祁连山青海云杉叶内生真菌的分离与鉴定

Isolation and identification of foliar endophytic fungi of Picea crassifolia in the Qilian Mountains

摘要

植物内生真菌对植物的生长发育及抗逆性具有重要作用。青海云杉（Picea crassifolia）是中国特有植物，也是祁连山的主要建群树种，而对其叶内生真菌的研究较少。本研究采用组织分离培养法，对青海云杉叶内生真菌进行分离培养，描述菌落形态特征，并结合rDNA ITS序列分析的方法，对分离的真菌进行鉴定。结果表明，从青海云杉叶分离获得32株真菌，隶属于1门4纲6目11科12属12种，均属于子囊菌门（Ascomycota）。其中，卡氏圆酵母（Torula camporesii）菌株数量最多，占分离菌株总数的18.75%，其次是澳大利亚小光壳（Leptosphaerulina australis），占15.63%。有14株菌是植物病原菌，其中有2株均为青海云杉枝枯病的病原菌——云杉壳囊孢（Cytospora piceae）。揭示了青海云杉可培养叶内生真菌的种类组成，获得了具有潜在研究价值的菌种资源，其研究结果是祁连山青海云杉相关研究的重要补充，为进一步研究青海云杉内生真菌潜在的生态与应用价值提供一定的理论依据。

Abstract

Endophytic fungi play important roles in plant growth， development， and stress resistance. Picea crassifolia， an endemic plant with great ecological value in China， serves as the primary tree species in the Qilian Mountains of China. However， there has been limited research on its foliar endophytic fungi. In this study， the culturable foliar endophytic fungi of P. crassifolia were isolated using tissue separation methods. Subsequently， these endophytic fungi were identified based on the morphological characteristics of their colonies and the rDNA ITS sequence analysis. The results showed that 32 fungal strains were isolated from the needles of P. crassifolia， belonging to 12 species， 12 genera， 11 families， 6 orders， 4 classes of 1 phylum （Ascomycota）. Among them， Torula camporesii had the highest isolation frequency （18.75%）， followed by Leptosphaerulina australis （15.63%）. Among 32 fungal strains， 14 were identified as pathogens of various plants， including 2 strains of Cytospora piceae， which are pathogens of P. crassifolia twig blight. This study revealed the composition of culturable foliar endophytic fungi of P. crassifolia and obtained fungal resources with potential research value. The research findings serve as a significant supplement to related studies on P. crassifolia in the Qilian Mountains， providing a theoretical foundation for further research on the potential ecological and application value of endophytic fungi of P. crassifolia.

Graphical abstract

关键词

祁连山 / 青海云杉 / 叶内生真菌 / 分离 / 鉴定

Key words

Qilian Mountains / Picea crassifolia / foliar endophytic fungi / isolation / identification

0 引 言

内生真菌是指一类整个或一段生活史生活在健康植物各组织和器官内部，但不引起宿主植物明显症状或对宿主造成明显伤害的真菌，包括一些潜伏性病原真菌、菌根真菌和生活史的某一阶段营表面生的腐生真菌^［1~3］。因此，植物内生真菌不仅指植物组织内正常的菌群，还指潜伏在宿主植物内的病原真菌以及与宿主植物互惠共利、共栖共生的真菌。内生真菌的宿主范围非常广泛，既有高等植物，也有低等植物。植物不同组织分离到的内生真菌数量不同，通常根、叶和种子的内生真菌较多^［4，5］。通过对内生真菌与宿主的专一性分析，平均每种宿主有4~5种专性内生真菌^［6］。按地球目前已知25万种植物计算，推测内生真菌总数至少有100万种^［7］。而目前被研究人员发现的仅占其10%^［8］，可见自然界中还存在大量未知的、有待挖掘的内生真菌资源。分子生物学技术的快速发展，大大加速了科研人员对微观世界生物多样性的探索，特别是高通量技术在该分支学科中的应用^［9，10］。虽然高通量技术具有高通量、快速和精准等优点，但高通量技术无法获得菌种资源。目前获得菌种资源的方式主要是微生物分离培养，它可以提供更具体、全面和深入的信息，有助于揭示微生物的生物学特性和潜在应用价值。

植物内生真菌与其宿主植物是共同进化的^［11］，二者形成了复杂的相互作用机制^［12］。一方面，宿主植物为内生真菌提供定殖场所和营养物质^［13］；另一方面，内生真菌在宿主的生长发育和系统演化过程中起了重要作用，如促进植物生长^{［14，15］}、提高植物抵御病原体^［16］、干旱^{［17，18］}以及盐度^［19］等生物和非生物胁迫的能力。此外，国内外陆续发现一些内生真菌能产生与宿主相同或相似的次生代谢产物^{［20，21］}，还可产生具有生物活性成分的新化合物等^［22］。近年来内生真菌已经成为筛选代谢产物的热点。研究表明，内生真菌的分布和种类与宿主植物的种类、植物所处的地理位置、温度和季节等有关^［23］。研究人员发现北美、欧亚大陆植物和地衣内生真菌群落组成和多样性的主要决定因素是宿主的差异性^［4］，而夏威夷岛山的原生双子叶植物叶内生真菌多样性和群落结构受蒸散发、距离衰减、太阳辐照和宿主特异性共同影响^［24］。此外，夏威夷岛上多形铁心木（Metrosideros polymorpha）的叶内生真菌具有很高的多样性，且其受降雨和温度调控^［25］。有研究者发现巴拿马西部森林中被子植物及灌木叶内生真菌的丰富度与温度呈季节性负相关，同时真菌群落结构和组成反映温度、季节和气候的变化^［26］。

青海云杉（Picea crassifolia）是中国特有树种，属于松科（Pinaceae）云杉属（Picea），主要分布在青海、甘肃、宁夏、内蒙古等地，分布面积广；在海拔2 350~3 500 m的阴坡和半阴坡，青海云杉呈带状或块状，常与半阳坡的草原成复合镶嵌，形成山地森林草原景观^［27］。青海云杉作为中国西部生态安全屏障祁连山的主要建群树种，在祁连山森林中分布最广、蓄积量最大^［28］，约占森林面积的90%^［27］，是祁连山重要的水源涵养林^［29］，在水土保持和生物多样性的维持等方面具有重要作用。对青海云杉相关真菌的研究主要在根系共生真菌^［30］，而对叶内生真菌的研究鲜有报道。本研究采用传统的微生物分离培养方法，首次对祁连山青海云杉叶内生真菌进行分离和鉴定，以期获得一些有潜在应用价值的内生真菌菌株，并为进一步探索青海云杉与内生真菌的相互关系提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况

祁连山位于青藏、内蒙古、黄土三大高原的交会处，是中国西北干旱半干旱地区主要山脉之一，是中国西部重要生态安全屏障，也是中国生物多样性优先保护区域^［31］。祁连山属于高山深谷地貌，海拔一般为2 000~4 000 m，最高峰团结峰高达5 826 m，按照祁连山地形的变化可将其分为东、中、西三段^［32］。祁连山属于大陆性高寒半干旱山地气候，年降水量300~500 mm，大部分集中在6-9月；年均气温为-0.6~2.0 ℃。植被大致可分为森林、灌丛、草原及荒漠四个植被带，在水平分布上自东南向西北逐渐变差；植被垂直带谱极其分明，从低海拔到高海拔依次为草原带、森林带和高山草甸草原带^［33］。

1.2 样品采集和处理

2021年8月，在祁连山从东到西近500 km范围内，选取10个青海云杉采集样地（表1）。每个样地采集5株青海云杉成熟、健康的针叶，共计50份样品，采回后置于-20 ℃的冰箱中保存。在实验室中，从每份样品中随机取一些针叶，先用流水冲洗表面杂质，后用无菌滤纸吸干水分，再装入无菌离心管中，用于后续实验。

1.3 叶内生真菌的分离纯化

采用组织培养法进行叶内生真菌分离纯化，分离纯化采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）^［34］。在超净工作台内，将准备好的针叶用无菌水漂洗3次后，置于75%乙醇中浸泡1 min；再置于0.5%次氯酸钠溶液中浸泡30 s^［35］；接着在75%乙醇中浸泡30 s，无菌水漂洗3次（最后一次漂洗的无菌水，吸取200 μL涂布于PDA平板上，以检查针叶表面消毒的效果），用无菌滤纸吸干水分；随后将针叶切成0.1~0.2 mm的组织薄片，每个PDA平板上放20~25个叶组织薄片，每份样品3个重复，置于25 ℃黑暗培养，培养5~10 d后，挑取组织边缘长出的菌丝转接至新PDA平板上纯化。若菌落形态有异，则进行二次转接，如此反复直至得到纯菌。将纯菌接种至PDA平板上继续培养，同时对菌种进行临时保藏。

1.4 叶内生真菌的鉴定

1.4.1 形态特征

观察并记录培养得到的内生真菌菌落形态，指标主要包括菌落颜色、菌落形状、是否有分泌物和菌折、边缘颜色及形状等。

1.4.2 分子鉴定

① 真菌DNA提取：在超净工作台内，从培养的纯菌落上用灭菌牙签挑取菌丝体约0.2 g，放入灭菌的1.5 mL离心管中，缓慢加入液氮将菌丝研磨成粉末，使用索莱宝真菌基因组提取试剂盒（Fungi Genomic DNA Extraction Kit）提取菌株基因组DNA，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行，提取的DNA用于后续实验。

② 真菌rDNA ITS序列PCR扩增：以提取的真菌基因组DNA为模板，采用真菌通用引物ITS1F （5′⁃TCCGTAGGTGAACCTGCGG⁃3′）和ITS4 （5′⁃TCCTCCGCTTATTGATATGC⁃3′）进行PCR扩增。PCR扩增体系（20 μL）：DNA模板2 μL，引物（10 μmol/L）各0.4 μL，Taq DNA Polymerase 0.3 μL，dNTP 2 μL，Taq Buffer 2.5 μL，ddH₂O补足20 μL。PCR程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性 1 min，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共35个循环，72 ℃延伸7 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并对检测合格的样品送至擎科生物科技有限公司（Tsingke，Beijing，China）测序。

③ ITS序列分析：测序所得序列，利用Contig Express（V3.0.0）软件拼接后在线提交至GenBank数据库，获得登录号。登录NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/），通过BLAST功能将测序序列与GenBank数据库中进行比对搜索，选择与原始序列相同性最高的参考序列。利用MEGA（7.0）软件通过其中Jukes⁃Cantor模型，使用最大似然法（maximum⁃likelihood method，ML），自展值bootstrap为1 000，构建系统发育进化树，进而从分子层面鉴定青海云杉可培养叶内生真菌的分类学位置。

2 结果与分析

2.1 叶内生真菌的形态特征

本研究从青海云杉健康、成熟的针叶中分离纯化得到了32株真菌。根据菌株形态差异，将其划分为18种形态型（表2，图1）。从结果可知，菌株的菌落颜色主要是白色、米白色等浅色系，而且菌落背面颜色与其正面存在差异，但个别菌株正反面颜色相近。菌落主要为圆形，其次是椭圆形和不规则形。另外，F、L表面有透明的液状分泌物，其余菌株菌落表面没有分泌物；B、C、F、I、K、L、P、Q、R均有菌折，其余菌落表面无菌折；这些菌株菌落的边缘形状有光滑全缘、放射状、毛边全缘和毛边四种类型，颜色有米白色、淡黄色；A、M、O和G的菌丝为絮状，其余为绒毡状、短绒状和毛毡状。

2.2 叶内生真菌的分子鉴定

2.2.1 真菌rDNA ITS序列比对

分离纯化得到的32个菌株进行测序，将序列提交至GenBank数据库中进行BLAST比对，青海云杉叶内生真菌的rDNA ITS序列同GenBank中真菌序列的相同性为96.71%~100%。所有菌株经BLAST两两比对，将覆盖度（query coverage）和相同性（percent identity）均高于97%的菌株默认为同种菌。本研究所获得的32株菌按照上述方法可划分为14种（表3）。其中，卡氏圆酵母（Torula camporesii）数量最多，占所有菌株的18.75%，且均分离自位于肃南裕固族自治县的一个采样地（S7），澳大利亚小光壳（Leptosphaerulina australis）数量次之，占15.63%，甘肃省肃南裕固族自治县（S3）和青海省祁连县（S6）的两个样地中均分离到该菌。此外，有5株菌均属于葫芦霉科（Cucurbitariaceae），占所有菌株的15.63%，这些菌株分离自3个不同的样地，分别位于甘肃省的肃南裕固族自治县（S4）、永昌县（S8）和天祝藏族自治县（S9）。此外，样地S4中分离到5种内生真菌，是所有样地中真菌种类最多的，样地S2、S3、S5分别分离到2种内生真菌，其余样地只分离到1种内生真菌。

2.2.2 构建系统进化树

32株菌中挑选17个代表菌株的rDNA ITS序列与相似序列使用MEGA（7.0）软件进行多序列比对并构建系统进化树。结果如图2所示，17个菌株（黑色加粗）全部隶属于子囊菌门，分属4个纲，其中有12个菌株，即F29、F31、F24、F22、F23、F27、F28、F6、F3、F25、F7、F25的序列聚集在一起，隶属于座囊菌纲（Dothideomycetes）；F17和F5这2个菌株的序列聚得很近，属于粪壳菌纲（Sordariomycetes）；F13和F19这2个菌株的序列聚在同一分支，隶属于散囊菌纲（Eurotiomycetes）。F16的序列单独聚在了一个分支，隶属于盘菌纲（Pezizomycetes）。

2.3 青海云杉叶内生真菌的类群组成

本研究中获得的32株内生真菌隶属于1门4纲6目11科12属12种，其中26株菌可鉴定到种水平，1株鉴定到属水平、5株鉴定到科水平（表4）。不同种类真菌的分离数量和所占比例差别较大（表3）。在所有菌株中，卡氏圆酵母、澳大利亚小光壳（L.australis）、葡萄茎枯病菌（Didymella glomerate）和极细链格孢（Alternaria tenuissima） 4种菌所占的比例较高，依次为18.75%、15.63%、9.38%、9.38%。亚隔孢壳科（Didymellaceae）菌株所占的比例最高，为25.01%，葫芦霉科次之，为15.63%。

3 讨论与结论

本研究以祁连山青海云杉的针叶为研究对象，利用传统微生物培养方法进行了叶内生真菌的分离培养，共获得32株真菌，对其进行rDNA ITS测序分析及形态学鉴定，隶属于1门4纲6目11科12属12种，其中可鉴定到种水平的有26株菌，仅鉴定到属水平的有1株，而鉴定到科水平的有5株，占分离菌株总数的15.63%，这5株菌可能为新发现的菌种，或可能是测序片段长度不足导致，因此需要进一步进行多片段测序鉴定。相较于高通量测序结果（未发表数据），培养获得的内生真菌种类较少，可能由于实验条件下，使用单一培养基对微生物进行培养，不能满足真菌对多种营养的需求，从而降低对内生菌的分离率^［36］。此外，相较马缨杜鹃（Rhododendron delavayi）^［37］、葡萄（Vitis vinifera）^［38］、龙脑樟（Cinnamomum camphora）^［39］等植物叶内生真菌的分离情况，本研究获得的内生真菌种类也是偏少的，推测可能针叶特殊生境及其特有次级代谢物质对大多数内生真菌的生存具有一定的挑战。此外，在针叶内生真菌培养过程中，可能忽略了针叶特殊性对内生真菌的影响^［40］。因此，如何在尽可能接近针叶的真实生境条件下来分离培养内生真菌，是值得思考的问题。

银杏（Ginkgo biloba）叶中分离到的内生真菌多属于半知菌门，少数属于子囊菌门^［41］。从华山松（Pinus armandii）针叶分离到15种内生真菌来自半知菌门，而仅有2种来自子囊菌门^［42］。从油樟（Cinnamomum longepaniculatum）叶内分离到的内生真菌除3株属于子囊菌门外，均属于半知菌门^［43］。而本研究从青海云杉叶内获得的内生真菌均属于子囊菌门，其与从红树林植物老鼠簕（Acanthus ilicifolius）叶片中分离到的内生真菌的结果相近^［44］。不同研究中分离到不同的植物内生真菌可能受分离方法、培养基的选择以及植物等多种因素的影响^［45］。此外，内生真菌的种类和数量在样地间存在差异，可能与不同样地的微环境差异有关^［46］。

本研究中获得的内生真菌，绝大多数是对植物有益的，可为植物生长提供所需的营养元素或提高植物对生物和非生物胁迫的抗性。从荒漠非多肉植物中分离到内生真菌木栖条光黑壳菌（Preussia lignicola），推测其与植物对干旱的抗性有关^［47］。类枝孢霉（Cladosporiumcladosporioides）可提高宿主植物种子的发芽率^［48］、合成特定的次级代谢产物^［49］、产生具有抗菌活性的代谢产物^［50］。黄薄毛盘菌（Tricharina gilva）为药用植物十数樟（Warburgia ugandensis）的内生真菌，具有产黄酮类、单宁、生物碱等的能力^［51］。赭曲霉（Aspergillus ochraceus）可产生抗枯草芽胞杆菌代谢产物^［52］，还可以提高大麦对盐胁迫的抗性^［53］。间型荚胞腔菌（Sporormiella intermedia）可促进宿主植物对微量元素的吸收^［54］。这些菌株具有很高的潜在应用价值，可进一步开展后续研究。但有一些内生真菌是可能会引起植物病害的潜伏性病原真菌，如葡萄茎枯病菌（D. glomerate），有报道称其可引起猕猴桃黑斑病^［55］、开心果叶枯病^［56］和玉米叶萎病^［57］等多种病害，由于该菌对植物的危害性较高，因此被列入中国《进境植物检疫性有害生物名录》^［58］。云杉壳囊孢（Cytospora piceae）为近几年新发现的一种引起青海云杉枝枯病的病原菌^{［59，60］}。此外，利用FUNGuild真菌功能注释平台^［61］对本研究分离到的真菌进行功能类群预测^［62］，结果显示部分真菌是病原菌及腐生菌（表5）。基于相关研究和FUNGuild注释结果（表5），祁连山青海云杉存在发生植物病害的潜在风险。由此可见，及时对青海云杉进行病害调查是很必要的，这对保障祁连山青海云杉的健康具有重要意义。

值得注意的是，本研究中的部分内生真菌既是一些植物的内生真菌，又是另一些植物的病原真菌。澳大利亚小光壳为药用植物海巴戟（Morinda citrifolia）的内生真菌^［63］，但发现这种菌能够引起紫花苜蓿叶斑病^{［64，65］}。极细链格孢为药用植物北桑寄生（Loranthus tanakae）和阿魏（Ferula assafoetida）的内生真菌^{［66，67］}，而一些报道称极细链格孢会引起猕猴桃叶褐斑病^［68］、山核桃叶黑斑病^［69］和南美藜穗枯病^［70］。Talaromyces funiculosus被报道为玉米穗腐病的病原菌^［71］，但另有文献中提到T. funiculosus分别为地衣和南非药用植物的内生真菌^{［72，73］}。这从侧面反映了同种真菌在不同的宿主植物间可能有不同的功能。有研究者认为植物内生真菌在发育学上不稳定的阶段，其在植物的不同生活周期中扮演不同的角色，即在植物组织健康生长的时候是内生真菌，但当组织衰老或死亡时则是腐生或病原真菌，这些具有复杂生活史的内生真菌有多种功能营养型可以相互转化，以采取不同的生存策略来适应环境的改变^［74］。在本研究中这些内生真菌的功能如何？角色如何？需要进一步地深入研究。

综上，本研究采用组织培养法首次对祁连山青海云杉叶可培养内生真菌进行分离鉴定，共获得32株14种内生真菌资源。研究资料表明，本研究获得的内生真菌既包含对植物有益真菌，又包含植物潜伏性病原真菌。而这些真菌与青海云杉的相互关系如何？目前尚不明确。下一步笔者拟分别开展分离所得内生真菌对青海云杉幼苗的促生作用和致病性研究，进一步探究促生真菌的潜在应用价值以及病原真菌的致病机制和防治措施。

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基金资助

第二次青藏高原综合科学考察研究(2019QZKK0301)

国家自然科学基金项目(U21A20186)

国家自然科学基金项目(32371592)

甘肃省自然科学基金重点项目(23JRRA1034)