一株腐臭假单胞菌P683的多功能特性测定与基因组分析

Multifunctional characterization and genomic analysis of Pseudomonas taetrolens P683

摘要

假单胞菌因其具有广谱抑菌活性，在植物病害生物防治中具有突出的潜力。对一株腐臭假单胞菌（Pseudomonas taetrolens）P683的防病能力、病原菌广谱抗性以及植物促生指标进行检测，进一步通过基因组测序及功能注释、antiSMASH预测了次级代谢物合成相关基因。结果表明菌株P683能够有效防治烟草野火病；具有广谱病原细菌抗性，能够拮抗植物病原细菌番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、番茄细菌性溃疡病菌（Clavibacter michiganensis）、水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）、水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）、十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv. carnpestris）、番茄细菌性叶斑病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato）以及人和/或动物病原细菌沙门氏菌（Salmonella sp.）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；平板共培养发现，菌株P683与枯草芽胞杆菌相比具有更强的竞争能力；植物促生指标检测发现菌株P683具有水解无机磷和有机磷、产嗜铁素、产蛋白酶、产纤维素酶、分泌吲哚乙酸（IAA）和产NH₃的能力。基因组测序显示菌株P683基因组大小为4.96 Mbp，编码4 477个蛋白；antiSMASH预测得到7个次级代谢物生物合成基因簇，编码产物包含可能发挥抑菌活性的含内酯蛋白酶抑制剂和芳基多烯，为进一步解析菌株P683的抑菌机制以及开发菌株P683作为一种新型生防菌剂奠定了基础。

Abstract

Pseudomonas has outstanding potential in biological control of plant diseases because of its broad⁃spectrum antibacterial activity. In this study， a strain of Pseudomonas taetrolens P683 was tested for its disease prevention ability， pathogen broad⁃spectrum resistance and plant growth promoting index. The genes related to potential secondary metabolites were further analyzed by genome sequencing， functional annotation and antiSMASH prediction. The results showed that strain P683 could control tobacco wildfire disease effectively. Strain P683 could antagonize broad⁃spectrum pathogenic bacteria including Ralstonia solanacearum， Clavibacter michiganensis， Xanthomonas oryzae pv. oryzae， Xanthomonas oryzae pv. oryzicola， Xanthomonas campestris pv. carnpestris， Pseudomonas syringae pv. tomato， Salmonella sp.， and Staphylococcus aureu. Plate coculturing showed that strain P683 had stronger competitive capacity than Bacillus subtilis. Plant growth promoting index detection showed that strain P683 could hydrolyze inorganic and organic phosphorus， produce siderophore， protease， cellulase， IAA， and NH₃. Genome sequencing revealed that the genome size of strain P683 is 4.96 Mbp， encoding 4 477 proteins. Seven secondary metabolite biosynthetic gene clusters were predicted by antiSMASH， encoding products containing lactone protease inhibitors and arylpolyenes that may exert antibacterial activity. This study lays the foundation for further analysis of the bactericidal mechanism of strain P683 and development of strain P683 as a new biocontrol agent.

Graphical abstract

关键词

腐臭假单胞菌 / 拮抗 / 促生 / 生物防治

Key words

Pseudomonas taetrolens / antagonism / growth promoting / biocontrol

0 引 言

中国是传统农业大国，农业在中国国民经济中具有举足轻重的地位^［1］。然而植物病害的多发频发给我国农业带来巨大经济损失，严重威胁着中国的粮食安全。目前对植物病害的防治手段主要包括抗病品种选育、物理防治、化学防治和生物防治等^［2］。抗病品种选育具有育种周期长、易产生品种退化导致的抗病性丧失、其他病原菌发展为优势种群等问题，物理防治通过机械阻隔、热处理、射线等手段防治植物病害存在成本高、难以大范围进行等问题，化学防治施用的化学农药存在易残留的问题且长期使用会导致病原菌抗药性增强、环境污染和安全性等问题^［3，4］。应用微生物菌剂进行植物病害防治的生物防治手段是一种行之有效且环境友好的措施，具有广阔的应用前景^［5，6］。目前投入微生物菌剂生产的微生物主要包括假单胞菌（Pseudomonas）、芽胞杆菌（Bacillus）、链霉菌（Streptomyces）和木霉菌（Trichodoma）等^［7］。其中假单胞菌由于具有分布广泛、营养需求简单、繁殖速度快、环境适应性强、次级代谢物多样等优点已成为开发微生物菌剂的重要资源。

假单胞菌广泛分布在土壤、水和植物表面等多种环境中，是一类常见的革兰氏阴性杆状细菌。其中生防假单胞菌通常定殖在植物根际环境，参与植物营养代谢、增强植物抗逆能力，这类菌株被称为植物根际促生细菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）。目前研究较多的生防假单胞菌有荧光假单胞菌（P. fluorescens）^［8］、恶臭假单胞菌（P. putida）^［9］、绿针假单胞菌（P. chlororaphis）^{［10，11］}、斯氏假单胞菌（P. stutzeri）^［12］以及部分铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）^{［13， 14］}。生防假单胞菌的防病促生机制主要包括产抗生素类次级代谢物、产嗜铁素参与铁的竞争、竞争生态位、诱导植物系统抗性等^［15］。荧光假单胞菌2P24可以产生抗生素2，4⁃二乙酰基间苯三酚（2，4⁃DAPG）拮抗多种病原真菌和细菌如番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis）、棉花立枯病菌（Rhizoctonia solani）、西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）^{［16，17］}，并显著促进西瓜、甜瓜幼苗生长^［17］。猴假单胞菌（P. simiae）WCS417在拟南芥（Arabidopsis thaliana）根际定殖可以促进植物生长并诱导系统抗性从而抵抗病原菌的侵染^［18~20］。荧光假单胞菌WCS365可以在植物根表高效定殖，通过与病原真菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）竞争生态位防治番茄足病和根腐病^［21］。

为了丰富生防假单胞菌资源，更好地应用于微生物菌剂生产，本研究对一株腐臭假单胞菌（P. taetrolens）P683的防病能力以及病原菌拮抗和植物促生指标进行检测，对其基因组进行测序和功能注释并预测其次级代谢物生物合成基因簇，为后续探究菌株P683的防病机制以及应用于微生物菌剂开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

本研究的腐臭假单胞菌P683由实验室保藏，在King’s B（KB）培养基中培养，培养温度为28 ℃，具有氨苄青霉素抗性，抗生素使用浓度为50 μg/mL。防病实验中供试病原菌为烟草野火病菌（Pseudomonas syringae pv. tabaci），在KB培养基中培养，培养温度为28 ℃。拮抗及平板共培养实验中供试病原细菌、病原真菌、非病原菌及培养条件见表1。

1.1.2 供试培养基

① Luria⁃Bertani（LB）培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.0~7.2（固体培养基加琼脂12 g）。

② King’s B（KB）培养基：示蛋白胨3号20 g，MgSO₄·7H₂O 0.4 g，甘油10 mL，K₂HPO₄ 1.5 g，蒸馏水定容至1 000 mL（固体培养基加琼脂12 g）。

③ nutrient agar（NA）培养基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖2.5 g，琼脂12 g，pH 7.0，蒸馏水定容至1 000 mL。

④ PDA培养基：马铃薯薯块200 g，葡萄糖20 g，琼脂12 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

⑤ 无机磷培养基：葡萄糖10 g，（NH₄）₂SO₄ 0.5 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，Ca₃（PO₄）₂ 5 g，MgSO₄·7H₂O 0.03 g，MnSO₄ 0.03 g，FeSO₄ 0.003 g，酵母膏0.5 g，琼脂12 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

⑥蒙金娜有机磷培养基：葡萄糖10 g，（NH₄）₂SO₄ 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO₄·7H₂O 0.03 g，MnSO₄·4H₂O 0.03 g，蛋黄卵磷脂0.2 g，CaCO₃ 5 g，酵母膏0.4 g，琼脂12 g，蒸馏水定容至l 000 mL。

⑦ Chrome azurol S（CAS）蓝色定性检测培养基：取0.012 g 铬天青（chrome azurol sulphonate，CAS）溶于10 mL去离子水中，并与2 mL 1 mmol/L FeCl₃溶液混匀，得溶液a；取0.015 g十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，HDTMA）溶于8 mL去离子水中，得溶液b；将a液缓慢加入b液中，充分混合均匀即得到染液c；将0.1 mol/L磷酸盐溶液（2.427 g Na₂HPO₄·12H₂O，0.5905 g NaH₂PO₄·2H₂O，0.075 g KH₂PO₄，0.125 g NaCl，0.25 g NH₄Cl，去离子水100 mL，使用时10倍稀释）10 mL、哌嗪二乙醇磺酸（pipes）6.04 g加入盛有150 mL蒸馏水的干净三角瓶中，混匀并用50% NaOH溶液将pH调至6.8，最后加入4 g琼脂粉，得培养基d；将染液c、培养基d及1 mmol/L CaCl₂、1 mmol/L MgSO₄·7H₂O、20%葡萄糖、10%酪蛋白氨基酸灭菌（1l5 ℃，20 min）。分别量取上述1 mmol/L CaCl₂ 0.2 mL、1 mmol/L MgSO₄·7H₂O 4 mL、10%酪蛋白氨基酸6 mL、20%葡萄糖溶液2 mL加入培养基d中。再缓慢加入染液c，充分摇匀获得蓝色定性检测培养基。

⑧ 蛋白酶检测培养基：蛋白胨10 g，NaCl 5 g，CaCl₂ 0.1 g，脱脂牛奶100 mL（培养基灭菌后待温度降至45 ℃时加入），琼脂12 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

⑨ 羧甲基纤维素钠培养基：蛋白胨10 g，酵母粉10 g，羧甲基纤维素钠10 g，KH₂PO₄ 1 g，NaCl 15 g，琼脂12 g，蒸馏水定容至1 000 mL；

⑩ 蛋白胨氨化培养基：蛋白胨 5 g，K₂HPO₄ 0.5 g，NaCl 0.25 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 防病实验

参照文献［22］的方法，在平板上挑取过夜培养的新鲜的P683菌体重悬浮于无菌的10 mmol/L MgCl₂中，调节终浓度为5×10⁸ CFU/mL，并添加0.03%表面活性剂Silwet L⁃77，取10 mL上述菌液均匀喷施在4周龄本氏烟（Nicotiana benthamiana）叶片上，光照培养箱放置24 h，以喷施10 mmol/L MgCl₂作对照。在平板上挑取过夜培养的新鲜的烟草野火病菌菌体重悬浮于无菌的10 mmol/L MgCl₂中，调节终浓度为5×10⁷ CFU/mL，并添加0.03%表面活性剂Silwet L⁃77，取10 mL菌液均匀喷施在预先用P683菌液处理的本氏烟叶片上作为实验组，同时取10 mL菌液均匀喷施在预先用10 mmol/L MgCl₂处理的本氏烟叶片上作为病对照，以先后均喷施10 mmol/L MgCl₂处理的本氏烟叶片作为健康对照，放置在光照培养箱（24 ℃，70%湿度，16 h光照/8 h黑暗），7 d后观察并拍照。

1.2.2 病原细菌拮抗

将活化后的菌株P683和11株供试的病原细菌接种至对应的液体培养基，震荡培养至稳定期。NA/LB/KB固体培养基加热融化后，室温冷却至45 ℃，按照1∶100的比例加入病原细菌培养液，倒平板。晾干后，在平板上接种10 μL 1×10⁹ CFU/mL P683菌液，并于28 ℃培养箱倒置培养，每个处理设置3次重复。培养48 h后观察并测量抑菌圈直径。

1.2.3 病原真菌拮抗

将活化后的菌株P683接种至KB液体培养基，震荡培养至稳定期，6株供试病原真菌接种在PDA培养基上培养。用直径0.7 cm的打孔器，打取新鲜培养的病原真菌菌饼，用接种针挑取菌饼，菌丝朝下接种于新鲜PDA平板中心处，然后在距离菌饼约2.5 cm处接种10 μL 1×10⁹ CFU/mL P683菌液，晾干后于25 ℃培养箱倒置培养，每个处理设置3个重复。培养3~5 d后观察并测量抑菌带宽度。

1.2.4 非病原细菌共培养

将活化后的菌株P683和4株供试的非病原菌接种至对应的液体培养基，震荡培养至稳定期。在KB平板上分别接种3 µL待测菌株菌液，每株菌5个接菌点，在28 ℃培养箱倒置培养，每个处理设置3个重复。培养2 d左右观察菌落在平板上的形态。

1.2.5 水解无机磷和有机磷能力测定

将活化的菌株P683接种于KB液体培养基，在28 ℃，220 r/min条件下摇培过夜。取10 μL培养液分别点接于无机磷培养基和蒙金娜有机磷培养基平板上，每个处理设置3个重复。晾干后在28 ℃培养箱倒置培养5 d，观察是否出现水解圈。

1.2.6 产嗜铁素能力测定

将活化的菌株P683接种于KB液体培养基，在28 ℃，220 r/min条件下摇培过夜。取10 μL培养液点接于CAS蓝色定性检测培养基平板上，每个处理设置3个重复。28 ℃培养箱倒置培养3 d，观察菌落外围是否产生黄色晕圈。

1.2.7 产蛋白酶能力测定

将活化的菌株P683接种于KB液体培养基，在28 ℃，220 r/min条件下过夜摇培。取10 μL培养液点接于蛋白酶检测培养基平板上，每个处理设置3个重复。晾干后在28 ℃培养箱倒置培养2 d，观察是否出现透明圈。

1.2.8 产纤维素酶能力测定

将活化的菌株P683接种于KB液体培养基，在28 ℃，220 r/min条件下过夜摇培。取10 μL培养液点接于羧甲基纤维素钠培养基平板上，每个处理设置3次重复。晾干后在28 ℃培养箱倒置培养4 d后，倒入1 g/L刚果红染液覆盖平板，后用1 mol/L NaCl溶液进行漂洗，观察有无透明圈。

1.2.9 分泌吲哚⁃3⁃乙酸（indole⁃3⁃acetic acid，IAA）能力测定

采用Salkowski比色法测定细菌分泌IAA能力，将活化的菌株P683接种于含有0.8 g/L色氨酸的5 mL LB液体培养基中，28 ℃，220 r/min条件下震荡培养4 d，取100 μL培养液滴于白色陶瓷板上，同时加100 μL Salkowski比色液（50 mL 35% HClO₄，1 mL 0.5 mol/L FeCl₃），分别取100 μL 100 mg/L的IAA和100 μL LB液体培养基滴于白色陶瓷板上，加等量比色液作为阳性和阴性对照，每个处理设置3次重复，于室温避光放置30 min后观察，颜色变红者表示能够分泌IAA。

1.2.10 产NH₃能力测定

将新鲜培养的菌株P683转接到蛋白胨氨化培养基中，28 ℃，220 r/min摇培48 h。取200 μL培养液滴于白色陶瓷板上，以200 μL蛋白胨氨化培养基为对照。然后在培养液和蛋白胨氨化培养基中加入3滴纳氏试剂，每个处理设置3次重复，出现黄色或棕红色沉淀则表明菌株具备产NH₃的能力。

1.2.11 基因组测序及次级代谢物预测

将新鲜培养的菌株P683接种至5 mL KB液体培养基中，28 ℃，220 r/min摇培过夜。取2 mL菌液于10 000 g离心2 min收集菌体。使用细菌基因组DNA提取试剂盒（Solarbio，Cat#D1600）提取菌株P683基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。提取基因组样品后委托苏州金唯智生物科技有限公司对菌株P683进行全基因组测序。基于测序数据，使用软件Hifiasm（version 0.13⁃r308）、Canu（version 1.7）等进行组装，得到初步组装结果。之后，将质量过滤的二代测序数据比对到组装结果上，使用软件Pilon对组装结果进一步校正，得到最终的组装结果。使用软件Prodigal（version 2.6.3）对编码基因进行预测。分别利用tRNAscan及barrnap软件预测tRNA及rRNA区域，通过与Rfam（version 12.0）数据库进行序列比对获得其他非编码RNA。使用NR（Non⁃Redundant Protein Sequence Database）数据库、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库、COG（Clusters of Orthologous Genes）数据库、GO（Gene Ontology）数据库、CAZy（Carbohydrate⁃Active enZYmes）数据库、Pfam数据库、Swiss_Prot数据库、CARD（Comprehensive Antibiotic Resistance Database）数据库以及VFDB（Virulence Factor Database）数据库对编码基因进行功能注释。利用antiSMASH（version 7.0.0）预测菌株P683基因组上的次级代谢物生物合成基因簇，将菌株P683基因组序列FASTA格式文件上传至antiSMASH在线网站，检测标准选择“relaxed”后提交进行预测。

2 结果与分析

2.1 菌株P683防病能力检测

为了研究菌株P683的防病能力，本研究检测了菌株P683对烟草野火病的防治效果。烟草野火病是一种由烟草野火病菌引起的叶部病害。通过在本氏烟叶片上先后喷施菌株P683和烟草野火病菌，观察叶片发病程度。结果显示，叶片病部产生黑褐色水渍状小圆斑，周围有明显的黄色晕圈（图1）。与病对照相比，预先喷施P683菌液后再喷施烟草野火病菌菌液的本氏烟叶片发病程度明显减弱（图1），表明菌株P683对烟草野火病具有防治效果。

2.2 菌株P683拮抗病原菌能力检测

为了研究菌株P683的抑菌谱，本研究选取了11株病原细菌和6株病原真菌作为供试病原菌（表1），分别利用平板拮抗和平板对峙的方法检测了菌株P683对病原细菌和病原真菌的拮抗能力。结果显示，菌株P683对供试的8株病原细菌具有拮抗效果，其中对番茄青枯病菌的拮抗效果最强，产生的抑菌圈最大，对番茄细菌性溃疡病菌以及3株黄单胞菌也具有较好的拮抗效果，对番茄细菌性叶斑病菌的拮抗效果较弱；此外，菌株P683对人和/或动物病原细菌沙门氏菌和金黄色葡萄球菌也具有拮抗能力（图2和图3）。对病原真菌的平板对峙实验结果显示，菌株P683对6株供试的病原真菌均无抑菌效果（图4）。以上结果说明菌株P683具有广谱抗病原细菌的能力，具有被开发为生防菌剂的潜力。

2.3 菌株P683竞争能力检测

本研究探究了菌株P683在与非病原细菌共培养时的竞争能力，通过平板共培养法将菌株P683分别和荧光假单胞菌2P24、荧光假单胞菌Pf0⁃1、基尔假单胞菌F113以及枯草芽胞杆菌S847进行相邻接种，培养观察两株细菌菌落在接触生长过程中对生态位的竞争关系。结果显示，菌株P683在与3株同属的假单胞菌进行平板共培养时没有明显的竞争优势（图5）。而在与枯草芽胞杆菌S847进行平板共培养时，菌落接触部位显示菌株P683的菌落边缘圆滑，而枯草芽胞杆菌菌落边缘表现出明显的生长抑制（图5），表明菌株P683相比于枯草芽胞杆菌S847具有更强的竞争优势。

2.4 菌株P683促生指标检测

为了进一步探究菌株P683是否具有促生潜力，本研究对其水解无机磷和有机磷能力、解钾能力、产嗜铁素能力、产蛋白酶能力、产纤维素酶能力、产淀粉酶能力、产1⁃氨基环丙烷⁃1⁃羧酸（1⁃aminocyclopropane⁃1⁃carboxylate，ACC）脱氨酶能力、分泌IAA能力、产NH₃能力共10个指标进行了检测。结果显示，菌株P683能够水解无机磷和有机磷、产嗜铁素、产蛋白酶、产纤维素酶、分泌IAA以及产NH₃（图6），不具有解钾、产淀粉酶、产ACC脱氨酶的能力（数据未展示）。以上结果表明菌株P683具有潜在促生能力。

2.5 菌株P683基因组测序及功能注释

对菌株P683基因组进行测序拼接以及功能注释，最终得到完整的基因组信息（图7）。菌株P683的基因组大小约为4.96 Mbp，GC含量为58.22%，共有4 626个基因，其中包含4 477个蛋白编码基因，编码区域占整个基因组大小的88.72%（表2）。通过比对NR数据库、KEGG数据库、GO数据库、COG数据库、CAZy数据库、Pfam数据库、Swiss_Prot数据库、CARD数据库、VFDB数据库中的蛋白序列，对菌株P683全基因组编码基因进行功能注释，注释到的编码基因数量如图8所示。共有3 705个基因注释到COG功能分类上，其中525个基因被注释到主要功能预测上（占比14.17%），476个基因被注释到氨基酸转运和代谢上（占比12.85%），364个基因被注释到转录上（占比9.82%）（图9a）。CAZy是一个与碳水化合物降解、合成以及修饰相关的酶的数据库，将相关酶分类为糖苷水解酶类（glycoside hydrolases，GHs）、糖基转移酶类（glycosyl transferases，GTs）、多糖裂解酶类（polysaccharide lyases，PLs）、糖酯酶类（carbohydrate esterases，CEs）以及辅助酶类（auxiliary activities，AAs）。菌株P683基因组中共鉴定出363个CAZymes家族，包括172个GTs、100个GHs、40个CBMs、36个CEs、14个AAs、1个PLs（图9b）。

2.6 菌株P683次级代谢物生物合成基因簇分析

利用antiSMASH（version 7.0.0）预测菌株P683基因组上的次级代谢物生物合成基因簇，在“relaxed”标准下，预测得到7个次级代谢物生物合成基因簇，合成的次级代谢产物有氧还辅因子、嗜铁素（NRPS⁃independent siderophore，NI⁃siderophore）、N⁃乙酰谷氨酰胺（N⁃acetylglutaminylglutamine amide，NAGGN）、非核糖体肽合酶（Non⁃ribosomal peptide synthetase，NRPS）、I型聚酮合酶（type I Polyketide synthase，T1PKS）、含内酯蛋白酶抑制剂以及芳基多烯（表3）。其中嗜铁素生物合成基因簇与来自维氏固氮菌（Azotobacter vinelandii）CA的vibrioferrin生物合成基因簇具有100%的相似性，vibrioferrin生物合成基因簇在维氏固氮菌中高度保守并在铁限制条件下产生高浓度vibrioferrin嗜铁素^{［23，24］}。非核糖体肽合酶NRPS生物合成基因簇与来自防御假单胞菌（P. protegens）Pf⁃5的Pf⁃5 pyoverdine生物合成基因簇有19%的相似性，pyoverdine是由荧光类假单胞菌产生的荧光嗜铁素，参与铁离子的摄取^［25］。以上预测结果表明菌株P683可能产生多种嗜铁素参与铁离子的摄取。含内酯蛋白酶抑制剂生物合成基因簇与来自贝莱斯芽胞杆菌（B. velezensis）FZB42的fengycin生物合成基因簇有20%的相似性。fengycin是已知的一种抗菌脂肽，由β⁃羟基脂肪酸和10个氨基酸残基的小肽组成，对丝状真菌有良好的抑制作用^［26］。芳基多烯生物合成基因簇与来自费氏弧菌（Aliivibrio fischeri）ES114的芳基多烯Vf生物合成基因簇的相似性为40%。有研究报道由荧光假单胞菌NBC275产生的芳基多烯发挥了抗真菌和生防活性^［27］。菌株P683中预测得到的含内酯蛋白酶抑制剂和芳基多烯是否发挥拮抗活性有待进一步验证。

3 讨 论

随着中国对粮食安全和绿色农业可持续发展的需求，植物病害生物防治手段受到越来越广泛的关注。其中生防假单胞菌是一类重要的防病促生微生物资源，已被用来投入微生物菌剂的生产。对生防假单胞菌的挖掘有利于丰富微生物资源，为生防菌剂的开发提供更多优异的生产菌种。本研究对一株腐臭假单胞菌P683的防病、病原菌拮抗和植物促生指标进行了检测，发现菌株P683能够有效防治烟草野火病，同时具有广谱抗病原细菌的能力以及植物促生潜力。

在病原菌拮抗能力检测中，菌株P683对供试的8株病原细菌均有拮抗效果，表现出广谱抗病原细菌能力，包括植物病原细菌番茄青枯病菌、番茄细菌性溃疡病菌、水稻白叶枯病菌、水稻条斑病菌、十字花科黑腐病菌、番茄细菌性叶斑病菌以及人和/或动物病原细菌沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。然而菌株P683对供试的6株病原真菌均不具有抑菌效果。除了广谱抗病原细菌能力，在平板共培养和促生指标检测中，菌株P683也表现出优良的竞争能力和植物促生潜力。菌株P683能够水解无机磷和有机磷、产嗜铁素、产蛋白酶、产纤维素酶、分泌IAA和产NH₃，表明其在改良土壤、增强植物营养方面具有较高的应用潜力。

为了分析拮抗病原细菌的潜在次级代谢物，利用antiSMASH预测得到7个次级代谢物生物合成基因簇。其中含有两个嗜铁素生物合成基因簇Cluster 2和Cluster 4，可能参与了对外源铁离子的获取。与Cluster 4 NRPS相似的Pf⁃5 pyoverdine生物合成基因簇在假单胞菌中较为保守，负责运输细胞代谢所必需的铁^［28］，并且pyoverdine的产生使菌株在紫外下产生荧光。因此，Cluster 4可能是菌株P683产生荧光的原因。Cluster 1的氧还辅因子生物合成基因簇中的核心生物合成基因编码吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）生物合成蛋白PqqBCDEF。PQQ可以作为葡萄糖脱氢酶的辅因子氧化葡萄糖产生葡萄糖酸，进而参与细菌对无机磷的溶解^［29］。另外Cluster 3的NAGGN生物合成基因簇据报道在高渗透压条件下被诱导表达，帮助细菌抗渗透胁迫^［30］。尚未发现与Cluster 5的T1PKS序列相似的已知次级代谢物生物合成基因簇。Cluster 6的含内酯蛋白酶抑制剂生物合成基因簇和Cluster 7的芳基多烯生物合成基因簇分别与fengycin生物合成基因簇和芳基多烯Vf生物合成基因簇具有相似性，研究表明fengycin和芳基多烯Vf参与了对真菌的拮抗^{［26，27］}，而菌株P683对供试真菌不具有拮抗效果。因此，Cluster 6和Cluster 7的次级代谢物是否发挥对病原细菌的拮抗活性需要进一步验证。

假单胞菌营养需求简单、环境适应性较强、繁殖速度快、遗传操作简单、次级代谢物丰富等优点使其成为当前底盘细胞的理想研究对象^［31］。构建底盘细胞的一个重要策略是自上而下的基因组精简，因此清晰的遗传背景是底盘细胞理性设计的关键。菌株P683基因组测序分析显示，其基因组大小约为4.96 Mbp，GC含量为58.22%，含有4 477个蛋白编码基因。有研究统计了166株模式假单胞菌基因组大小发现，假单胞菌基因组大小变化范围在3.03 Mbp到7.38 Mbp之间，平均基因组大小为5.63 Mbp^［32］。菌株P683基因组大小低于假单胞菌平均基因组大小，表明其遗传背景简单，有望开发成为新型底盘细胞，在合成生物学领域具有较大发展潜力。

综上所述，对菌株P683防病、拮抗和促生指标的研究表明该菌株是一株十分有价值的生防菌株，有必要进一步检测菌株P683的田间防效和促生效果，解析菌株P683防病促生机制，分离纯化菌株P683发酵液中的具体活性物质，验证其田间防治效果，为微生物菌剂的开发提供指导。

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基金资助

国家重点研发计划(2022YFD1901300)

贵州省烟草公司遵义市公司重点研发项目(2021XM03)

北京市现代农业产业体系(BAIC04-2023-12)