生物降解是通过将大分子物质转化成为一些简单的小分子物质，最后进行彻底降解，从而减小对环境的危害。生物修复有多种优点，降解过程对环境友好，末端的降解产物无毒害。此外产生的泥量少、耗水量小，具有较高的环境经济效益，因此生物处理法更适合应用于近海岸的污水治理中。大部分降解菌株分离于土壤或污泥驯化池，多用于工业废水的处理，但很少有研究者利用生物降解法来解决近海岸海洋污染问题。近海岸为众多河流的汇集出口，往往受到河流所携带的各种污染物在入海口处沉积，造成近海岸水质下降。分离筛选来自入海口红树林区域的高效染料降解菌株，并强化菌株的脱色能力，以便于利用生物降解法来解决近海岸海洋水污染问题，能够为近海岸的海洋污染治理提供新的解决路径。

本研究选取偶氮染料活性黑5（（C₂₆H₂₁N₅Na₄O₁₉S₆，相对分子量为991.7891，结构如图1）作为降解目标。该染料是工业中最常用的一种偶氮染料，具有牢度高、易洗涤、成本低廉等优点，在棉织物的染色和印花中使用量极大。同时该染料分子结构较为复杂，在染料废水中较难降解^［4］。国内外对活性黑5降解菌的研究也较多，但大多聚焦于单一菌株降解（如表1所示）。近年来研究发现，混合菌群较单一菌株具有较好的脱色降解性能。大多数纯培养的单一细菌，只能在厌氧条件下初步将偶氮染料的发色基团即氮氮双键打开，而对于产生的中间代谢产物如芳香胺类化合物却很难完成进一步的降解并矿化^［5］。而利用细菌构建的复合菌群却可以弥补上述不足，由于细菌混合菌群中含有大量不同的菌株，菌株之间具有良好的协同作用，可以作用于染料分子的不同结构，且多种菌株可以在厌氧与好氧两个阶段实现偶氮染料的彻底降解。因此，本课题目的在于筛选出具有高效降解染料功能的海洋来源的混合菌株，并强化菌株的脱色能力，以便于利用生物降解法来解决近海岸海洋水污染问题。

1 材料与方法

1.1 样品采集

沉积物样品采集自福建省漳州市龙海市海门岛红树林保护区红树林沉积物。2021年7月21日在环海门岛选择10个站位，站位信息如表2所示，采集红树林沉积物样品，装入无菌样品杯中。

1.2 活性黑5降解菌的富集、筛选及分离鉴定

在超净台进行称重分装，取10 g沉积物样品加入含50 mL培养基的250 mL的锥形瓶中，再加入活性黑5染料母液，使液体培养基中的活性黑5终浓度达到100 mg/L，开始进行初步富集。

培养基：氯化钠30.0 g/L，氯化镁（7H₂O）7.0 g/L，硝酸铵1.0 g/L，氯化钾0.7 g/L，磷酸二氢钾2.0 g/L，磷酸氢二钠3.0 g/L，葡萄糖1.0 g/L，调pH至7.4，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，为防沉淀，七水合硫酸镁需单独灭菌，冷却后混合；灭菌后补加微量元素溶液^［6］。

初次富集的样品，放置于恒定温度28 ℃的摇床避光震荡培养，培养10 d后用等量体积的液体培养基进行二次转接，转接比例为1∶100（V∶V）。再次培养20 d进行三次转接，最终得到三次转接富集后的混合菌群。对最后一次富集驯化的混合菌群，观察降解效果。采用稀释涂布法，从富集驯化的混合菌群分离纯化菌种。将菌悬液涂布在含有RB5染料的固体2216E平板上，于28 ℃恒温培养箱培养2 d，观察菌落形态，反复纯化，直至菌落形态一致。

对分离出的菌株进行16S rDNA扩增，PCR反应体系包括2.5 μL Loading Buffer，2 μL DNTPs，0.2 μL Taq酶，27F和1492R引物各1 μL，16.3 μL dd H₂O，2 μL DNA模板。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s（35个循环）；72 ℃ 7 min^［7］。PCR产物交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。最终将菌株的16S rDNA基因序列提交GenBank数据库中进行序列同源性比对，采用MEGA7软件中的邻接法构建系统发育树^［8］。

1.3 不同染料浓度对混合菌群的脱色能力的测定

配制终浓度为200 mg/L 的活性黑5母液，然后分别稀释配制成10、20、40、60、80、100 mg/L的活性黑5超纯水溶液。通过紫外分光光度计在活性黑5的特征吸收峰分别测定不同浓度的活性黑5标准溶液的吸光度。以活性黑5浓度为横坐标、活性黑5最大吸收波长处测定的吸光度数值为纵坐标，即可得到活性黑5的标准曲线。

将菌种用无菌海水重悬后，按5%接种量分别接种于含10、20、40、60、80、100 mg/L浓度的活性黑5染料培养液中，测定菌群对活性黑5的降解能力。以未接种的培养液做空白对照。将接种的培养瓶于28 ℃摇床震荡避光培养，培养过程中取样，采用分光光度法测定混合菌群的脱色能力。

脱色能力测定：取1 mL菌悬液样品，置于离心管中，13 000 r/min离心1 min，取上清液，采用紫外⁃可见分光光度法（UV⁃Vis）（Variancary100，USA），在200~800 nm范围内进行波长扫描，确定活性黑5的最大吸收波长在598 nm处。测定598 nm处吸光度，按公式计算脱色率（Dr）：Dr=（B－A）/B×100%；其中，B为初始染料培养液的吸光值，A为脱色染料培养基的吸光值，Dr为脱色率^［9］。

1.4 混合菌群与单一菌株对活性黑5的脱色效果分析

将从海门岛红树林编号HMD9样品中筛选分离鉴定出来的混合菌群HMD9⁃Q7与其组成的单一菌株Q7⁃1、Q7⁃2、Q7⁃3分别在相同的培养条件下进行脱色实验测定，将菌株按5%的接种量分别接种于含20 mg/L活性黑5染料的培养液中，放置于摇床震荡避光培养，温度为28 ℃，定时对脱色液进行观察取样。通过对比法探究混合菌群与单一菌株对活性黑5脱色效果的差异。

1.5 不同培养条件下混合菌群对活性黑5的脱色效果分析

将平板培养的混合菌群HMD9⁃Q7用无菌海水重悬后，以5%的接种量加入至终浓度为20 mg/L的活性黑5培养液中进行脱色效果测定。初始培养温度条件为28 ℃，pH 7.0。分别考察碳源为葡萄糖、蔗糖、乙酸钠和柠檬酸时该混合菌群对活性黑5的脱色能力；分别考察氮源为氯化铵、硝酸铵、牛肉膏＋蛋白胨时该混合菌群对活性黑5的脱色能力。（添加量均为2 g/L）；考察温度为20~40 ℃，pH 4~7，NaCl浓度在5~30 g/L范围内该混合菌群对活性黑5的脱色能力，设置3个重复，测定不同时间培养液的脱色率。

1.6 混合菌群降解活性黑5机理的初步探究

紫外⁃可见光谱分析方法是检测染料是否被降解的基本手段^［10］。吸收峰与染料是否被降解有紧密关系，如果染料在紫外⁃可见光区中主要的吸收峰消失或者产生其他新的吸收峰，则可以初步能说明染料已经被降解^［6］。

将菌株按5%的接种量分别接种于含20 mg/L活性黑5染料的培养液中，放置于摇床震荡避光培养，温度为28 ℃。定时取1 mL不同时间段的活性黑5染料脱色液置于离心管中，13 000 r/min离心1 min。上层离心液采用紫外⁃可见分光光度法在200~800 nm范围内进行全波段光谱扫描分析，观察上清液中紫外⁃可见吸收峰的变化^［11］。

2 结果与分析

2.1 活性黑5降解菌的筛选、分离和鉴定

十个样品经过三轮转接富集获得4个有效降解活性黑5的降解菌群，分别为HMD9、HMD9⁃Q4、HMD9⁃Q6、HMD9⁃Q7。其中降解效果最好的降解菌群为HMD9⁃Q7。将该富集液取样稀释涂布平板，分离纯化获得三株单菌Q7⁃1、Q7⁃2和Q7⁃3，其16S rDNA序列结果在GenBank数据库中进行序列同源性比对（见表3）。采用MEGA7软件中的邻接法构建系统发育树，结果表明，三株单菌分别与转化异源物食烷菌（Alcanivorax xenomutans）、越南蔷薇菌（Rossellomorea vietnamensis）、近海生微泡菌（Microbulbifer maritimus）相似性最高，均为99%，该混合菌群HMD9⁃Q7能够高效降解偶氮染料活性黑5，系统发育树如图2所示。另外将菌株Q7⁃1、Q7⁃2、Q7⁃3序列提交GenBank数据库，得到序列登录号分别为OQ359959、OQ359957和OQ359893.

2.2 不同染料浓度下混合菌群的脱色能力

染料的浓度越高，其对应的毒性越大，过高的毒性会对细菌的生长产生抑制作用，从而影响菌株对偶氮染料的降解作用^［12］。偶氮染料活性黑5本身分子结构较为复杂，偶氮键很难断裂，是目前偶氮染料里较难以降解的一种染料。通过考察混合菌群对不同浓度活性黑5的耐受能力，可以判断该混合菌群的应用价值及推广性。

由图3可以看出，菌群HMD9⁃Q7对活性黑5具有显著的脱色作用。在改良人工海水培养基中对10~100 mg/L浓度的活性黑5均产生了脱色作用。浓度为20~60 mg/L范围内的36 h脱色率可以达到60%~80%；在浓度为60~100 mg/L范围下脱色率在45%左右。总的来说，本研究筛选到的混合菌群HMD9⁃Q7具有较强的偶氮染料耐受能力，能够在稍高浓度的脱色液中生长并实现染料的降解。

2.3 活性黑5降解菌群HMD9⁃Q7与单菌脱色效果分析

混合菌群在含有20 mg/L的偶氮染料活性黑5染料的脱色培养基中摇床震荡培养60 h，直接观察可见活性黑5已经被降解至无色，如图4所示。通过紫外⁃可见分光光度法测定并计算得降解率达到82%~90%，由此可见混合菌群降解效果显著。将三株单菌及两两组合的细菌做脱色实验。通过实验可测得，混合菌群脱色效率远远大于单菌的脱色效率，其脱色效果如图5所示。由图6可知，菌株Q7⁃1和Q7⁃3对活性黑5的脱色率极低，最高达到10%左右；菌株Q7⁃2脱色效果稍好，在78 h时最高脱色率为45%左右，但单菌的脱色效率远不如混合菌群的脱色效果。因为对单一菌株而言，一般只是将发色基团打开，对中间产物如苯胺类致癌物质很难进一步降解。而混合菌群中的不同菌株会作用于染料分子的不同部分和基团，有些菌株会和其他菌株构成共代谢机制，借助相互的协同作用实现偶氮染料的彻底矿化与降解^［13］。

2.4 不同培养条件下菌群HMD9⁃Q7对活性黑5的脱色效果分析

在微生物脱色偶氮染料过程中，以染料作为碳源和氮源往往不能满足微生物生长的需要，有些染料甚至对微生物会产生毒副作用，因此需要外源碳源和氮源通过共代谢机制实现染料的脱色或降解^［14］。碳氮源对微生物的新陈代谢活动有重要的影响，可以充分被吸收利用的合适碳氮源更有利于微生物的代谢活动，因此选择合适的碳源更有利于促进菌群对活性黑5的降解^［15］。由图7可以看出菌群HMD9⁃Q7均可利用葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、柠檬酸四种碳源；在40~60 h时，碳源为蔗糖和乙酸钠时降解率达到80%左右；菌群HMD9⁃Q7在氮源为硝酸铵，氯化铵，牛肉膏＋蛋白胨时，也具有降解效果，但30 h后牛肉膏＋蛋白胨的脱色率上升明显，可能是因为蛋白胨能够促进NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）的再生，加速了偶氮染料的还原。

温度对细菌的生长繁殖以及酶的活性都有很大的影响。温度过低或者过高都会抑制酶的活性，所以适宜的生长温度有利于菌群对染料的降解。菌群HMD9⁃Q7在20~40 ℃均有良好的脱色能力。在30 ℃下60 h时活性黑5的脱色率可达84%左右。染料在印染的过程中需要较高的盐度，而盐度过高会使细菌的渗透压产生变化从而影响到脱色能力。因此，NaCl浓度也是影响菌株脱色的一个重要因素。在小体积废水模拟实验中，菌群HMD9⁃Q7在NaCl为5~30 g/L的范围内都可以进行脱色，降解率比较同步，在38 h后脱色速率加快，在54 h脱色率达到80%左右。由此可以看出，菌群HMD9⁃Q7在不同盐度条件下都可以对活性黑5进行降解。pH也是影响微生物脱色的一个重要因素，pH能影响微生物细胞膜对染料分子的透过性。实际染料废水由于所含成分十分复杂，pH大都呈酸性或者碱性而不利于微生物生存。根据实验数据（图6），菌群HMD9⁃Q7在24 h内在pH 4~8范围内对活性黑5的脱色效果并无很大差异，但在24 h后明显在pH6的条件下降解效果更为显著，脱色率可以达到80%左右。可能因为菌株在pH为7的条件下酶活处于较高的水平，因而能较好地脱色活性黑5。

2.5 混合菌群降解活性黑5的机理初步探究

研究表明，微生物对染料脱色的机制有两种：生物吸附脱色和生物降解脱色。生物吸附脱色仅仅是通过染料分子与微生物表面的大分子物质相结合，从而染料被吸附到微生物表面而使废水脱色的途径^［16］。而生物降解脱色则是通过染料分子与微生物分泌的酶发生氧化还原反应，破坏染料大分子中的发色基团和助色基团，从而断裂成为小分子物质^［17］。

通过实验观察，在不经过离心的脱色液体系由深蓝色到淡蓝色，转为淡紫色最终达到无色的状态，且最终脱色液体系经过离心后，菌体仍然为无色状态，可以明显看到不是菌体的吸附作用，由此可以初步判断是菌群的生物降解脱色。通过紫外⁃可见吸收光谱扫描可知，在实验模拟废水中活性黑5的可见最大吸收峰值位于598 nm处，紫外吸收峰在330 nm处，降解前活性黑5分别对应图8中1、2峰，推测它们可能是偶氮键、氨基酸等物质。随着降解反应的发生，1、2峰逐渐降低，直至1峰彻底消失。有代谢产物出现可能是因为－ＯＨ，－ＮＨ３等助色基团的脱落，导致生色基团上电子云密度下降所致^［18］，说明染料的结构被破坏，染料逐渐被混合菌群HMD9⁃Q7降解，但其是否彻底降解活性黑5及降解过程中所产生的代谢产物还需进一步的研究探索。

3 讨 论

沿海红树林沉积物中微生物多样性高，可开发的功能性较多。近年来，具有石油、塑料及染料废水等污染物降解和环保价值的微生物菌株及其基因得到广泛的开发，展示了巨大的应用潜力。活性黑5作为偶氮染料中使用最广泛且结构最复杂，最不易降解的染料之一，也是染料废水污染中的研究重难点。有研究发现一些降解偶氮染料的功能菌株，但单一菌株降解复杂污水环境的能力有限。因此，近年来混合菌群协同降解染料废水成为新的突破口。

先前研究报道，在纺织废水污泥中分离出了粪肠球菌（Enterococcus faecalis）和变异克雷伯菌（Klebsiella variicola），研究发现这两株细菌混合培养可以高效地降解活性红198染料，72 h内脱色率高达98.57%^［19］；对从活性污泥样品中分离得到的多株偶氮染料脱色菌进行复配实验，并探究了不同复配条件下菌群的脱色效果，结果表明各复配的混合菌群对偶氮染料的脱色能力明显要优于单一菌株^［20］，分析其原因可能是外在的环境因素，如碳氮源、温度和pH，溶氧量等，会对菌株产生促进或者抑制作用^［21］；或者由于内部因素，如染料的分子结构及浓度，以及不同菌株会产生不同的酶催化作用等。

本研究通过在含有活性黑5染料的培养基中富集，选择性地分离鉴定出能够高效降解活性黑5的混合菌群。我们分离得到的具有活性黑5降解效果的混合菌群为HMD9⁃Q7，该菌群由三株单菌构成，其中越南蔷薇菌为主要发挥降解作用的菌株，另外两株转化异源物食烷菌、近海生微泡菌自身发挥的降解作用较小，但是对主要功能菌株起到了协同促进作用，使得整体的降解效果大大增强。

根据单菌脱色实验以及纯化出的单菌复配组合实验分析，纯化出的单菌经复配后的菌群并不能达到与共生状态下的混合菌群一致的脱色效果。我们推测在该混合菌群中，菌株Q7⁃2为主要优势降解菌株，在共生的状态下，另外两株菌对Q7⁃2的生长或者某种功能酶可能起到了某种促进或者催化作用，使得该混合菌群的脱色效果达到最优。此外我们根据文献研究报道及实验分析推测，优势菌株Q7⁃2可能具有某种偶氮还原酶，才会在另外两株菌的协同促进作用下发挥更大的自身优势。后对菌株进行全基因组测序，结果的确发现了菌株Q7⁃2含有偶氮降解功能基因，在适宜的外在环境下以及另外两株菌的协同促进下，降解能力得到了加强。

另外，偶氮染料的彻底矿化降解是一个较为复杂的过程，在混合菌群的协同降解作用下，生物降解脱色则可能通过一些菌株分泌出的酶与染料物质发生氧化还原反应，从而破坏染料大分子，使其发色基团和助色基团断裂，从而变成为小分子物质，最终能否进行彻底矿化降解，后续应采用LC⁃MS或者GC⁃MS等方法来检测其降解产物，进一步推测其可能降解的途径。

4 总 结

富集菌群HMD9⁃Q7通过进一步分离纯化得到三株单菌，通过16S rDNA基因序列分析鉴定这三株单菌分别是越南蔷薇菌、转化异源物食烷菌和近海生微泡菌。该菌群对偶氮染料活性黑5具有较高的耐受性，通过对含20~100 mg/L浓度的活性黑5进行降解实验，得出在浓度为20~60 mg/L范围内的36 h脱色率可以达到60%~80%；浓度为60~100 mg/L范围内脱色率在45%左右。通过对该混合菌群与分离出来的三株单菌进行对比降解实验发现，该混合菌群协同降解染料活性黑5效果较显著。在模拟的染料废水中60 h内对20 mg/L的活性黑5脱色率高达85%~90%，而在同等培养条件下三株单菌和两两组合的菌株的降解率较低，可以看出该混合菌群HMD9⁃Q7具有明显的降解活性黑5的优势，协同降解效果远远大于单菌降解效果。

通过对混合菌群HMD9⁃Q7的脱色条件进行优化，发现该菌群可以利用多种碳源和氮源进行脱色；菌群在20~40 ℃均有良好的脱色能力，其中30 ℃时脱色效果稍好；菌群HMD9⁃Q7在NaCl为5~30 g/L的范围下都可以进行脱色，对盐度具有较好的适应性；该菌群在pH 7时降解效率更好。在此培养条件下可以实现对活性黑5的高效脱色，60 h内对20 mg/L的活性黑5脱色率高达85%~90%。通过紫外⁃可见吸收光谱扫描可以看出，随着降解反应的发生活性黑5的最大吸收峰逐渐变小直至完全消失，说明可能是偶氮键的断裂或者是发色基团被破坏，染料逐渐被降解^［22］，但降解过程中产生的代谢产物及其降解途径还有待进一步研究。

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基金资助

科技部2021年科技基础资源调查专项(2021FY100903)