河川沙塘鳢繁殖期与非繁殖期种群形态差异、雌雄个体差异及遗传多样性分析

Morphological differences， individual differences between male and female， and genetic diversity analysis of reproductive and nonreproductive populations of Odontobutis potamophilus

摘要

本研究利用传统形态性状测量及框架性状分析方法研究了江苏省河川沙塘鳢繁殖期与非繁殖期种群形态特征及雌雄个体差异。结果显示，河川沙塘鳢存在形态特征的季节差异，繁殖期个体拥有相对较大的眼径、眼间距，推测与食物资源的季节性变化有关；另外，背鳍前距和胸鳍基长较长，可能因性腺发育饱满导致该时期个体腹腔容积变大。在两性特征中，两性异形指数为-0.013，表明雄鱼个体较大。雄性在尾柄高、尾鳍长等方面显著大于雌性，以此来增加竞争能力以及对后代的保护能力。雌性个体具有较大的腹腔容量，增加了繁殖输出，提高繁殖适合度。另外，本研究基于线粒体cyt b基因，84个个体共识别出17个单倍型，整体表现出具有较高的遗传多样性（h=0.892，π=0.508%），表明江苏省河川沙塘鳢群体存在丰富的线粒体DNA多态性。

Abstract

Morphological differences of Odontobutis potamophilus during reproduction and non⁃reproduction periods and the discrimination of male and female were investigated using samples collected in Jiangsu Province by traditional morphological character measurement and truss analysis methods. Results indicated that a distinct seasonal variation occurred in O. potamophilus. Individuals had larger eye diameter and interorbital width during reproduction period， which might be related to food resource availability. Individuals in this period also had larger pre⁃dorsal length and pectoral fin base length， likely associated with the increasing capacity of abdominal cavity as a result of gonadal maturity. The sexual dimorphism index was -0.013， indicating a significant sexual dimorphism in body size， with males larger than females. Males had larger caudal peduncle depth and caudal fin length than females， which could be advantageous in competition for spouses and protection of offspring. Females increased individual fecundity by increasing the capacity of abdominal cavity. Furthermore， 17 haplotypes were derived from 84 individuals of O. potamophilus based on cyt b gene analysis. High haplotype diversity and high nucleotide diversity were detected （h=0.892，π=0.508%）， suggesting that there are abundant mitochondrial DNA polymorphisms in O. potamophilus populations.

Graphical abstract

关键词

河川沙塘鳢 / 繁殖期与非繁殖期 / 形态差异 / 雌雄个体差异 / 细胞色素b基因 / 遗传多样性

Key words

Odontobutis potamophilus / reproduction and non⁃reproduction period / morphological difference / individual difference between male and female / cyt b / genetic diversity

0 引 言

河川沙塘鳢（Odontobutis potamophilus）隶属于鰕鯱鱼目（Gobiiformes）沙塘鳢科（Odontobutidae）沙塘鳢属（Odontobutis），又称土布鱼、虎头鲨等，为淡水小型肉食性底栖鱼类，分布于长江中下游及沿江各支流、钱塘江和闽江等水系^［1］。其肉质细嫩，氨基酸含量丰富，系餐桌名肴，深受江浙沪等地人们欢迎。近年来，受生态环境变化和人为过度捕捞等因素的影响，河川沙塘鳢的野生资源急剧减少，开展相关种质遗传研究对其资源保护和利用具有重要意义。另外，随着市场需求的不断增长，河川沙塘鳢已成为一个非常具有潜力的水产养殖品种^［2］。

形态特征是物种分类和资源鉴定的主要指标。传统形态测量法不能全面地利用鱼体提供的信息^［3，4］，且对种内不同地理群体的形态差异存在局限性^［5］。而框架测量法^［6］利用鱼体若干形态坐标点，比较一些关键点的位置或框架长度，较传统测量法更能准确地反映同一物种不同种群的形态差异。在鱼类的生产实践中，性别判定是进行繁殖及选育的重要基础^［7］。部分鱼类在雌、雄形态上差异显著，如马口鱼类（Opsariichthine）雄鱼在繁殖季节具有明显的婚姻色和珠星，腹鳍条和臀鳍条会显著延长^［8］；稀有 鲫（Gobiocypris rarus）的雄鱼胸、腹鳍较雌鱼更长且鳃盖、胸鳍上有细小的棘状珠星^［9］。沙塘鳢属鱼类雌、雄最显著的是繁殖期生殖突的形状，雌鱼厚而圆，呈扁管状，末梢有两个小的突起；雄鱼薄而尖，呈三角形，尖端指向后方，灰黑色^［10］。通常，鱼类形态上的雌雄差异特征仅适用于性成熟个体，且在繁殖期易于鉴别。而当雌、雄个体间无明显差异时，需解剖观察、性腺切片等进行性别判别。此法需剖杀活体，操作步骤繁琐。因此，目前通过测定大量鱼类样本的形态和框架指标来进行性别判定是一种较为有效的方法。

近年来，随着线粒体DNA研究的深入化和使用的广泛性，其作为有效的分子标记被应用于水产生物的种群遗传学、生物地理学以及保护生物学等研究^［11~13］。其中，cyt b基因进化速率适中，适合种群水平差异的检测。目前，通过cyt b基因对不同地区河川沙塘鳢种群遗传学已进行了一些研究。有学者通过对长江中下游5个湖泊的河川沙塘鳢cyt b基因的比较分析，探讨了其种群遗传多样性和进化关系^［14］。另有学者研究了浙江湖州河川沙塘鳢野生和人工繁育种群遗传多样性，并与太湖、鄱阳湖以及巢湖等3个种群的遗传结构进行了对比，为河川沙塘鳢种质资源分类评估，种群关系研究等提供了参考^［15］。

本研究利用传统测量和框架测量方法研究了河川沙塘鳢繁殖期与非繁殖期的种群形态特征以及雌雄个体差异，分别建立判别方程，并分析其形成原因。同时，基于线粒体cyt b基因分析了种群遗传多样性，为河川沙塘鳢亲本识别、种质资源保护和良种选育提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集

2021年4月在江苏省淡水水产研究所扬中基地采集河川沙塘鳢繁殖期样本46尾，其中，雌性样本23尾，雄性样本23尾；6月在南京市高淳区采集非繁殖期样本40尾，其中雌性样本17尾，雄性样本23尾（表1）。采集到的样本随即进行形态测量，并进行常规生物学解剖，目测性腺发育情况，性腺发育期的确定参照黄海研究所（1981）的六期划分标准^［16］。每个样本取适量鳍条用95%的酒精固定便于后期DNA提取。

1.2 形态测量

样本的形态测量过程中，以身体左侧特征为基准。使用传统测量性状和框架测量性状描述鱼体的外部形态。传统测量性状包括全长、体长、体高、体宽、头长、头高、头宽、口宽、口裂宽、眼后头长、眼径、眼间距、胸鳍长、腹鳍长、臀鳍长、尾柄长、尾柄高、尾鳍长。框架测量性状每个样本选取12个坐标点进行测量（图1），共测量了13个形态数据，包括AB（根据图1所示的坐标点，AB指的是A坐标点到B坐标点的直线距离）、BC、BD、BF、BG、BK、DH、EF、FG、FJ、FK、GI、KL。测量时采用电子数显卡尺进行测量，精确度为0.01 mm，使用电子天平称量体质量（g）。肥满度（condition factor，CF）=体质量（g）/体长³（cm³）×100%。两性异形指数（sexual dimorphism index， SDI）=（雌性的体长平均值/雄性的体长平均值）-1^［17］，其值为正时雌性偏大，为负时雄性偏大。

1.3 DNA提取及序列扩增测序

基因组DNA提取方法参照试剂盒（天根生化：磁珠法动物组织基因组DNA提取试剂盒）。正向引物cytb⁃F（GACCAATGACTTGAAAAACCACCG）和反向引物cytb⁃R（TAATTAAGAATTTTAGCTTTGGGAGCT）。PCR反应体系为30 μL：2×PowerTaqPCRMasterMix 15 μL，DNA模板1 μL，正反向引物（浓度10 mmol/L）各1 μL，ddH₂O 12 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。获得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，由武汉天一辉远公司完成纯化和序列测定。

1.4 数据处理与分析

利用Kolmogorov⁃Smirnov test（K⁃S test）检验原始形态数据测量值的正态性。为了消除样本大小和异速生长对形态性状的影响^［18］，对形态数据进行转换^［19］。对于转化后的数据，利用单因素方差分析（one⁃way ANOVA），2个独立样本t检验、主成分分析、判别分析等对河川沙塘鳢的形态性状差异进行分析。上述统计分析均采用SPSS 22.0软件完成。

DNA序列比对使用CLUSTALX 1.8软件^［20］，并在SEAVIEW程序^［21］中对序列进行手工调整。序列中各碱基的含量及变异情况使用MEGA 5.0^［22］软件进行分析。使用DNASP 5.10软件^［23］计算各种群及总体遗传多样性参数。

2 结果

2.1 繁殖期与非繁殖期形态分化

所有形态测量数据经转换后，与全长无显著的相关性，数据转换有效。

方差分析结果表明在河川沙塘鳢繁殖期与非繁殖期种群33个形态特征中，有18项存在显著差异（表2）。其中，繁殖期个体在空壳重、头高、头宽、眼后头长、眼径、尾柄高、BD、DH以及EF共9项形态特征中极显著大于非繁殖期个体（P<0.01）；在体宽、眼间距、胸鳍长以及FG中显著大于非繁殖期个体（P<0.05）；其余5个形态指标中，均表现为繁殖期个体小于非繁殖期个体，其中尾柄长、FJ以及FK 达到极显著水平（P<0.01），肥满度和体长达到显著水平（P<0.05）。

KMO统计量检验表明，性状变量间的偏相关性小，Bartlett球形检验（Bartlett’s test of sphericity）表明各性状变量间不独立（P<0.01）。因此，转换后的性状测量数据可以用于主成分分析。对存在差异的18个形态特征变量进行主成分分析。主成分的负荷值及方差贡献率见表3。结果表明5个主成分的累计方差贡献率为63.726%。第一主成分上有较高载荷值的主要形态特征是空壳重、肥满度、体长、体宽（解释25.078%变异）；第二主成分上有较高载荷值的主要形态特征是头宽、眼后头长、眼径、眼间距（解释13.833%变异）；第三主成分上有较高载荷值的主要形态特征是BD、DH、胸鳍长（解释10.129%变异）；第四主成分上有较高载荷值的主要形态特征是EF、FG（解释7.799%变异）；第五主成分上有较高载荷值的主要形态特征是尾柄长（解释6.887%变异）。繁殖期与非繁殖期河川沙塘鳢性状变量主成分散布图见图2a。结果显示，分散明显，但仍部分重叠，呈现混合性。

对所有数据进行逐步判别分析，依据各变量对判别模型的贡献大小逐步剔除不相关变量，最终共筛选出6个变量，分别为X₁（空壳重）、X₂（眼径）、X₃（眼间距）、X₄（BD）、X₅（EF）、X₆（FJ）。这6个形态指标反映了河川沙塘鳢繁殖期与非繁殖期个体在眼部和鳍条方面的差异，根据筛选出的6个变量所建立的典型判别模式方程为：

繁殖期：

Y_R =-7 284.364+60.200X₁+34.513X₂-161.348X₃+3 001.817X₄+599.528X₅+526.960X₆

非繁殖期：

Y_N-R =-7 251.286+68.095X₁+29.790X₂-170.492X₃+2 976.137X₄+612.190X₅+537.771X₆

判别函数的显著性检验显示P<0.01，表明判别函数达到极显著水平。分别计算出繁殖期与非繁殖期的判别分数值，得到其个体的频布图，表明该模型可以用于区分河川沙塘鳢的繁殖期与非繁殖期（图3）。表4中，判别准确率P1（%）=（某一群体的判别正确尾数/该群体的实际尾数）×100%；P2（%）=（某一群体的判别正确尾数/判入该群体的尾数）×100%；根据所建立的判别方程可以看出，判别函数与BD、EF、FJ之间的相关性比较高，这些性状主要与鳍条相关。将所有样本按照上述公式进行判别预测分析，结果显示（表4），综合判别准确率为84.9%，判别效果极其显著（P<0.01）。对用于建立判别函数的6个形态指标进行t检验，结果显示，除眼间距在繁殖期与非繁殖期个体间呈现出显著差异（P<0.05），其余5个形态指标均呈现出极显著差异（P<0.01）（表5），表明繁殖期个体拥有相对较大的眼径、眼间距以及较长的背鳍前距和胸鳍基长。

2.2 雌雄个体差异

河川沙塘鳢两性异形指数为-0.013。方差分析结果显示，33个形态数量特征中，有15项存在显著差异（表2），仅FG（P<0.05）及BK（P<0.01）表现为雌性个体大于雄性个体，其余13项均表现为雄性大于雌性。其中，空壳重、头宽、口裂宽、眼间距、臀鳍长、尾柄高、AB和KL共8项差异达到极显著水平（P<0.01）；头高、口宽、尾鳍长、BC和DH共5项差异达到显著水平（P<0.05）。

主成分的载荷值及方差贡献率见表6。前5个主成分的累计方差贡献率为64.232%。空壳重、头高、头宽在第一主成分上具有较高的载荷值（解释24.880%变异）；BC、口宽、AB以及口裂宽在第二主成分上具有较高的载荷值（解释13.085%变异）；第三主成分上有较高载荷值的主要形态特征是眼间距、DH、FG（解释11.127%变异）；第四主成分上有较高载荷值的主要形态特征是BK和臀鳍长（解释8.085%变异）；第五主成分上有较高载荷值的形态特征是尾柄高及尾鳍长（解释7.055%变异）。河川沙塘鳢雌雄性状变量主成分散布图见图2b。结果显示，分散不明显，但仍表现出分离态势。

逐步判别分析最终共筛选出5个变量，分别为X₁（空壳重）、X₂（FG）、X₃（BK）、X₄（臀鳍长）、X₅（尾鳍长），根据筛选出的5个变量所建立的典型判别模式方程为：

雌性：

Y_♀=-13 299.218-308.439X₁-169.523X₂+4 925.909X₃+1 105.086X₄+1 104.646X₅

雄性：

Y_♂=-13 327.416-294.688X₁-176.857X₂+4 899.876X₃+1 125.612X₄+1 118.347X₅

判别函数的显著性检验显示P<0.01，表明判别函数达到极显著水平。分别计算出雌雄的判别分数值，得到雌雄个体的频布图，表明该模型可以用于区分河川沙塘鳢的两性个体（图4）。将所有样本按照上述公式进行判别预测分析，结果见表7，综合判别准确率为89.5%，判别效果极其显著（P<0.01）。对用于建立判别函数的5个形态指标进行t检验，结果显示，尾鳍长和FG在雌雄个体间呈现出显著差异（P<0.05），其余3个形态指标均呈现出极显著差异（P<0.01）（表5），表明雌性个体拥有更大的胸腹腔，而雄性个体拥有相对较长的臀鳍和尾鳍。

2.3 种群遗传多样性

本研究分析了江苏省河川沙塘鳢84个个体的线粒体cyt b基因序列，对比后得到序列长度为1 140 bp。序列中无碱基的缺失或插入。所有序列的转换和颠换均未达到饱和，转换数明显大于颠换数，其平均Ti/Tv的值为3.76。序列的变异位点29个，占2.5%；其中简约信息位点25个，占2.2%。所有个体平均碱基组成分别为：T=28.1%、C=31.3%、A=26.6%、G=14.0%，其中，A+T（54.7%）含量高于G+C（45.3%），碱基组成存在强烈的偏倚，G的含量尤其在密码子第三位的含量特别的低（仅6.4%）。

所有cyt b序列中共检测到17个单倍型。整体单倍型多样性（h）和核苷酸多样性（π）分别为0.892和0.508%，表现为具有较高的遗传多样性。扬中群体与南京群体均表现为高单倍型多样性，分别为0.771和0.793；低核苷酸多样性，分别为0.195%和0.319%。基于Kimura双参数（Kimura 2⁃parameter， K2P）模型计算得到两种群间的遗传距离为0.009。

3 讨 论

3.1 繁殖期与非繁殖期种群形态差异

形态学研究是沙塘鳢属鱼类研究的重要内容之一，对于其开发利用具有重要意义。目前对于河川沙塘鳢的形态学研究主要集中在不同群体、家系间的比较。有研究分析了河川沙塘鳢4个不同地理群体的15项形态比例参数^［24］，结果表明，4个群体在形态上即相似又有一定程度的差异。近年来，也有学者对沙塘鳢雌雄的形态和生长差异进行过研究，结果证明，河川沙塘鳢的雌雄在形态特征或生长速度上都存在较大差异^{［25，26］}。

本研究对于河川沙塘鳢在繁殖期与非繁殖期各形态指标进行测定，发现不同时期种群局部特征具有差异性。方差分析结果显示繁殖期个体在包括空壳重在内的13个性状显著大于非繁殖期个体（表2），该结果提示了繁殖期个体因性腺发育饱满导致该时期个体腹部鼓且圆，腹腔容积变大，而较大的体型和腹腔为提高繁殖能力提供了可能。

通过主成分分析和判别分析可以识别出对种群间差异具有贡献的形态特征变量。繁殖期与非繁殖期存在差异的18个形态特征变量可以构建5个主成分：第一主成分主要反映了鱼类整体形态，代表鱼类对生境的适应性；第二主成分上有较高载荷值的均为头部特征，体现在摄食能力方面；第三至第五主成分均反映了鳍条的变化，代表着鱼类的游泳能力。判别分析中共提取了6个形态变量，这些特征中，与主成分分析共有的形态特征有空壳重、眼径、眼间距、BD、EF，主要反映了河川沙塘鳢头部特征变化。形态变异在头部比较常见，被认为是对摄食环境和食物网的一种适应，如丽科（Cichlidae）鱼类^［27］。研究表明，头部形态的可塑性使鱼类能够在食物来源较少的环境中较快适应以生存下来^{［28，29］}。食物资源的季节性变化可能会造成动物的形态差异，经调查发现，河川沙塘鳢非繁殖期食物资源更为丰富，种内竞争相对较小。

动物的形态结构在生命过程中是动态的。本研究结果证实河川沙塘鳢存在形态特征的季节差异，生活史不同时期物质和能量分配不同，繁殖期会投入更多的能量用于繁殖，而非繁殖期则是将更多的能量用于与繁殖无直接关系的器官的生长^［30］。另外，随着季节的更替，生境的改变也会影响生物的形态。不同季节的生态差异，包括食物和空间资源的供应、环境温度、繁殖策略、交配竞争、捕食压力以及水体环境等的变化都可能会对河川沙塘鳢的形态产生影响^［31］。

3.2 两性异形机制

鱼类普遍存在两性异形现象，主要涉及个体大小、体色等局部特征和某些身体功能方面，这些两性异形是受性选择压力、繁殖力压力、自然选择压力以及生长过程物质和能量的分配等多种选择压力的作用^{［32，33］}。个体大小异形是鱼类两性研究中最广泛的现象，其表现形式有3种：雌性大于雄性，如食蚊鱼（Gambusia affinis）^［31］；雄性大于雌性，如黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）^［34］；雌雄个体大小相似，如温州厚唇鱼（Acrossocheilus wenchowensis）^［35］。第1种类型有利于雌性提高个体生殖力，表现出生育力选择的强烈作用。第2、3种个体大小类型与雄性个体追逐配偶，提高受精和繁殖成功率有关。

河川沙塘鳢雌雄个体大小异形表现明显，两性异形指数为-0.013，指示雄鱼大于雌鱼。方差分析结果也显示了局部特征的两性异形（表2）。33个形态特征中有15项存在显著差异，仅FG和BK在雌性个体中显著大于雄性个体，其余形态指标如空壳重、头高等均表现为雄性个体显著大于雌性个体。该结果提示雌性个体拥有较大的胸腔容积，由于雌性对繁殖投入的能量远远大于雄性，所以繁殖力选择压力主要作用于雌性个体，驱使其向大腹腔大容纳量方向进化，通过腹腔容积的增加，提高个体的怀卵数量，从而增加雌性个体的生育力；而性选择压力主要作用于雄性个体，能够促使其个体形态和行为的变化，从而获得更多的交配机会，如较大的头部和其他如鳍等器官对于雄性个体的食物资源、社群地位等可能有积极作用^［36］。因此可以认为，性选择和繁殖力选择是驱动河川沙塘鳢两性异形进化的主要力量。

主成分分析结果同样构建了5个主成分：第一及第二主成分上具有较高载荷值的均为头部特征，尤其是强调了吻部的变化，代表了鱼类的摄食能力；其余三个主成分主要反映了鳍条的变化，代表着鱼类的游泳能力。判别分析中共提取了5个形态变量，在主成分分析中均有体现，主要反映了河川沙塘鳢的腹部特征以及鳍条的变化，这与方差分析结果一致。

通过形态特征对比、主成分分析、判别分析表明，河川沙塘鳢存在显著的两性异形，雄性个体在体长和体重方面均大于雌性个体。有研究表明，雄性典型的筑巢、护巢和孵卵行为是促使雄性个体显著大于雌性的重要影响因素。因此，当存在雄性护卵、一雄多雌的交配体制现象时，雄性为提高竞争力、交配成功率和对后代的保护，便形成大个体^［37］。沙塘鳢属鱼类自然孵化率和仔鱼成活率并不高，雄性沙塘鳢有明显的营巢和护卵行为（包括驱赶敌害、清除杂物、激起水流进行孵化），雄鱼护卵显著提高卵的孵化率和降低水霉病的感染率，且有明显的的一雄多雌现象^［38］。另外，本研究结果表明河川沙塘鳢两性局部特征差异显著，雄性个体在尾柄高、尾鳍长等方面显著大于雌性个体，鱼尾的形状会影响鱼类的运动形式、速度以及捕食的战略^［39］，雄鱼尾柄越大，运动能力和护巢能力越强，后代成活率就可能越高。雌性个体较雄性个体粗短，具有较大的腹腔容量，表明雌鱼为获得更大的怀卵量而演化出更大的腹腔。空壳重的反差表明了雌雄两性个体用于生长和繁殖的物质和能量分配上的差异，雌性更多地用于繁殖，雄性更多地用于个体的生长。

3.3 种群遗传多样性

遗传多样性是生物多样性的基础，是物种长期生存和进化的前提，也是评估生物资源现状的一个重要参数。物种遗传多样性最直接的表达方式就是遗传变异的大小，一个种群的遗传多样性越高或者遗传变异越丰富，表明对环境变化的适应能力就越强，越容易扩展其分布范围和开拓新的环境^［40］。因此，遗传多样性是遗传选育的考量依据。单倍型多样性（h）和核苷酸多样性（π）是衡量一个物种种群遗传多样性的重要指标^［41］。有学者基于线粒体D⁃loop基因序列对于河川沙塘鳢5个地理种群遗传多样性进行分析，结果显示，河川沙塘鳢具有高的单倍型多样性以及较低的核苷酸多样性^［42］。

本研究中基于线粒体cyt b基因序列，江苏省河川沙塘鳢84尾个体共识别出17个单倍型，整体表现出具有较高的遗传多样性（h=0.892，π=0.508%），表明江苏省河川沙塘鳢群体存在丰富的线粒体DNA多态性，符合小型鱼类种群数量大、遗传多样性丰富的特点。扬中群体与南京群体的单倍型多样性分别为0.771和0.793，核苷酸多样性分别为0.195%和0.319%，与同省其他地区河川沙塘鳢比较（大纵湖：h=1.000，π=0.148%；固城湖：h=0.947，π=0.175%）^［14］，均表现为单倍型多样性较高，核苷酸多样性较低。目前这种高h、低π的特征，可能是群体受到瓶颈效应后种群迅速扩张导致的结果，因为核苷酸的积累时间比单倍型多样性的积累时间要漫长的多，亦有可能是种群进化历史很短的原因^［43］。另外，基于K2P模型计算得到两种群间的遗传距离较小，本研究中两个群体均来自江苏省相邻水系，容易发生临近水域间的迁徙，造成种群间的交流，而河川沙塘鳢繁殖力较小，参与繁殖的个体相对较多，因此形成了较高的多态性。本研究将为河川沙塘鳢的遗传资源评估、物种保护、科学选育以及可持续利用等工作提供遗传数据信息。

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基金资助

湖北省重点研发计划(2022BBA009)

湖北省农业事业发展中心项目(鄂农发计发〔2022〕1号)

武汉市农科院2023年创新体系学科创新项目(XKCX202303-3)