海南岛4条河流李氏吻虾虎鱼的群体遗传结构分析

Analysis of population genetic structure of Rhinogobius leavelli （Herre，1935） in four rivers of Hainan Island

摘要

海南岛众多独立入海的河流形成天然的生物地理屏障，造就了海南丰富的淡水鱼类资源。李氏吻虾虎鱼〔Rhinogobius leavelli （Herre，1935）〕因利用价值低而未被人工大量养殖驯化，可作为评估鱼类遗传多样性的理想物种。本文基于COX1和D⁃loop分子标记，分析了海南岛南渡江、珠碧江、三亚河和陵水河等4条河流中李氏吻虾虎鱼的种群遗传结构。遗传多样性分析显示，4条水系中43尾李氏吻虾虎鱼COX1、D⁃loop及联合基因中分别检测出8、14、22个变异位点和6、7、8个单倍型，平均单倍型多样性和核苷酸多样性分别是0.617、0.647、0.649和0.003 9、0.009 4、0.006 3，其中三亚河与陵水河种群的遗传多样性均较高。系统发育树结果均显示，李氏吻虾虎鱼4个水系的5个地理种群聚类为2个进化分支，其中三亚河与陵水河种群聚为一支，南渡江、珠碧江种群聚为一支。遗传距离分子方差分析显示，李氏吻虾虎鱼群体的遗传变异主要来自种群间。上述结果表明，海南岛李氏吻虾虎鱼表现出显著的遗传分化，遗传多样性水平较高，可能因不同水系的隔离效应和李氏吻虾虎鱼较弱的迁移能力导致其种群间的遗传分化，本文为海南岛河流生态系统中鱼类种质资源多样性的研究提供遗传学参考。

Abstract

Numerous independent rivers form a natural biogeographical barrier， creating rich freshwater fish resources in Hainan Island. R. leavelli has not been domesticated in large numbers because of its low utilization value， so it can be used as an ideal species to evaluate the genetic diversity of fish. Based on COX1 and D⁃loop molecular markers， the population genetic structure of R. leavelli in Nandujiang， Zhubijiang， Sanyahe and Linshuihe rivers was analyzed. Genetic diversity analysis showed that 8， 14， 22 variation sites and 6， 7， 8 haplotypes were detected respectively in COX1， D⁃loop and combined genes of the 43 R. leavelli in four rivers， and the average haplotype diversity and nucleotide diversity were 0.617， 0.647， 0.649 and 0.003 9， 0.009 4， 0.006 3， respectively. The genetic diversity of Sanyahe and Lingshuihe populations was higher than other pupulations. Phylogenetic tree analysis indicated that the 5 populations of 4 rivers clustered into 2 evolutionary branches， among which the populations of Sanyahe and Lingshuihe rivers clustered together and the populations of Nandujiang and Zhubijiang rivers clustered together. Analysis of molecular variance showed that the genetic variations of R. leavelli in 4 rivers mainly occured between populations. The above results indicate that the genetic differentiation of R. leavelli in Hainan Island is significant and the level of genetic diversity is high， which may be caused by the isolation effect of different water systems and the weak migration ability of R. leavelli. This paper provides a genetic reference for the study of fish genetic diversity in the river ecosystem of Hainan Island.

Graphical abstract

关键词

海南岛 / 李氏吻虾虎鱼 / 遗传多样性 / 遗传结构

Key words

Hainan Island / Rhinogobius leavell / genetic diversity / genetic structure

0 引 言

海南省位于中国南部，基于中部高凸四周低平的地形，海南岛众多河流均起源于中南部五指山、鹦哥岭、黎母岭，154条独立入海河流密布成网呈辐射状汇入南海，形成天然生物地理屏障^［1，2］。其中珠碧江水系发源于白沙黎族自治县七坊镇，于儋州市海头镇海头港注入北部湾；陵水河发源于保亭县什玲镇，于陵水县椰林镇汇入南海^［5］；三亚河发源于三亚市天涯区抱龙林场，于吉阳区入海；南渡江发源于昌江县王下乡霸王岭，于海口市灵山镇流入琼州海峡^［3~8］。这4条水系均属于独立入海河流，且拥有不同的发源地，是相对独立的河流。海南岛众多河流较短，多样的水环境孕育了丰富的小型淡水鱼类资源，这无疑为河流生态系统的生物多样性奠定了基础。鱼类遗传多样性的评估和遗传结构的分析不仅广泛应用于鱼类的科学增殖放流^［9~11］，也用于鱼类种质遗传资源保育及其生物多样性的研究^［12~14］。群体间的地理隔离是影响物种遗传分化以及进化为新物种的关键因素之一^{［15，16］}，有研究显示海南岛中南部山脉阻碍着鱼类的基因交流，使山脉两侧的鱼类群体形成不同的遗传谱系^{［17，18］}。近年来，母系遗传的线粒体DNA分子标记COX1、D⁃loop、Cytb等已被大量应用于谱系生物地理学、群体遗传及分子系统学中种群遗传结构、物种亲缘关系、历史种群动态等的研究^［19~23］ 。

李氏吻虾虎鱼（Rhinogobius leavelli）属于鲈形目（Perciformes）虾虎鱼科（Gobiidae）吻虾虎鱼属（Rhinogobius），在中国主要分布于钱塘江以南及海南各水系，栖息于淡水溪流中，是暖水性小型底层鱼类；其体型较小，繁殖力和适应性较强，体前部近圆筒形，后部侧扁，头体浅灰色或暗灰色^［24］。李氏吻虾虎鱼因经济价值低而未被人工大量养殖驯化，可作为评估鱼类遗传多样性的理想物种。本文基于COX1和D⁃loop分子标记，分析了海南岛不同隔离河流中李氏吻虾虎鱼的遗传结构，为海南岛河流生态系统中鱼类种质资源多样性的研究和评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究区域及采样点设置

研究所用的43尾李氏吻虾虎鱼样本采集于海南岛5个不同的地理种群，属于4条河流（图1）。三亚河种群位于海南岛南部，陵水河种群偏向于海南岛东南部，南渡江琼中阳江种群位于海南岛中部，珠碧江的南达村种群地理位置靠近珠碧江上游，合水村种群位置人类活动较为频繁，5个种群具有较好的代表性。

1.2 样本采集

本研究使用手抄网等工具进行李氏吻虾虎鱼样本采集，其平均体长约4.2 cm，采样信息如表1所示。

1.3 DNA提取、扩增与测序

选用采集好的鱼鳍组织，使用天根海洋动物基因组试剂盒进行DNA的提取，提取后的DNA放于-20 ℃备用。COX1基因扩增引物COIF1/R1是鱼类通用引物^{［25，26］}：COIF1：5'⁃TTCTCCACCAACCACAARGAYATYGG⁃3'，COIR1：5'⁃CACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA⁃3；D⁃loop基因的扩增引物^［27］：D⁃LoopF：5'⁃CCCATCTCTAGCTCCCAAAGC⁃3'，D⁃LoopR：5'⁃CTGTAGAGTGAACGCTTGGCATG⁃3。COX1和D⁃loop基因PCR反应总体系为50 μL，其中Premix Taq 25 µL，10 µmol/L的上下游引物各2 µL，DNA模板50 ng，无菌ddH₂O补足50 µL。COX1扩增反应条件为：94 ℃预变性3 min，1个循环；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环，72 ℃延伸10 min； D⁃loop扩增反应条件为：94 ℃预变性1 min 20 s，94 ℃变性30 s， 54 ℃退火30 s， 72 ℃延伸50 s，循环35次，72 ℃ 10 min^［28］，扩增产物4 ℃保存，反应产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送青岛华大基因公司测序。

1.4 数据分析

经过双向测序获得的原始数据通过Contigexpress软件校正拼接；使用MEGA.11.0软件进行序列比对，分析序列中各碱基含量及变异情况、并采用Kimura双参数模型计算转换/颠换比率、计算群体内和群体间的遗传距离，Genbank数据库中下载进化树外群序列，构建邻接系统树（neighbor⁃joining tree），系统树各分支的置信度由Bootstrap 1 000次循环检验；利用DnaSP 5.1^［29］软件检测序列的多态性位点、核苷酸多样性、单倍型多样性；利用NETWORK5.0^［30］软件构建单倍型的网络关系图，分析单倍型之间的进化关系；遗传分化指数（Fst）常被用于评估群体之间的遗传分化程度，大于0.25则表明种群间具有显著的遗传分化，利用Arlequin3.5的分子方差分析模块，估算遗传变异在种群间和种群内的分布及遗传分化系数（Fst），并进行错配分析及Tajima’s D和Fu’s Fs的中性检验计算^［31~33］。

2 结果与分析

2.1 碱基组成和遗传变异

序列进行拼接和校对后，李氏吻虾虎鱼线粒体COX1基因全长662 bp，A、T、C、G四种碱基平均含量分别为21.9%、28.5%、30.8%和18.8%，检测出8个变异位点，所有序列转换颠换比（Ts/Tv）的平均值为4.2；D⁃loop基因全长478 bp，基因序列中A、T、C、G四种碱基平均含量分别为29.8%、31.0%、22.7%和16.5%，变异位点14个，转换颠换比的平均值为15.3；COX1和D⁃loop的联合基因片段（COX1+D⁃loop） DNA序列总长度为1 140 bp，A、T、C、G四种碱基平均含量分别为25.2%、29.6%、27.4%和17.8%，变异位点22个，所有序列转换颠换比的平均值为8.5。李氏吻虾虎鱼（A+T）的含量高于（C+G）的含量，且表现出明显的低G碱基含量，这与其他鱼类线粒体基因A、T含量高，G、C含量低的特点相似^［21］。

2.2 群体遗传多样性

基于COX1、D⁃loop、COX1+D⁃loop基因序列，5个地理种群43尾李氏吻虾虎鱼分别检测出6、7、8个单倍型（haplotype），其中三亚河扎浩村种群的单倍型多样性指数最高，分别为0.773、0.773、0.867，该种群的核苷酸多样性指数也是最高，分别为0.001 3、0.001 9、0.001 6；陵水河巴村种群仅次于三亚河扎浩村种群，单倍型多样性指数分别为0.154、0.500、0.500；核苷酸多样性指数分别为0.000 2、0.001 4、0.000 9。然而珠碧江和南渡江两个水系3个种群均共享且仅有一个单倍型，其单倍型多样性和核苷酸多样性指数均为0.000。李氏吻虾虎鱼不同种群遗传多样性参数见表2，两个单基因和联合基因片段分析所得的结果是一致的。

2.3 群体遗传差异

基于COXI基因序列的遗传距离分析显示，李氏吻虾虎鱼种群间遗传距离为0~0.007 7，其中陵水河巴村与南达村、合水村、阳江农场3个种群之间的遗传距离最大；基于D⁃loop基因序列的遗传距离分析显示，李氏吻虾虎鱼种群间遗传距离为0~0.026 5，其中三亚河扎浩村种群与其他种群之间的遗传距离最大；基于联合基因序列的种群间遗传距离与D⁃loop基因分析结果一致，结果见表3（对角线下）。基于联合基因片段的海南岛李氏吻虾虎鱼不同群体间的遗传分化系数见表3（对角线上），其中三亚河与陵水河之间的遗传分化系数为0.871 0；三亚河与珠碧江、南渡江水系种群之间的遗传分化系数最大，在0.946 5~0.961 4之间，接近于1，有分化形成亚种的可能。

分子变异方差分析结果显示，李氏吻虾虎鱼群体的遗传变异主要来自不同地理种群间，种群间的变异（95.01%、92.97%、92.72%）远大于种群内（4.99%、7.03%、6.28）的变异，显著性检验为极显著（P<0.001）（表4）。结果说明海南岛4条水系中李氏吻虾虎鱼存在极显著的种群遗传结构差异和高水平的遗传分化。

2.4 系统进化关系和单倍型网络图

基于COX1、D⁃loop、COX1+D⁃loop单倍型基因序列构建李氏吻虾虎鱼的系统发育树，结果均显示，李氏吻虾虎鱼的5个地理种群分化为2个分支（图2），即分支Ⅰ和分支Ⅱ。分支Ⅰ包含了珠碧江南达村种群、合水村种群以及南渡江阳江农场种群；分支Ⅱ包含了三亚河扎浩村种群和陵水河巴村种群。基于联合基因的进化树（图2C），分支Ⅱ中三亚扎浩村单倍型（H5~H8）和陵水巴村（H1~H3）两个种群按照水系不同明显的聚为2个分支，形成姐妹群。

单倍型进化网络图（图3）与系统树所反映的进化关系大体一致。不同的是进化树分支Ⅱ中三亚河扎浩村和陵水河巴村两个种群各单倍型按照水系形成了比较明显的地理分布格局。此外基于COX1序列的单倍型进化网络图中，三亚河扎浩村种群单倍体（H5）位于中央，与其他种群共享单倍体，推测其可能为原始单倍型。基于Cytb和联合基因序列的单倍型进化网络地理分布格局不明显，且无明显进化网络中心，多个单倍型通过缺失的中间单倍型连接，可能与选择的种群数量和样本量较少有关（图3）。

将海南岛4条水系5个种群作为一个整体，对李氏吻虾虎鱼进行种群错配分析及中性检验（表5）。错配分析发现，李氏吻虾虎鱼SSD检验均不显著（P>0.05），表明李氏吻虾虎鱼未偏离原假设（种群扩张模型），即海南岛李氏吻虾虎鱼可能经历过种群的近期扩张。中性检验也是判断种群在其历史上是否发生扩张的一种检验方法^［30］，李氏吻虾虎鱼的Tajima’s D和Fu’s FS中性检验P值均不显著，不具备生物统计学意义。

3 讨 论

遗传多样性水平是评估生物资源现状的一个重要参数，遗传多样性越高，则对环境的适应能力和生存竞争力就越强^［21］。基于COX1、D⁃loop、联合基因的遗传多样性分析显示，海南岛三亚河扎浩村、陵水河巴村两个种群李氏吻虾虎鱼具有较高的单倍型多样性，19尾样本中分别检测出5、6、7个单倍型，其中三亚河扎浩村种群的单倍型多样性和核酸多样性最高，分别为0.773、0.773、0.867，可能与其较强的生存适应能力及稳定的有效种群大小有关。然而珠碧江和南渡江两个水系的三个种群24尾样本中却仅检测出1个单倍型（H5），多样性指数均为0.000，增加样本量可对这两条水系中李氏吻虾虎鱼的遗传多样性进一步验证。本研究支持李氏吻虾虎鱼群体间具有显著的遗传分化。首先，基于不同遗传标记构建的系统进化树中4条水系5个地理种群分化为2个进化分支；其次，遗传距离分析、分子变异方差分析及遗传分化系数均有效证实李氏吻虾虎鱼呈现出显著的种群遗传结构和高水平的遗传分化，且主要发生在三亚河扎浩村种群与其他种群之间（表2~4）。

本研究中，李氏吻虾虎鱼种群间的变异远大于种群内的变异，是引起群体总变异的主要因素。这与基于COI序列的矛尾复虾虎鱼（Synechogobius hasta）5个野生群体的遗传多样性分析结果一致^［34］，与基于COI和D⁃loop对湖栖鳍虾虎鱼（Gobiopterus lacustris）遗传变异的研究结果^［35］不同。李氏吻虾虎鱼属于小型淡水鱼类，据有关学者提出^{［32， 36，37］}，相对于运动能力较强的大型鱼类而言，活动能力较弱的鱼类（例如一些小型底栖鱼类）更易受生境隔离效应的影响。本文中李氏吻虾虎鱼三亚河种群和陵水河种群位于海南岛南部或东南部，而南渡江种群和珠碧江种群位于海南岛中部偏北，可能中部山脉的地理隔离是导致底层溪流鱼类李氏吻虾虎鱼出现种群遗传分化的原因之一。这也与关于海南岛中南部山脉阻碍鱼类基因交流的研究结果^{［17，18］} 以及关于南盘江破碎生境的生殖隔离对子陵吻虾虎鱼遗传结构的分析^［32］一致。此外，本研究4条河流同在一个岛屿，历史时期水位的高低变化造成鱼类种群扩散和隔离，可能也是导致海南岛李氏吻虾虎鱼不同地理种群间的遗传分化的原因之一。

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基金资助

海南省重点研发计划(ZDYF2023SHFZ132)

海南省重点研发计划(ZDYF2021XDNY299)

海南省自然科学基金高层次人才项目(323RC554)