北京草莓种植区土壤微生物群落结构解析

Analysis of soil microbial community structure in strawberry planting areas in Beijing

摘要

为了解北京草莓种植区土壤微生物组群落动态与土壤质量的关系，本研究利用高通量测序，系统分析北京地区草莓根际微生物组。结果显示，微生物群落结构分布具有明显的区域性，磷元素和钾元素是影响草莓根际菌群组成最主要的因子；扩增子测序分析表明，健康植株比发病植株根际土壤微生物群落结构更稳定；网络分析发现了潜在的与草莓土壤健康相关的菌属，发病样品中链霉菌属（Streptomyces）和芽胞杆菌属（Bacillus）占据重要位置。进一步对比健康草莓与发病根际微生物组成的差异，探究了病害发生与根际微生物群落变化之间的规律，并通过构建相关性网络发现了潜在的病害防治菌属，为北京草莓土传病害预警和防控奠定了基础。

Abstract

To understand the relationship between soil microbial community dynamics and soil quality in strawberry planting areas in Beijing， this study used high⁃throughput sequencing to systematically analyze the rhizosphere microbiome of strawberries in the Beijing area. The results showed that the microbial composition has obvious regional characteristics， and phosphorus and potassium elements are the most important factors affecting the composition of strawberry rhizosphere microbiota. Amplicon sequencing analysis showed that healthy plants have more stable microbial community structure in the rhizosphere soil than diseased plants. Network analysis identified potential bacterial genera associated with strawberry soil health， with Streptomyces and Bacillus occupying significant positions in the diseased samples. We further compared the differences in rhizosphere microbial composition between healthy and diseased strawberries， explored the patterns between disease occurrence and changes in rhizosphere microbial communities， and identified potential disease control genera by constructing co⁃occurrence networks. This study lays the foundation for early warning and prevention of soilborne strawberry diseases in Beijing.

Graphical abstract

关键词

扩增子测序 / 微生物组 / 草莓枯萎病 / 根际微生物 / 土壤理化性质

Key words

amplicon sequencing / microbiome / strawberry fusarium wilt / rhizosphere microorganism / soil physiochemical property

0 引 言

草莓（Fragaria ananassa Duchesne）属蔷薇科（Rosaceae）草莓属（Fragaria）宿根性多年生植物^［1］，因其独特的色、香、味和较高的经济价值，深受广大消费者喜爱。中国作为世界上面积最大、产量最高的草莓生产国和消费国^［2］，草莓的种植和生产对国民经济和生活产生了重要影响。由于中国耕地资源紧缺，草莓的栽培种植主要依赖于温室大棚环境，致使其复种指数高和连作现象普遍。尤其是北京在积极发展都市型现代化农业的背景下，面对有限的耕地面积，设施栽培更是其农业发展的主流。而近些年北京市草莓种植面积的持续增长主要依靠复种指数的提高，造成土传病害日趋严重、土壤肥力失衡，导致死苗和减产等连作障碍不断加重，给首都草莓产业的持续发展带来了严峻的挑战。

植物根际微生物是与植物互作和影响植物健康的核心群落，在植物营养转化、抗病免疫、抵御胁迫等方面发挥重要作用。研究发现，腐朽红松（Pinus koraiensis）根部土壤中真菌丰度与全氮呈极显著正相关，与全钾呈显著正相关，细菌丰度与全氮和速效磷呈极显著正相关，与全钾呈显著正相关，与含水率呈显著负相关，与全磷、水解氮和速效钾无显著相关性^［3］。在农牧交错带旱地，有机肥和化肥配施处理提高了土壤有益菌群的相对丰度，降低了病原菌群的相对丰度。变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）等优势菌门的相对丰度增加。放线菌门（Actinobacteria）、子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度降低。因此在提高土壤肥力和抑制病原微生物生长方面，有机肥和化肥配施处理明显优于单施氮肥处理和单施化肥处理^［4］。长期施用绿肥后，根际土壤细菌中厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门、芽胞杆菌属（Bacillus）以及假节杆菌属（Pseudarthrobacter）的丰度得到提高，酸杆菌门（Acidobacteriota）的丰度降低，土壤微生物种群数量增加^［5］。在核桃腐烂病发病程度较重的土壤中微生物活性明显低于健康和腐烂病发病程度较轻的土壤^［6］。大量研究证明，根际微生物组的动态变化与植株健康和土壤营养状况存在极大的相关性，并且通过对土壤微生物群体的人工改造和调整能够改善植株生长、改良土壤健康。目前，北京草莓主产区因连作和高复种造成的土壤健康问题单纯依赖化肥农药的施用难以起到标本兼治的效果，需从土壤微生物的角度系统评估，深入探究草莓种植区的病害成因和土壤问题，结合土壤微生态调控形成完善的防控方案，助力病害预警和土壤健康评估^［7］。

本研究通过对比北京市6个草莓种植地区植株根际土壤样品，探究土壤养分和理化性状对土壤微生物群落组成的影响；通过比较健康和发病植株根际土壤微生物群落的指数变化，了解植株健康与土壤微生物群落变化的关系；进一步结合差异微生物和相关性网络分析，明确潜在的病害发生预警微生物和新的生防微生物资源，为草莓土传病害防控、土壤质量提升及草莓产量和品质提升提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

根际土样品采自北京市大兴区、昌平区、密云区、通州区和平谷区的6个常年种植草莓的园区，分别为奥肯尼克家庭农场（39.644^oN，116.624^oE）、金六环农业园（40.192 ^oN，116.276 ^oE）、汇源农业生态园（40.288^oN，116.947^oE）、中农富通（39.849^oN，116.825^oE）、大兴庄镇大兴庄村农户（40.154^oN，117.062^oE）和沱沱工社（40.135^oN，117.00^oE）（表1），每个样点选择健康大棚、土传病害发病大棚各3个，采用五点取样法采集健康植株、发生病害植株的根际土壤以及健康大棚的散土各3份用于后期分析。

1.2 土壤元素及理化性质的测定

取土壤样品200 g室温避光晾干，研磨后过100目筛，称取100 g过筛后的土样进行土壤理化性质测定。参照《土壤农化分析》测定土壤理化性质^［8］，以土水比为1∶2.5（质量体积比），利用复合玻璃电极仪测定土壤pH；以土水比为1∶5（质量体积比），利用电导率仪测定土壤电导率；利用流动分析仪测定土壤悬液的铵态氮和硝态氮含量；采用半微量凯氏定氮法测定土壤全氮；采用碱解扩散法测定碱解氮；采用钼锑抗比色法测定土壤全磷和有效磷；采用火焰光度法测定土壤全钾和速效钾；采用重铬酸钾容量法⁃外加热法测定全碳。

1.3 土壤基因组的提取与检测

利用FastDNA Spin Kit For Soi（MP）试剂盒提取DNA。研钵灭菌后加入液氮，将0.5 g新鲜土壤样品研磨至粉状，装入Lysing Matrix E tube中，按照MP试剂盒说明书完成基因组提取。利用核酸定量仪（NanoDrop One）测定DNA核酸浓度与纯度，DNA于-20 ℃保存备用。

1.4 16S rRNA PCR扩增及扩增子样品的准备

以土壤DNA为模板，利用带有不同barcode序列的V3~V4区通用引物534F（5'⁃CCAGCAGCCGCGGTAAT⁃3'）和783R（5'⁃ACCMGGGTATCTAATCCKG⁃3'）进行16S rRNA扩增^［9］。50 μL PCR扩增体系包含2×Mix 25 μL，上下游引物各10 ng，模板DNA 30 ng，ddH₂O补足至50 μL；PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增结束后，使用OMEGA胶回收试剂盒进行胶回收，并经NanoDrop One检测浓度。按照marker 250 bp条带的净光密度值进行标准化后等质量DNA（150 ng）混样，采用双端Nova⁃PE250模式在北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行测序。

1.5 扩增子数据处理和分析

将包含正向、反向序列文件的16S rRNA基因原始测序数据与barcode序列文本文件上传至Galaxy平台；去除barcode序列与正反向引物序列；利用Flash工具将正反向序列拼接；去除非细菌序列后生成降维的特征表进行下游分析^［10］。将序列按照97%的相似度水平进行聚类，生成OTU（operational taxonomic units）表进行后续分析。根据DCA（detrended correspondence analysis）分析，发现第一轴数值小于3，因此选用RDA（redundancy analysis）对土壤理化性质和土壤微生物群落的相关性进行分析，明确驱动微生物群落发生变化的主要影响因子。利用Chao1和香农指数来表征根际土壤微生物群落α多样性；基于Bray⁃Curtis相异性指数对微生物群落相似性进行主成分分析（principle coordinate analysis，PCoA）；基于LDA>2，P<0.01参数计算LEfSe（LDA Effect Size），发现和解释高维度数据生物标识，获取差异菌群；基于SparCC算法进行群落相关性网络分析，利用Gephi（v 0.9.2）软件对网络化数据进行分析；使用在线平台MicrobiomeAnalyst（https：//www.microbiomeanalyst.ca/）和ImageGP（http：//www.ehbio.com/ImageG/）进行数据可视化；利用GraphPad Prism（v 9.1.1）软件完成方差分析^{［11，12］}。

2 结果与分析

2.1 不同地区土壤理化性质分析

对大兴区、昌平区、密云区、通州区和平谷区的6个采样地散土理化指标进行分析（表2，图1A），发现土壤养分含量、pH和电导率等指标在不同区域间具有明显差异，其中通州区大东各庄村（DDG）土壤样品中全钾和速效钾含量最高，分别为25.81 g/kg和900.13 mg/kg，其余速效养分和有机质含量等也维持较高水平，说明土壤肥力较好；平谷区魏辛庄村（WXZ）地区碱解氮含量显著高于其他地区，达590.85 mg/kg，而其他五个地区碱解氮含量无显著差异；速效钾含量在各地区含量差异较大，通州区和平谷区取样地含量普遍偏高，而昌平区金六环农业园（JT）明显偏低。对6个园区土壤养分和理化性状分析，发现多数园区土壤pH偏高，存在盐渍化风险；各园区土壤性状和基础养分差异较大，可能在一定程度上影响其土壤微生物群落的组成和结构，但整体上土壤营养状况相对较好，没有明显的缺素情况。

进一步分析土壤理化性质与微生物群落的相关性（图1B），发现铵态氮含量对于昌平区金六环农业园（JT）地区的土壤微生物群落组成影响较大；土壤电导率的差异主要影响密云区东邵渠村（HY）和大兴区东北台村（DBT）取样地区的土壤微生物群落组成；平谷区魏辛庄村（WXZ）和大兴庄村（DXZ）地区的土壤微生物群落组成则主要受速效钾、速效磷和pH的影响。总体来说，土壤理化性质受取样地地理位置影响较大，同时速效钾、速效磷和pH对土壤微生物群落的影响要高于全磷、全钾和硝态氮等理化性质。

2.2 草莓根际土壤微生物群落的组成分析

北京6个地区36份草莓根际土壤样品共产生16 672条16S rRNA基因序列。利用RDP数据库注释后，所有发病和健康土壤样本共检测到12门117纲181目249科422属（图2A），以变形菌门（发病根际占比为42.81%，健康根际占比为47.27%）、放线菌门（发病占比26.36%，健康占比24.68%）和芽单胞菌门（发病占比9.70%，健康占比9.09%）为主，且健康和发病根际土壤中丰度较为接近。其中丰度最高的变形菌门主要由α⁃变形菌纲（Alphaprotobacteria），β⁃变形菌纲（Betaprotobacteria），γ⁃变形菌纲（Gammaprotobacteria）和δ⁃变形菌纲（Deltaprotobacteria）4个菌纲组成；γ⁃变形菌纲（发病占比10.44%，健康占比13.20%，t⁃test，P<0.05）在健康样品中显著富集。另外，厚壁菌门（发病占比9.82%，健康占比7.84%，t⁃test，P<0.05）在发病根际土壤样品中显著富集。在属水平（图2B），可以观察到芽胞杆菌属和亚硝化球菌属（Nitrososphaera）在发病植株根际环境中显著富集（t⁃test，P<0.05），链霉菌属（Streptomyces）、假单胞菌属（Pseudomonas）和壤霉菌属（Agromyces）在健康植株根际环境中显著富集（t⁃test，P<0.05）。整体来看，发病与健康的草莓根际植株群落组差异显著，发病和健康样品中具有各自的优势菌群。

2.3 草莓根际土壤微生物群落多样性分析

利用Chao1和Shannon指数描述草莓根际土壤Alpha多样性的丰度和丰富度差异（图3），综合分析6个地区所有健康和发病植株样品的根际微生物多样性，发现健康土壤样品的多样性指数均值与中位数均大于发病土壤样品（图3A和图3C），说明病害发生会导致土壤样品中微生物的丰度和丰富度明显下降。比较各采样地区发病样品与健康样品的细菌群落差异，发现平谷区大兴庄村（DXZ）地区的发病土壤样品微生物丰度和丰富度较健康土壤样品显著下降（图3B和图3D）；而密云区东邵渠村（HY）和平谷区魏辛庄村（WXZ）地区的发病土壤样品微生物仅丰度较健康土壤样品显著下降（图3B）；其余地区发病与健康根际土壤微生物群落差异不显著（图3B和图3D），说明病害发生与否直接影响微生物群体的变化。

基于Bray⁃Curtis相异性指数计算的主要成分分析结果，表明6个地区的草莓根际细菌群落结构差异呈现显著的地域性分布（P<0.001，R²=0.645，图4A），采样地区是影响土壤微生物群落组成的主要因素。同时样品聚类分析可以观察到同一地区的健康样品与发病样品间也存在明显的聚类分支差异，说明发病与否是引起当地草莓根际微生物群落变化的重要因素（图4B）。

2.4 健康和发病植株根际微生物差异菌群与网络相关性分析

使用LEfSe来分析发病与健康根际样品间的差异菌群，通过比较发现，假单胞菌属、溶杆菌属（Lysobacter）和中华单胞菌属（Sinomonas）等在草莓健康根际土壤样品中含量显著偏高，而茄科雷尔氏菌属（Ralstonia）作为病原菌，在草莓发病根际样品中显著富集，同时还伴随有噬几丁质菌属（Chitinophage）和赖氨酸芽胞杆菌属（Lysinibacillus）等的占比显著升高（图5A）。

进一步构建相关性网络发现，在健康土壤样品中，假单胞菌属和分枝杆菌属是网络构成的重要组成部分；而发病土壤样品与健康土壤样品相比，网络节点（度）和连接（边）均减少，模块化程度降低，同时链霉菌属和芽胞杆菌属逐渐在网络中占据更重要的位置（图5B和图5C）。如发病组中OTU_254链霉菌为模块节点（module hub），而OTU_119芽胞杆菌为连接节点（connector hub）；OTU_140假单胞菌在健康组中为模块节点，而在发病组中则处在外围（peripherals）（图5D和图5E）。根据LEfSe和相关网络分析获得了与病害发生相关的关键菌属，也发现了草莓根际微生物群落响应病原菌侵染做出对应菌群结构改变的特点。

3 讨 论

植物相关微生物组被称为植物的“第二基因组”^［13］，已经成为植物⁃微生物互作领域研究的热点。农业微生物资源在改善土壤地力、提高作物环境适应性、减轻化学污染、推动农业绿色革命过程中发挥了重要的作用^［14~16］。根际微生物组作为植物相关微生物组的重要一环，具有极高的研究和应用价值。

已有报道表明，土壤速效养分会引起土壤细菌和古菌群落变化，且氮磷钾含量直接与植物根际土壤微生物量显著相关^［17~21］。本研究发现，磷元素和钾元素对根际微生物的组成影响大于游离氮元素，是影响土壤微生物群落动态变化的关键理化因子。健康根际土壤Alpha多样性的Chao1和香农指数均高于发病根际土壤（图3），其中大兴区东北台村（DBT）和密云区东邵渠村（HY）地区的发病土壤样品与健康土壤样品的Chao1与香农指数差异显著。同时这两个地区可溶性盐、全氮、全磷、速效钾、铵态氮等理化性质指标明显偏低，由此推测指数差异可能与氮、磷、钾元素的缺乏相关，同之前的很多报道结论相一致^{［22，23］}。植物根际微生物群落多样性及其动态同样与植物健康密切相关，当植物面临病原菌侵染时，存在“求救”机制，会主动分泌次生代谢产物改变土壤理化性质，影响根系的菌群组成^{［24， 25］}，而被招募的菌群为更好地适应环境也会形成竞争机制，导致特定种属的微生物在发病植株根际富集，降低土壤的Alpha多样性^{［26，27］}，本研究同样证明了根际微生物的组成和变化明显受到植物生长状态的调节。

根际促生菌（plant growth⁃promoting rhizobacteria， PGPR）是植物根际土壤微生物群落的重要组成部分，也是主要的生防微生物资源，最常见的根际促生菌有假单胞菌属、芽胞杆菌属和链霉菌等^{［3， 4］}。由于芽胞杆菌属与链霉菌属的可培养性、易分离性和前期丰富的研究基础，生防菌剂的筛选大都集中在这些菌属中^［28~30］。通过构建健康与发病植株根际土壤微生物互作网络，也发现了芽胞杆菌属与链霉菌属在发病网络中逐渐占据重要位置（图5）。除此之外，笔者还发现潜在的与草莓土壤健康相关的其他菌属，其中包含已报道的与根际健康稳定相关的菌属，如溶杆菌属（Lysobacter）、类固醇杆菌属（Steroidobacter）等（图5A）和报道较少或尚未被报道的菌属，如海藻球菌属（Phycicoccus）、去甲基甲基萘醌菌属（Demequina）、红长命菌属（Rubrivivax）以及红细菌属（Rhodobacter）等）^［31~34］。目前，基于微生物源的土壤调理剂或生防菌剂的施用已被逐渐接受，在改良土壤理化性质、改善土壤微生态、提升地力保障作物健康中广泛应用，本研究中分析评价所得的与植物健康直接相关的微生物资源能够为今后开发和创制有益微生物制剂奠定丰富的资源基础，为研发适用的微生物制剂提供保障。

4 结 论

本研究对北京市5个区的6个草莓园区根际土壤进行分析，发现各地区土壤养分差异较大，但整体上土壤肥力状况良好，仍存在盐渍化风险；比较分析了健康与发病植株根际土壤微生物的多样性和群落组成，发现根际微生物组成受地域影响最大，其次与植物是否患病相关；发病和健康样品之间多样性具有显著区别，且具有各自的优势菌群；通过对土壤样品进行差异微生物和相关性网络分析，找到了潜在的病害预警微生物以及生防微生物类群，扩充了针对草莓病害的生防微生物资源，此结果也可以指导后续有目的地筛选特色生防菌株，为草莓土传病害的防治及其种植过程中的健康管理提供科学依据。

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基金资助

特色作物产业技术体系北京市创新团队(BAIC04-2023)

北京市乡村振兴科技项目(BJXCZX2022)