硝磺草酮、铜单一和复合胁迫对苦草的生长及生理的影响

Effect of single and combined stress of mesotrione and copper on the growth and physiology of Vallisneria natans

摘要

农药与重金属是水体中常见的污染物，其在水环境中的污染问题已引起全社会的广泛关注。目前关于农药硝磺草酮与铜的研究主要集中在动物与浮游植物上，对大型水生植物的研究较匮乏。为了阐明水体中常见毒性污染物硝磺草酮与铜对水生植物的潜在毒性作用，本研究探究了二者对长江流域的优势种苦草（Vallisneria natans）的生长及生理影响，旨在为水生植物复合污染的生态毒性效应和生态安全评估提供依据。本研究采用水培法，研究了不同浓度硝磺草酮（0、0.01、1、10、20、50 mg/L）、铜（0、0.1、0.3、0.5、1、2 mg/L）以及（硝磺草酮+铜）在（0+0、0.01+0.1、1+0.3、10+0.5、20+1、50 mg/L+2 mg/L）浓度时对苦草的相对生长率、光合色素（叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素）、抗氧化酶〔超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、过氧化物酶（peroxidase， POD）、过氧化氢酶（catalase， CAT）〕以及可溶性蛋白含量变化的影响。结果显示，单一硝磺草酮对苦草的生长和光合色素的合成、CAT活性和可溶性蛋白含量具有抑制作用，而对苦草POD活性具有激活效应；单一铜胁迫对苦草生长、光合色素的合成、CAT活性以及可溶性蛋白含量具有显著抑制作用，而对苦草SOD和POD活性具有激活效应；此外，苦草的相对生长率、光合色素、可溶性蛋白含量、CAT活性等指示物对硝磺草酮与铜联合胁迫表现出受害响应，而POD活性显著上升，SOD活性呈现低浓度抑制高浓度促进效应。毒性效应评估结果显示，随着复合胁迫浓度的升高，硝磺草酮和铜对苦草的联合毒性由拮抗作用转为协同作用。硝磺草酮与铜在水体中赋存可能对水生植物产生潜在的生物安全风险，因此要更加关注水体中不同污染物之间综合效应的防治。

Abstract

Pesticides and heavy metals are common pollutants in water. Their pollution in the water has aroused widespread concern in the whole society. At present， the researches on the mesotrione and copper focus on animals and phytoplankton， and the researches on large aquatic plants are scarce.In order to elucidate the potential toxic effects of common aquatic pollutants， mesotrione and copper， on aquatic plants， this study investigated their impact on the growth and physiological responses of Vallisneria natans， a dominant species in the Yangtze River basin. The aim was to provide insights for the ecological toxicity effects and ecological safety assessment of compound pollution on aquatic plants. Hydroponic experiments were conducted to assess the effects of different concentrations of mesotrione （0.01， 1， 10， 20， 50 mg/L）， copper （0.1， 0.3， 0.5， 1， 2 mg/L）， and （mesotrione + copper） （0+0， 0.01+0.1， 1+0.3， 10+0.5， 20+1， 50 mg/L+2 mg/L） on Vallisneria natans. Parameters studied included relative growth rate （RGR）， photosynthetic pigments （chlorophyll a， chlorophyll b， carotenoids）， antioxidant enzymes （SOD， POD， CAT）， and soluble protein content. Mesotrione exhibited inhibitory effects on the growth and photosynthetic pigment synthesis， CAT activity， and soluble protein content in Vallisneria natans， while activating POD activity. Single copper stress significantly inhibited growth， photosynthetic pigment synthesis， CAT activity， and soluble protein content， while activating SOD and POD activities. The combined stress of mesotrione and copper induced adverse responses in terms of RGR， photosynthetic pigments， soluble protein content， and CAT activity in Vallisneria natans. Notably， POD activity increased significantly， whereas SOD activity displayed a concentration⁃dependent inhibitory effect at low concentrations and a stimulating effect at high concentrations. Toxicity assessment revealed that with an increase in the concentration of combined stress， the joint toxicity of mesotrione and copper shifted from antagonistic effect to synergistic effect. The coexistence of mesotrione and copper in aquatic ecosystems may pose potential biological risks to aquatic plants. Therefore， greater attention should be paid to the prevention and control of the combined effects of different pollutants in aquatic environments.

Graphical abstract

关键词

硝磺草酮 / 铜 / 苦草 / 胁迫 / 生理响应

Key words

mesotrione / Cu / Vallisneria natans / stress / physiological response

0 引 言

硝磺草酮是一种新型的、极具发展前景和竞争力的选择性除草剂^［1］。硝磺草酮能够干扰叶绿素合成和光合作用，导致植物白化和死亡^［2］。近年来，中国有大量注册的三酮类除草剂出现，其种类数远高于除有机磷除草剂草甘膦异丙胺盐和草甘膦以外的其他除草剂^［3，4］。硝磺草酮的田间施药浓度为0.04 mol/L（约13.57 mg/L）^［5］，水中检测浓度为0.69 μg/L~1.11 mg/L^［6］。硝磺草酮在水中稳定，不易光解，在水中半衰期可达84 d^［7］。因此，硝磺草酮有造成地下水和地表水污染的风险。然而，尚未有研究对硝磺草酮对地表水和地下水污染的环境风险评价，对水生生物毒理学效应的相关研究和报道也很少。

铜污染是目前最严重的重金属污染之一。铜是植物生长发育的必需微量营养素，参与植物的光合作用、呼吸、叶绿素和蛋白质合成等多种代谢途径^［8］。但过量的铜会对植物产生毒性影响，导致生长迟缓^［9］。有研究发现，铜离子能够增强黑藻（Hydrilla verticillata）细胞膜的通透性，刺激脂质过氧化^［10］。且铜可以特异性地改变水稻根系参与囊泡运输和脂肪酸代谢等生理过程的基因水平^［11］。铜可导致植物中活性氧（ROS）的积累和激活^［12］。铜通过食物链的积累和传播将进一步威胁动物和人类健康^［13］。

水生植物在水生生态系统中扮演主要生产者的角色，其分布广泛，通常可以用来评估水污染情况并作为水体修复的标志物^［14］。苦草（Vallisneria natans）是水鳖科（Hydrocharitaceae）苦草属（Vallisneria）多年草本植物，是长江流域的优势物种之一，适应性强，作为底栖水生植物，对水污染的修复起着重要作用^［15］。然而，铜和硝磺草酮的同时存在，增加了它们面临的联合污染风险。为此，本研究对苦草在硝磺草酮、铜及其复合胁迫下的生长、生理生化变化进行了初步研究。目的一是研究硝磺草酮与铜对苦草的生长及生理（MDA、H₂O₂、抗氧化酶、光合色素、可溶性蛋白等）的影响；二是评估硝磺草酮与铜二者对苦草的毒性互作模式。本研究将为重金属和农药的污染控制提供参考，并为水生植物复合污染的生态毒性效应和生态安全评估提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与实验设计

本实验材料苦草采集于湖北省武汉市东湖（30°54′N，114°35′E）。在正式实验之前，用流动的水冲洗收集到的苦草，以去除其表面附着物和枯萎的叶子。然后在2 L白色塑料桶中用10%Hoagland营养液培育和驯化7 d。在驯化和随后的暴露实验中，植物在（26±2） °C、12 h/12 h的光/暗循环和30~40 μmol/m²/s的光子通量密度下生长。本实验中采用的硝磺草酮是来自毕得医药的原药粉剂［CAS：104206⁃82⁃8］，纯度98.29%，铜来自于中国国药集团化学试剂有限公司生产的CuSO₄·5H₂O（Ⅱ）［CAS：7758⁃99⁃8］，纯度≥99.0%。选用不分株的均匀植物进行暴露试验。硝磺草酮的浓度基于环境相关浓度、硝磺草酮田间施药量设计。铜的浓度是根据国家对各种水体的排放标准设定。将苦草暴露于不同浓度的硝磺草酮（0、0.01、1、10、20和50 mg/L）、铜（0、0.1、0.3、0.5、1和2 mg/L），以及硝磺草酮+铜（0+0、0.01+0.1、1+0.3、10+0.5、20+1、50 mg/L+2 mg/L）的联合处理组，每个处理重复3次^{［16，17］}。在培养基中按设定浓度加入硝磺草酮和铜，然后将植物移植到完全混合的培养基中。为了保持桶内营养液和毒素的浓度，每48 h更换一次溶液，并在暴露14 d后收集植物。收集的植物用蒸馏水洗涤，在滤纸上干燥，并用于测定各种指标。

1.2 生长指标测定

在实验前测定苦草的初始鲜重。将植物暴露于硝磺草酮和铜的混合物中14 d后收获。滤纸充分干燥后，通过电子分析天平（精度0.1 mg）测量每株植物的鲜重，并根据以下公式计算相对生长率（RGR）。

\mathrm{R}\mathrm{G}\mathrm{R}=\left(\mathrm{l}\mathrm{n}F{W}_f-\mathrm{l}\mathrm{n}F{W}_i\right)\times ∆t

F{W}_f：植物的初始鲜重（g）；F{W}_i：收获时植物的鲜重（g）；∆t：植物在溶液中的处理时间（d）。

1.3 光合色素含量测定

本研究采用乙醇提取光合色素。提取大小相近的鲜嫩苦草叶片0.05 g，切碎，用5 mL 95%乙醇在黑暗条件下提取48 h，直至其完全褪色变白。使用MAPADA UV⁃1200分光光度计在470 nm、649 nm和665 nm处测量光密度。色素含量的计算基于Lichtenthaler的方法^［18］。公式如下：

\mathrm{色素}\mathrm{含量}\left(\mathrm{m}\mathrm{g}/\mathrm{g}\right)=\left(C\times V\times N\right)\times {(m\times \mathrm{1}\mathrm{000})}^{-\mathrm{1}}

C_a=\mathrm{13.95}\times A_{\mathrm{665}}-\mathrm{6.88}\times A_{\mathrm{649}}

C_b=\mathrm{24.96}\times A_{\mathrm{649}}-\mathrm{7.32}\times A_{\mathrm{665}}

C_c=\frac{\mathrm{1}\mathrm{000}\times A_{\mathrm{470}}-\mathrm{2.05}\times C_a-\mathrm{114.8}\times C_b}{\mathrm{245}}

C，色素的质量浓度（mg/L）；V，提取液的体积（mL）；N，稀释比；m，样品质量（g）；C_a：叶绿素a质量浓度（mg/L）；C_b：叶绿素b质量浓度（mg/L）；C_c：类胡萝卜素质量浓度（mg/L）。A₄₇₀、A₆₄₉、A₆₆₅分别代表470 nm、649 nm、665 nm下的吸光值。

1.4 膜脂过氧化测定

采用硫代巴比妥酸（TBA）^［19］比色法测定MDA含量。称取0.1 g干燥的苦草叶片，放入匀浆器中，加入3 mL 10%TCA，研磨至匀浆中。将匀浆以4 000 g离心10 min，上清液作为样品提取物。吸取上清液1.5 mL，加入0.6%TBA溶液1.5 mL，搅拌均匀，在沸水浴中反应10 min，快速冷却并离心（4 000 g，10 min）。取上清液，在450 nm、532 nm和600 nm处测量光密度。计算公式如下：

\mathrm{M}\mathrm{D}\mathrm{A}\mathrm{含量}\left(\mathrm{\mu }\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}/\mathrm{g}\right)=C\times V\times W^{-\mathrm{1}}

C=\mathrm{6.45}\left(A_{\mathrm{532}}-A_{\mathrm{600}}\right)-\mathrm{0.56}\times A_{\mathrm{450}}

C，MDA浓度（μmol/L）；V，提取液的体积（mL）；W，植物组织鲜重（g）；A₄₅₀、A₅₃₂、A₆₀₀分别代表450 nm、532 nm、600 nm下的吸光值。

1.5 抗氧化酶活性测定

称取0.1 g苦草鲜叶放入预冷匀浆器中，加入4 mL PBS磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.8，含1%PVP），将研磨液在4 ℃条件下离心（12 000 g，10 min），取3 mL上清液储存在冰箱（4 ℃）中，用于测定SOD、CAT、POD活性。通过硝基蓝四唑（NBT）光化学还原法测定SOD活性^［19］。SOD活性可以通过改变混合物中蓝色甲基腙的含量来计算。酶活性单位被定义为抑制50%NBT的减少所需的酶的量。混合反应后在560 nm处测量吸光度值，并根据下式计算SOD活性：

\mathrm{S}\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{活性}\left(\mathrm{U}/\mathrm{g}\right)=\left(A_{\mathrm{0}}-A_{\mathrm{1}}\right)\times V_T\times (\mathrm{0.5}{A}_{\mathrm{0}}\times W\times V_a{)}^{-\mathrm{1}}

A₀，光对照管在560 nm处的光密度；A₁，样品管560 nm处的光密度；V_T，样品溶液的总体积（mL）；V_a，测定过程中吸收的体积（mL）；W，植物组织鲜重（g）。

本实验采用分光光度法测定CAT活性^［19］。CAT能分解过氧化氢，过氧化氢在波长240 nm处有很强的吸收。根据吸光度值的变化率，可以测定CAT活性。将含1.5 mL磷酸盐缓冲液（0.2 m， pH 7.8，含1% PVP）、0.2 mL粗酶提取物、1 mL蒸馏水的反应混合物预热至25 ℃。每管加入0.3 mL H₂O₂溶液（0.1 mol/L），加管后立即计数，快速倒入石英试管中，在波长240 nm处测量吸光度，每分钟读取一次（共4 min）。一个酶活性单位定义为240 nm处吸光度在1 min内降低0.1。CAT活性计算公式如下：

\mathrm{C}\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{活性}\left(\mathrm{U}/\mathrm{g}\right)=\frac{\mathrm{\Delta }{A}_{\mathrm{240}}\times V_T}{\mathrm{0.1}\times W\times V_s\times T}

△A₂₄₀，反应时间内吸光度变化；W，植物鲜重（g）；V_T，酶提取物的总体积（mL）；V_S，用于测定的酶溶液的体积（mL）：T，反应时间（min）。

采用愈创木酚法测定POD活性^［20］。取50 mL磷酸盐缓冲液（0.1 mmol/L pH 6.0）于烧杯中，加入28 μL愈创木酚。加热并搅拌至溶解。冷却后，加入30% H₂O₂ 19 μL。作为反应混合物，4 ℃保存备用。反应体系：反应混合物3.0 mL，磷酸盐缓冲液0.9 mL，酶液0.1 mL。以空白为对照，测定470 nm光密度值。单位POD活性定义为在470 nm处1 min吸光度变化0.01。计算公式如下：

\mathrm{P}\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{活性}\left(\mathrm{U}/\mathrm{g}\right)=\frac{\mathrm{\Delta }{A}_{\mathrm{470}}\times V_T}{\mathrm{0.01}\times W\times V_s\times T}

△A₄₇₀，反应时间内吸光度变化；W，植物鲜重（g）；V_T，酶提取物的总体积（mL）；V_S，用于测定的酶溶液的体积（mL）；T，反应时间（min）。

1.6 可溶性蛋白与过氧化氢含量测定

H₂O₂含量的测定方法见参考文献［21］。用30%（W/V）H₂O₂母液稀释制备0、24、96、192、490、980和9 800 μmol/L的H₂O₂标准溶液。取样品提取液1 mL，加入5%硫酸钛1 mL，放置10 min，离心（12 000 g，10 min），取上清液，分别在410 nm处测定光密度值，绘制H₂O₂标准曲线。

称取苦草鲜叶0.1 g，放入预冷匀浆器中，加入4 mL PBS磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH 7.8，含1%PVP），研磨至匀浆器中即为样品提取液。4 ℃（12 000 g，10 min）离心，取上清液1.5 mL，加入5%（m/V）硫酸钛1.5 mL，静置反应10 min，4 ℃（12 000 g，10 min）离心，取出上清液。在410 nm处测量光密度。

{\mathrm{H}}_{\mathrm{2}}{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}\mathrm{含量}\left(\mathrm{\mu }\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}/\mathrm{g}\right)=\frac{C\times V_t}{F_W\times V}

C，在标准曲线上计算的样品中H₂O₂浓度（μmol/L）；V_T，提取液的体积（mL）；V，用于测定的样品提取物的体积（mL）；F_W，样品的新鲜重量（g）。

可溶性蛋白质含量通过考马斯亮蓝G⁃250染色法^［22］测定。首先，利用牛血清蛋白（BSA）构建可溶性蛋白的标准曲线。称取苦草鲜叶1 g，放入预冷匀浆器中，加入4 mL PBS磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH 7.8，含1%PVP），研磨至匀浆，4 ℃（12 000 g，10 min）离心取上清液，即为蛋白质提取物。取蛋白提取液0.1 mL，加入考马斯亮蓝G⁃250蛋白试剂5 mL，充分混合，放置5 min，为空白对照，测定595 nm波长吸光度。计算公式如下：

\mathrm{可溶}\mathrm{性蛋}\mathrm{白含}\mathrm{量}\left(\mathrm{m}\mathrm{g}/\mathrm{g}\right)=\frac{m\times V_T\times N}{m_{\mathrm{0}}\times V_s\times \mathrm{1000}}

m，根据样品的吸光度从标准曲线中计算的蛋白质量（μg）；V_T，提取溶液的总体积（mL）；m₀，样品质量（g）；V_S，用于测定的样品上清液的体积（mL）；N，稀释率；1 000为1 μg=1×10^-3 mg。

1.7 联合毒性分析方法

在本实验中，使用Abott模型来评估硝磺草酮和铜之间的相互作用类型^［23］。预期抑制（EI）的计算公式如下：

\mathrm{E}\mathrm{I}\left(\mathrm{\%}\right)=A+B-A\times B/\mathrm{100}%

A和B表示当硝磺草酮或铜单独作用时对苦草的抑制水平。

混合物（硝磺草酮+铜）对苦草的抑制率（RI）计算如下：

\mathrm{R}\mathrm{I}=\frac{\mathrm{实际}\mathrm{抑制}\mathrm{率}}{\mathrm{E}\mathrm{I}}

最后，通过比较RI和1的大小，评估硝磺草酮和铜之间的相互作用类型。其中，RI>1、RI＝1、RI<1分别代表协同效应、加性效应和拮抗效应。

1.8 数据分析

数据均以平均值±标准差表示，采用SPSS 21.0 统计分析软件，在P=0.05置信水平对实验数值进行单因素方差分析（one⁃way ANOVA）和Duncan检测，并通过Levene检验分析方差的同质性，必要时将数据转化和归一化以减少方差的异质性。作图使用SigmaPlot 12.5软件。

2 结果与分析

2.1 相对生长率

经硝磺草酮、铜以及硝磺草酮+铜联合处理14 d后，苦草的相对生长率发生显著变化（图1）。大于等于10 mg/L的硝磺草酮对苦草具有抑制作用（P<0.05）。随着硝磺草酮的浓度升高，对苦草抑制作用增强。类似的，铜对苦草的抑制作用呈现剂量依赖效应。随着铜浓度的增加，铜对苦草的抑制作用越来越强烈。当铜浓度≥0.5 mg/L时，苦草出现明显的负增长（P<0.01）。除20 mg/L硝磺草酮+1 mg/L铜处理组外，硝磺草酮和铜对苦草的联合毒性比单一处理的抑制作用更强烈（P>0.05）。然而20 mg/L硝磺草酮的加入，反而在一定程度上减轻了1 mg/L铜的抑制作用。

2.2 光合色素

苦草的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素的变化趋势呈现一致性（图2）。叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量随硝磺草酮浓度的增加呈明显的剂量依赖性，≥10 mg/L硝磺草酮浓度显著降低了苦草光合色素含量（P<0.05）。铜还显著降低了苦草的叶绿素和类胡萝卜素含量（P<0.05）。在联合处理组中，随着硝磺草酮+铜的浓度逐渐升高，叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素的含量与对照组相比显著下降。苦草的光合色素对硝磺草酮和铜非常敏感。

2.3 MDA和过氧化氢含量

苦草MDA和H₂O₂在硝磺草酮和铜暴露下的变化见图3。结果显示，与对照组相比，硝磺草酮、铜以及联合处理组均未对苦草产生显著性影响（P>0.05，图3a）。苦草细胞膜未发生膜脂过氧化。硝磺草酮不会对苦草体内过氧化氢含量产生影响，而2 mg/L铜对苦草的过氧化氢具有抑制作用，与对照组相比达到显著水平（P<0.05）（图3b）。联合暴露组中，20 mg/L硝磺草酮+1 mg/L铜以及50 mg/L硝磺草酮+2 mg/L铜对苦草的过氧化氢产生了抑制作用并达到显著水平。其他处理组与对照相比没有达到显著性水平（P>0.05）。

2.4 抗氧化酶活性

当硝磺草酮浓度≤10 mg/L时，SOD活性与对照组差异不显著，当硝磺草酮浓度≥20 mg/L时，SOD活性显著降低（P<0.05）（图4a）。SOD活性随铜浓度的增加而逐渐升高，与单一硝磺草酮的作用不同。铜浓度≤0.3 mg/L时，SOD活性被显著抑制；当铜浓度≥1 mg/L时，SOD活性显著提高（P<0.05）。在硝磺草酮+铜联合处理组，SOD活性在低浓度（0.01 mg/L硝磺草酮+0.1 mg/L铜、1mg/L硝磺草酮+0.3 mg/L铜）下表现为抑制作用，在高浓度（50 mg/L硝磺草酮+2 mg/L铜）下表现为促进作用。与对照组相比，SOD活性在0.01 mg/L硝磺草酮+0.1 mg/L铜和1 mg/L硝磺草酮+0.3 mg/L铜复合胁迫下显著降低，在50 mg/L硝磺草酮+2 mg/L铜复合胁迫下显著升高（P<0.05）。

10 mg/L硝磺草酮显著降低了苦草POD活性（P<0.05）。而1 mg/L铜和50 mg/L硝磺草酮+2 mg/L铜处理显著升高了苦草POD活性（P<0.05）。其他处理组与对照组相比无显著变化（P>0.05）（图4b）。

本研究数据显示，硝磺草酮对苦草CAT活性没有显著影响（P>0.05）。然而铜处理组和联合处理组对苦草CAT活性具有显著抑制效应（P<0.05）。最高浓度处理组（2 mg/L铜和50 mg/L硝磺草酮+2 mg/L铜）使苦草CAT活性下降77.76%和81.94%（图4c）。

2.5 可溶性蛋白

经不同浓度硝磺草酮处理14 d后，苦草的可溶性蛋白含量呈现下降趋势（图5）。50 mg/L硝磺草酮对苦草可溶性蛋白含量具有显著抑制作用（P<0.05）。在单一铜处理下，苦草的可溶性蛋白含量显著下降（P<0.05）。0.5 mg/L铜处理下，苦草可溶性蛋白含量出现最小值1.75 mg/g，下降了71.41%。类似的，联合处理组与单一铜处理呈现相同的趋势。苦草可溶性蛋白含量均显著低于对照（P<0.05），并在1 mg/L硝磺草酮+0.3 mg/L铜处理下降至最低值。

2.6 联合毒性分析

在本实验中，相对生长率和总叶绿素是比较适合用于计算联合毒性的指标。根据Abott公式，相对生长率和总叶绿素计算的RI值呈现相似的趋势，在硝磺草酮浓度+铜浓度≤1 mg/L+0.3 mg/L时，RI<1，表明两者共存具有拮抗作用，毒性降低。随着浓度的增加，相互作用逐渐增强，最高浓度（50 mg/L硝磺草酮+2 mg/L铜） RI>1时，硝磺草酮和铜表现出协同作用，两者共存，对苦草毒害增加。在10 mg/L硝磺草酮+0.5 mg/L铜和20 mg/L硝磺草酮+1 mg/L铜条件下，铜和硝磺草酮对相对生长率和总叶绿素的交互作用不同。在10 mg/L硝磺草酮+0.5 mg/L铜浓度下，对相对生长率有协同作用，对总叶绿素有拮抗作用。在20 mg/L硝磺草酮+1 mg/L铜时，对相对生长率有拮抗作用，对总叶绿素有协同作用。

3 讨 论

3.1 硝磺草酮与铜单一及联合胁迫下对苦草生长的影响

经过14 d实验，单一硝磺草酮明显抑制了苦草的生长，特别是在最高浓度（50 mg/L）下，苦草的生长受到极大限制，表明苦草对硝磺草酮敏感。类似的，有研究也发现，将10%硝磺草酮处理施加到藜（Chenopodium album）上，15 d后植株的株高和鲜重明显减小^［24］。硝磺草酮是一种抑制羟基苯基丙酮酸酯双氧化酶（4⁃hydroxyphe⁃nylpyruvate dioxygenase， HPPD）的除草剂，其作用机制主要包括：①阻碍氨基酸合成和代谢；②阻止植物的光合作用；③抑制植物光合色素的合成^{［25，26］}。与此相关，本研究结果显示，当硝磺草酮浓度超过10 mg/L时，苦草的光合色素含量显著下降，从而抑制了光合作用。

与硝磺草酮相比，铜对苦草RGR的抑制作用更强。铜对水生植物的毒害表现在抑制光合色素的合成，以及损害酶的正常生理功能^［27］。在0.5 mg/L铜影响下，苦草出现负增长。类似的，有研究结果表明，3 mg/L铜可以使黑藻成活率下降67.96%^［28］。经1.28、2.56 mg/L暴露4 d后，苦草茎长、根长以及总生物量与对照组相比显著降低^［29］。

联合暴露结果显示，1 mg/L硝磺草酮+0.3 mg/L铜、20 mg/L硝磺草酮+1 mg/L铜处理下，硝磺草酮的加入减弱了铜对苦草的伤害。这可能是由于在特定浓度下铜离子能够与硝磺草酮发生络合（螯合）作用生成沉淀，水环境中铜离子浓度降低所致^{［30，31］}。而在10 mg/L硝磺草酮+0.5 mg/L铜暴露下，硝磺草酮与铜表现出协同作用，这可能是由于铜的存在改变了苦草细胞膜的通透性，苦草表面因此变得疏松。硝磺草酮趁机进入了苦草体内并积累，对苦草造成更严重的毒害。

3.2 硝磺草酮与铜单一及联合胁迫下对苦草光合作用的影响

植物光合能力与光合色素含量密切相关，其含量可作为环境胁迫下植物抗逆性的生理指标^［32］。本研究结果表明，硝磺草酮和铜暴露对苦草光合色素含量的影响具有明显的浓度依赖性。即随着胁迫浓度的增加，叶绿素含量逐渐降低，并达到显著水平。这种现象在联合暴露组更为明显。本研究结果表明，经硝磺草酮（≥10 mg/L）处理后，苦草光合色素含量与对照组相比显著下降（P<0.05）。因此，硝磺草酮可以抑制水生植物对HPPD的活性，阻碍醛酸的形成，从而降低PQ⁃9和α⁃生育酚的含量，破坏光合器官的稳定，破坏叶绿素分子，抑制色素的合成^［26］。

经铜（≥0.1 mg/L）暴露14 d后，与对照组相比苦草的光合色素同样表现出下降，并达到显著水平（P<0.05）。铜在光和电子传递、细胞代谢等过程中发挥着重要作用。镁元素是叶绿素的重要组成部分。植物体内过量的铜流入可能取代镁元素，最终对植物光合作用产生不利影响。有研究发现44 µg/L铜能够显著抑制角毛藻（Chaetoceros sp.）叶绿素a的生成，进而导致其光合作用生产力下降^［33］。

0.01 mg/L硝磺草酮+0.1 mg/L铜、1 mg/L硝磺草酮+0.3 mg/L铜对苦草光合色素具有一定的协同作用（P>0.05）。而在10 mg/L硝磺草酮+0.5 mg/L铜、20 mg/L硝磺草酮+1 mg/L铜、50 mg/L硝磺草酮+2 mg/L铜处理组中，硝磺草酮与铜对苦草光合色素具有明显的拮抗作用（P<0.05）。随着联合处理的浓度升高，硝磺草酮与铜对苦草光合色素含量的影响由协同作用转化为拮抗作用。在Microcystin⁃LR（MCLR）与铜对苦草的联合毒性实验中，低浓度（≤0.25 mg/L MCLR+0.64 mg/L Cu）处理组协同作用显著，高浓度组（>0.25 mg/L MCLR+0.64 mg/L Cu）表现为加和或者拮抗作用^［29］。

3.3 硝磺草酮与铜单一及联合胁迫下对苦草氧化应激的影响

ROS的积累可引起膜脂过氧化水平升高，增加细胞膜通透性，进而引起一系列生理变化^{［34，35］}。在本实验中硝磺草酮、铜以及联合处理对苦草MDA含量没有显著影响。苦草对硝磺草酮与铜的氧化胁迫表现较为稳定。在不同浓度的硝磺草酮处理下，苦草叶片中H₂O₂含量变化不显著，说明抗氧化酶系统被激活，细胞内多余的H₂O₂被及时清除，使H₂O₂的产生和代谢稳定，没有在细胞内积累^{［36，37］}。铜对MDA含量的影响不显著，说明铜对苦草的毒性可能没有表现在细胞膜上。事实上，研究表明铜对成熟叶片的MDA没有显著影响。它主要通过扰乱植物体内的营养平衡来发挥其毒性^［38］。高浓度（≥20 mg/L硝磺草酮+1 mg/L铜）毒物显著降低H₂O₂含量，可能是苦草抗氧化系统受到严重破坏，氧自由基的产生和代谢不平衡。

在本实验中，高浓度（≥20 mg/L）硝磺草酮胁迫下，SOD活性显著降低。有研究也报道了类似的结果^［39］。高浓度硝磺草酮处理下，蚯蚓SOD活性降低。这可能是动物受到了严重的压力，氧自由基的平衡被破坏。CAT可以将植物体内多余的H₂O₂转化为无毒的H₂O和O₂，是维持H₂O₂平衡的关键酶^［40］。在本研究中，硝磺草酮并未对苦草的CAT活性产生影响。这可能是由于苦草CAT对硝磺草酮不敏感所致。10 mg/L硝磺草酮处理下，苦草POD活性升高。这为苦草能够及时清除体内多余的氧分子（molecular oxygen）和H₂O₂提供了潜力。有学者发现经MCLR处理8 d后，苦草体内POD活性同样显著上升^［29］。这与本研究结果相一致。事实上，也有非酶的方法来对抗植物中ROS的过度积累，如谷胱甘肽（GSH）、抗坏血酸（ASA）等^{［41，42］}。事实上，有研究发现，经硝磺草酮处理后，蚯蚓的谷胱甘肽一直处于活跃状态。因此，苦草也可以通过非酶方法减轻硝磺草酮的毒性^［39］。

低浓度（≤0.3 mg/L）铜抑制了苦草SOD活性，高浓度（≥1 mg/L）铜提高了苦草SOD活性。而且硝磺草酮和硝磺草酮+铜处理组均使苦草CAT活性显著下降。苦草的SOD对不同浓度铜敏感性有差异，而苦草CAT对铜敏感。这说明铜在低浓度时，苦草为清除体内多余的H₂O₂而被耗尽以保护细胞免受损伤。高浓度铜处理下，苦草SOD、POD活性增加。这说明此时，苦草具有相当大的去除氧分子和H₂O₂中O₂^- 的能力^［40］。

高浓度的H₂O₂能够损伤植物细胞，但是低浓度的H₂O₂处理能增加植物的抗氧化物酶活性，从而减轻ROS对植物的伤害，增强植物的抗逆性。在本研究中，苦草体内H₂O₂含量只有在高浓度联合暴露下出现下降。说明它通过抗氧化系统或非酶抗氧化物质及时清除了多余的H₂O₂^［43］。苦草体内稳定的H₂O₂并未对抗氧化酶产生严重的影响。H₂O₂含量变化的主要原因是外源物质的加入。

3.4 硝磺草酮与铜单一及联合胁迫下对苦草可溶性蛋白含量的影响

可溶性蛋白在维持生物体的稳定性、合成生物大分子、参与细胞内物质的运输等生理过程中起着关键作用。在硝磺草酮和铜胁迫下，植物可溶性蛋白呈显著下降趋势。苦草在应对二者的刺激时，能够激活抗氧化酶系统，从而促进解毒和防御性酶的合成，并增强它们的活性。然而，在高浓度污染物的毒性作用下，细胞结构受损，功能丧失，这不可避免地导致了蛋白质浓度的降低^［44］。此外，硝磺草酮阻碍了叶绿素的生成和电子的传递，植物的光合作用受阻，营养物质的积累无法完成。在本研究中，50 mg/L单一硝磺草酮、铜和联合暴露组对苦草可溶性蛋白均有非常显著的抑制作用。对黑藻的研究也得出了同样的结论^［45］。

3.5 硝磺草酮与铜对苦草的Abott模型评估

相对生长率和总叶绿素计算的RI值显示，当联合暴露组浓度低于1 mg/L硝磺草酮+0.3 mg/L铜时，硝磺草酮和铜毒性表现出拮抗作用，而随着浓度的增高，二者的相互作用逐渐增强，在最高浓度（50 mg/L硝磺草酮+2 mg/L铜）下，表现出明显的协同作用。这可能是由于：①硝磺草酮是三酮类化合物，含有多个官能团，如-NO₂、=O等，这些官能团都是潜在的铜结合位点。因此硝磺草酮可能会与铜络合，生成对植物毒性更小的络合物。②铜的存在可能导致了硝磺草酮的光降解增加，铜被还原。在研究草甘膦和铜对槐叶萍（Salvinia natans）的影响时发现了同样的现象^［46］。低浓度的草甘膦和铜复合暴露对植物生长发育表现为拮抗作用，而较高浓度则呈现出协同作用。低浓度下，复合暴露表现出拮抗作用的原因之一是二者发生了络合作用。在10 mg/L硝磺草酮+0.5 mg/L铜复合处理下，硝磺草酮与铜对相对生长率表现出协同作用，而对总叶绿素表现为拮抗作用。这可能是由于在该浓度下，硝磺草酮与铜形成特定的复合物，促进了铜跨膜转运，增加了受体细胞内污染物的积累。导致毒性效应比单一污染物增强^［47］。总体来说，随着复合暴露浓度升高，硝磺草酮与铜对苦草的联合作用由拮抗作用转为协同作用。在现实环境中，生态系统往往暴露于多种化学污染物相互作用引起的复杂污染中，因此复合效应不仅仅是简单的加和，协同，还有独立，竞争，保护等。虽然国内外学者已对复合污染展开了大量的研究和报道，但是绝大多数的研究还只是局限于复合污染的效应，对复合污染机理方面的探讨还十分有限。

4 结 论

4.1 硝磺草酮对苦草的生理胁迫影响

单一硝磺草酮对苦草的生长和光合色素的合成、CAT活性和可溶性蛋白含量具有抑制作用，而对苦草POD活性具有激活效应。随着胁迫浓度的增加，硝磺草酮对苦草的毒害加深。

4.2 铜对苦草的生理胁迫影响

单一铜胁迫对苦草生长、光合色素的合成、CAT活性以及可溶性蛋白含量具有显著抑制作用，而对苦草SOD和POD活性具有激活效应。苦草对铜的毒性作用表现比硝磺草酮更敏感。

4.3 硝磺草酮与铜联合作用对苦草的生理胁迫影响

苦草的RGR、光合色素、可溶性蛋白含量、CAT活性等指示物对硝磺草酮与铜联合胁迫表现出受害响应。而POD活性显著上升，SOD活性呈现低浓度抑制高浓度促进效应。

4.4 硝磺草酮与铜联合作用对苦草的毒性效应评估

当复合硝磺草酮+铜的浓度较低时，硝磺草酮和铜对苦草的联合毒性为拮抗作用；当复合硝磺草酮+铜浓度较高时，硝磺草酮和铜对苦草有较强的协同作用。随着复合浓度增加，硝磺草酮和铜对苦草的联合毒性效应由拮抗作用转为协同作用。本研究将为复杂水污染生态风险评价和修复提供基础数据。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31270410)

国家自然科学基金项目(3097030)