汾酒酿造车间和车间外环境中酵母菌多样性研究

Study of yeast diversity in Fenjiu brewing workshop and outside environment

摘要

为解析汾酒厂区酵母菌资源的多样性，采用分离培养方法，从汾酒酿造车间和车间外环境中的微生物中分离纯化到300株酵母菌，经26S rDNA序列比对分析，检测到酵母菌包括6科15属21种。系统发育树结果表明，汾酒酿造车间和车间外环境中的酵母菌包括担子菌门（Basidiomycota）和子囊菌门（Ascomycota）两个分支。尽管汾酒酿造车间和车间外环境中各有特异的酵母菌，但是两者都存在与白酒酿造相关的酵母菌如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）和扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）等。汾酒环境中含有丰富的酵母菌资源，可能是大曲和酒醅发酵过程中酵母菌的主要来源。这些都为进一步研究指明了方向。

Abstract

To investigate the yeast diversity in the Fenjiu distillery， 300 yeasts were isolated and purified from both inside and outside of Fenjiu workshop using the culture⁃dependent method. The analysis of 26S rDNA sequence alignment revealed a total of 6 families， 15 genera， and 21 species of yeasts. The results of the phylogenetic tree showed that the yeasts in the Fenjiu brewing workshop and the environment outside the workshop included two branches of the phylum Basidiomycetes and Ascomycetes. Although there are specific yeasts in the Fenjiu brewing workshop and outside environment， there are yeasts related to Baijiu in both of them， such as Saccharomyces cerevisiae， Pichia kudriavzevii and Saccharomycopsis fibuligera. The Fenjiu distillery has an abundance of yeast resources， which may serve as an important source of yeast for the Daqu manufacture and fermentation process. There all point the way for further study.

Graphical abstract

关键词

汾酒 / 可培养方法 / 酵母菌多样性 / 系统发育树

Key words

Fenjiu / culture⁃dependent method / yeast diversity / phylogenetic tree

0 引 言

中国白酒是一种古老的蒸馏乙醇饮料，在中国的经济、传统文化和人们的生活中起着至关重要的作用。杏花村镇是清香型白酒核心产区，坐落于吕梁山脉东麓，太原盆地西，属温带季风气候，夏季炎热多雨，冬季干燥寒冷，春秋比较凉爽。汾酒是典型的清香型白酒，其工艺精湛，过程复杂，素以入口绵、落口甜、饮后余香、回味悠长的特色而著称^［1，2］。汾酒的生产工艺采用“地缸发酵”和“清蒸二次清”的方式^［3，4］。酿造过程为环境微生物、大曲和原粮微生物进行组装、演替等一系列复杂的物质能量代谢过程^［5~7］。汾酒中主体风味物质乙酸乙酯的形成，是由多种微生物在不同的时间段互作、协调作用的结果^［8~12］。其中，酵母菌是决定乙醇产量和风味物质的核心功能菌^［13~15］。目前从清香型白酒的大曲和发酵过程中分离并鉴定到23属38种酵母^{［8，12，16］}。

传统食品生产的相关环境具有相对特定的微生态系统，且这些微生态系统中的微生物群落构成是生境依赖的^{［17，18］}。汾酒酿造的环境微生物可能来自酿酒车间（如空气、生产器具、地面等）和车间外环境（如地下水、空气）。截至目前，关于汾酒酿造车间和车间外环境中酵母菌的多样性研究比较欠缺，这些环境来源的酵母菌可能通过直接或者间接的途径被带到大曲和酒醅发酵的生产过程。因此，汾酒酿造车间与车间外环境中酵母菌多样性值得研究。

本研究采用分离培养技术，对杏花村镇汾酒集团的酿酒车间和车间外环境中酵母菌资源进行调查，通过26S rDNA D1/D2序列分析，阐明汾酒厂区酵母菌的生态分布，为研究汾酒厂区环境中酵母菌的资源多样性和分布，以及清香型白酒酿造中酵母菌的溯源、群体遗传和筛选适合清香型白酒酿造的优良酵母菌株奠定基础。

1 材料和方法

1.1 样地概况

山西杏花村汾酒厂股份有限公司位于山西省汾阳市杏花村镇，此地温带季风气候，夏季多雨炎热，冬季寒冷干燥，春秋相对凉爽。地理坐标约为东经111°53'，北纬37°20'，有多个酿造车间及一个汾酒工业园林。汾酒厂区植被丰富，生境相对复杂，为微生物的生长繁殖提供良好的环境。

1.2 方法

1.2.1 样品采集

总共40份环境样品：酿造车间内20份样品取自器具、铁锹、传送带、缸壁、墙壁、地面、“缸花（地缸周边的土壤）”和空气，样品采集人戴一次性手套，用灭菌的棉拭子浸泡于无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH为7.4）中，10 s后取出，擦拭待取的环境样品，每个样品擦拭范围为6 cm²，将擦拭的棉拭子置于含有微生物保护液的无菌管中，用空气取样器采集空气样本，完成取样后带回实验室进行菌株的分离培养。酿造车间外（限汾酒厂区）20份样品取自树皮、叶片、土壤、花朵、果实和人工湖的水，样品采集人戴一次性手套，采样于无菌取样袋中，每份样品做好相应标志，采集完后立即带回实验室做后续分析。

1.2.2 酵母菌分离、鉴定和系统发育树构建

① 分离方法：称取1 g酿造车间外的样品或从保护液里取1 mL酿造车间内样品，置于含有9 mL的YPD液体培养基（葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，200 μg/mL氯霉素，自然pH）的15 mL无菌管中（此作为1×10^-1梯度），室温静置3~10 d，期间根据产生的气泡多少来决定是否涂板（具体判断方法：用手轻甩管，观察气泡往上冒的情况，如果多和快就涂板，若少和慢就继续静置），采用梯度稀释涂板法，吸取1 mL 10^-1梯度至有9 mL无菌水的试管中，依次配成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5 4个梯度，吸取200 μL稀释液在YPD固体培养基进行涂板。根据在培养基上长出酵母菌的质地和形态，挑取单菌落酵母菌划板纯化。每份样品中挑取3~6株酵母菌划板，纯化3次后提取DNA鉴定。

② 鉴定方法：挑取微量纯化的酵母菌于装有100 μL 0.1 mol/L NaOH的灭菌PCR管中，98 ℃裂解15 min，离心后取上清DNA模板于4 ℃备用。用引物NL1（5'⁃GCA TAT CGG TAA GCG GAG GAA AAG⁃3'）和NL4（5'⁃GGT CCG TGT TTC AAG ACG G⁃3'）对相应酵母菌26S rDNA的D1/D2片段进行PCR扩增，条件为：94 ℃ 预变性2 min；94 ℃变性15 s，50 ℃延伸15 s，72 ℃退火20 s，30个循环；72 ℃ 5 min，终止反应。取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳以检测条带大小，符合条件后送测序公司，将测序结果上传至NCBI使用BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）完成与模式菌株的比对分析，一般按如下经验值判断：（1）上传序列比对的结果和近缘种的模式菌株相似率大于等于99%，可视为相同种；（2）和最近缘种的模式菌株的相似率小于98%，为疑似新种。

③ 系统发育树构建：从NCBI得到的模式菌株序列和测定的代表性菌株序列在BioEdit软件包中进行BLAST分析后，导入MEGA11软件采用Kimura2模型计算进化距离，用邻接法（Neighbor⁃Joining）构建系统发育树，进化树拓扑分析为1 000个重复取样的结果^［19］。

2 结果与分析

2.1 汾酒酿造车间和车间外环境中酵母菌的比对结果

根据酵母菌的形态特征，分离、纯化得到300株，经26S rDNA测序并在NCBI GenBank数据库检索，结果如表1所示，共鉴定酵母菌包括6科15属20种，除了从土壤中分离的一菌株外，多数序列具有99%以上的匹配率。

在汾酒酿造车间分离和鉴定的150株酵母菌都为子囊菌，含5科12属16种（图1A），包括6株玫瑰塞伯林德纳氏酵母（Cyberlindnera meyerae）、11株费比恩塞伯林德纳氏酵母（Cyberlindnera fabianii）、4株高渗汉森酵母（Hanseniaspora osmophila）、2株葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、5株伯顿丝孢毕赤酵母（Hyphopichia burtonii）、3株粉状米勒酵母（Millerozyma farinosa）、5株卡斯特利纳氏酵母（Naumovozyma castellii）、6株发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）、31株毕赤酵母、22株酿酒酵母、14株扣囊复膜酵母、19株戴尔凯氏有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）、15株异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、1株盔形毕赤酵母（Pichia manshurica）、5株热带假丝酵母（Candida tropicalis）、和1株埃切许旺酵母（Schwanniomyces etchellsii）。

在汾酒酿造车间外分离和鉴定的酵母菌包括1株担子菌和149株子囊菌，含6科13属，17种（图1B），包括1株河流红冬孢锁掷孢酵母（Rhodosporidiobolus fluvialis）、4株季也蒙有孢汉逊酵母（Hanseniaspora guilliermondii）、6株克鲁维拉钱斯氏酵母（Lachancea kluyveri）、3株三叶酵母菌（Saccharomyces mikatae）、1株佐鲁斯普尔酵母（Saturnispora zaruensis）、4株费比恩塞伯林德纳氏酵母、4株高渗汉森酵母、22株葡萄汁有孢汉逊酵母、1株伯顿丝孢毕赤酵母、4株粉状米勒酵母、7株卡斯特利纳氏酵母、13株发酵毕赤酵母、19株毕赤酵母、15株酿酒酵母、13株扣囊复膜酵母、29株戴尔凯氏有孢圆酵母和4株异常威克汉姆酵母。

经对比汾酒酿造车间和车间外环境中分离酵母菌的鉴定结果，车间内和车间外环境中分离到的酵母菌中戴尔凯氏有孢圆酵母和酿酒酵母数目较高。酿造车间的缸壁、铁锹和传送带上都分离到酿酒酵母，在地面分离到5种酵母，传送带分离到4种酵母（图2a）。在酿造车间外土壤中分离到4种酵母，榕树皮上分离到3种酵母（图2b）。仅在酿造车间内分离到玫瑰塞伯林德纳氏酵母、盔形毕赤酵母、热带假丝酵母和埃切许旺酵母；而河流红冬孢锁掷孢酵母、季也蒙有孢汉逊酵母、佐鲁斯普尔酵母、克鲁维拉钱斯氏酵母和三叶酵母仅在车间外环境中被分离到。在酿造车间的缸壁上同时分离到酿酒酵母、戴尔凯氏有孢圆酵母和卡斯特利纳氏酵母；在车间地面上分离到费比恩塞伯林德纳氏酵母、粉状米勒酵母和玫瑰塞伯林德纳氏酵母。车间外环境中6种树的树皮上面都至少分离到一种酵母菌，其中在曲房后的一棵榕树皮上，酿酒酵母和戴尔凯氏有孢圆酵母被同时分离到，在园区的一棵柳树皮上，粉状米勒酵母和卡斯特利纳氏酵母被同时分离到。在汾酒工业园区一个成熟的杏果上同时分离到葡萄汁有孢汉逊酵母、季也蒙有孢汉逊酵母和高渗汉森酵母。

2.2 汾酒厂区环境中酵母菌的系统发育树分析

根据对比所有结果和选取同源性最高的模式菌株构建系统进化树，如图3所示，汾酒环境中酵母菌分为两个大分支：担子菌门和子囊菌门，担子菌门仅有1株从人工湖中分离的河流红冬孢锁掷孢酵母。在子囊菌里面，编号为SP5⁃6的菌株与模式菌株佐鲁斯普尔酵母（CBS5799）相似度为97.8%，可能是酵母菌新种，剩下的菌株与对应模式菌株的相似度均在99%以上。通过系统发育树对汾酒（酿造车间和车间外）环境中分离出的不同类型酵母菌的种间亲缘关系进行比较直观的呈现，间接得到汾酒生境中的酵母菌不能根据位置分布进行聚类，但它有着丰富的多样性和复杂的亲缘关系，如此丰富的酵母菌资源为酵母菌的繁殖、筛选或优化酵母菌的功能研究奠定了基础。

3 讨 论

白酒的酿造环境是一个复杂的、多样的和具有地域特异性的微生态系统，该微生态系统囊括了种类丰富、数量繁多的微生物群体。近年来，随着专家和学者对白酒产区概念的重视和研究，有关白酒酿造环境微生物的研究也越来越受到重视。白酒酿造环境微生物主要是来自于原料、车间地面、器具、空气、水和土壤和厂区环境微生物等，其中酵母菌是白酒酿造过程产生乙醇的核心功能微生物。本研究探究了汾酒酿造车间和车间外环境中酵母菌的多样性，对酵母菌资源的分布和对厂区环境的微生态系统的保护有一定的指导意义。

在汾酒的酿造车间外和车间环境中，本研究鉴定到的酵母菌包括2门6科15属21种。跟其他香型白酒比，从酱香型白酒下沙至五轮次酒醅中共检出59属129种酵母菌^［20］。通过分离培养和高通量测序方法，浓香型白酒酿造环境中酵母菌的种类和多样性目前被报道的有酿酒酵母属（Saccharomyces）、德巴利酵母属（Debaryomyces）、假丝酵母属（Candida）、毕赤酵母属（Pichia）、复膜酵母属（Saccharomycopsis）、节担菌属（Wallemia）、威克汉姆酵母属（Wickerhamomyces）、乳酸克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、阿氏丝孢酵母属（Trichosporon）、少孢哈萨克斯坦酵母属（Kazachstania）、纳氏酵母属（Naumovozyma）、塞伯林德纳氏酵母属（Cyberlindnera）、树舌绪方酵母属（Ogataea）、和汉逊酵母属（Hanseniaspora）等^［21~23］。通过对汾酒酿造车间新、旧土壤中酵母菌分离培养和鉴定，发现共含有毕赤酵母属、复膜酵母属、假丝酵母属、威克汉姆酵母属、和米勒酵母属^［24］。通过对汾酒酿造车间内环境微生物进行测序分析，发现在冷散过程中来源于车间环境中的酵母菌如复膜酵母属随原料进入到酒醅发酵过程^［5］，和本研究对酿造车间和车间外环境中分离的酵母菌属有重叠。此外，汾酒发酵室的大茬和二茬成熟酒醅材料缸口地表土壤中都检测到双足囊菌科（Dipodascaceae）和毕赤科（Pichiaceae），且占比含量之和均高于13.5%^［25］。

汾酒厂区的植被比较丰富，包括多种（古老）乔木、灌木和草本等，其中树木、花、果、土壤和叶子等都可作为酵母菌生长的基质，尽管从同一种基质能够分离到多种酵母菌，但不同酵母菌选择特异的生长基质（表1），这些酵母菌特定的分布可能与酵母菌对底物的利用和生存的生境有关系。由于人类和动物的活动或多或少跟厂区的环境有相互联系，如酿酒工人去酿造车间附近汾酒工业园散步、摘果实等；汾酒厂区里的鸟类偶尔在酿造车间活动（偷吃酿造用的红糁），这些因素都能促使微生物之间的交流、外溢、迁移和繁殖。

酵母菌是白酒酿造过程中不可或缺的核心功能微生物，尽管在汾酒酿造车间和车间外环境中均分离到相同的酵母菌，但是同一种酵母菌，其野生来源和驯养来源在生理生化特性、发酵能力和抗逆性能等表型性状有较大差别^{［26，27］}，如酿酒酵母包括多个野生型谱系和多个驯养型谱系，比较基因组学得出几乎所有野生菌株是纯合体，驯养菌株是杂合体；且野生菌株几乎不能代谢麦芽糖，但大部分驯养菌株可利用麦芽糖^［26］。由此推断出酿造车间的酵母菌可能和车间外环境中的同一种酵母菌有差异，若研究它们之间的差异，需要进一步做群体遗传学和表型等分析。

总之，汾酒酿造车间和车间外环境中酵母菌种类比较丰富，多样性较高。酿造车间外环境中很多酵母菌也存在于汾酒大曲和酒醅发酵过程，这些环境来源的酵母菌可能通过某些途径，作为大曲自然接种发酵和酒醅发酵中酵母菌的重要来源。本研究通过调查汾酒酿造车间和车间外环境中酵母菌资源，可以促进对厂区酵母菌多样性的了解和掌握；为深入了解清香型白酒酿造过程中酵母菌的来源，对厂区微生物生境的保护或改造，相同酵母菌是否存在多种谱系的研究等奠定了一定的基础和依据。

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基金资助

江苏省研究生科研与实践创新计划项目(KYCX21_2585)