海南习用药材酸藤子的质量标准研究

Study on quality standard for Embelia laeta，a native traditional medicine in Hainan

摘要

为了制定海南习用药材酸藤子的质量标准，以2020年版《中国药典》质量鉴定基本原则为指导，采用性状观察法、显微观察法、薄层色谱法、烘干法、总灰分测定法、水溶性热浸法、紫外⁃可见分光光度法分别研究酸藤子的性状和显微结构特征，水分、总灰分、水溶性浸出物以及总黄酮含量。明确了酸藤子性状和显微结构特征，建立了其薄层鉴别方法；拟规定酸藤子药材水分不得超过13.0%，总灰分不得超过12.0%，水溶性浸出物含量不得少于20.0%，总黄酮含量不得少于1.3%。初步拟定了海南习用药材酸藤子质量标准，为酸藤子进一步的质量控制和药用开发提供参考。

Abstract

In order to establish the quality standard of Embelia laeta， a native traditional medicine in Hainan， character observation method， microscopic observation method， thin layer chromatography， drying method， total ash determination method， water soluble hot leaching method， ultraviolet⁃visible spectrophotometry were used to study character and microscopic structure characteristics， water content， total ash， water soluble extract and total flavonoid content of E. laeta based on the basic principles of quality verification of Chinese Pharmacopoeia （2020 edition）. The characters and microstructure of E. laeta were clarified， and its thin layer identification method was established. It is suggested that the water content of E. laeta should not exceed 13.0%， the total ash content should not exceed 12.0%， the content of water⁃soluble extract should not be less than 20.0%， and the total flavonoid content should not be less 1.3%.This study preliminarily formulates the quality standard of E. laeta folkly used in Hainan， and provides reference for further quality control and medicinal development of E. laeta.

Graphical abstract

关键词

酸藤子 / 质量标准 / 习用药材

Key words

Embelia laeta / quality standard / native traditional medical material

0 引 言

酸藤子为紫金牛科（Myrsinaceae）酸藤子属（Embelia Burm.f.）植物酸藤子〔Embelia laeta （L.） Mez〕和白花酸藤果（E. ribes Burm）的干燥叶。酸藤子为攀援灌木或藤本，稀小灌木，长1~3 m，生长在海拔100~1 500 m的山坡疏、密林下，疏林缘或开阔的草坡、灌木丛中^［1］。酸藤子别名甜酸叶（海南）、酸果藤、咸酸果（广西）、信筒子（福建）等^［1］。酸藤子叶可治维生素C缺乏症、贫血等，还可捣烂敷跌打肿痛，取汁涂搽皮肤瘙痒^［2］。《中华本草》中记载酸藤子可清热解毒、散瘀止血，主治咽喉红肿，皮肤瘙痒、跌打损伤等^［3］。白花酸藤果为攀援灌木或藤本，长3~6 m，有时达9 m以上，生长在海拔50~2 000 m的林内、林缘灌木丛中，或路边、坡边灌木丛中^［1］。白花酸藤果别名羊公板仔（海南）、枪子果（云南）、脾蕊（广东）、白花酸藤子、酸味蔃等^［1］。《中华本草》记载白花酸藤果叶有活血调经，清热利湿，消肿解毒的功效，主治小儿头疮，皮肤瘙痒，跌打损伤等^［3］。酸藤子富含醌类、黄酮类、甾体类、酚酸类、挥发油类等成分^［4~6］。研究表明酸藤子还具有抗炎、抗菌、抗氧化等药理活性^［7~9］。

近年来，国内外对酸藤子化学成分和药理作用方面的研究逐年增多，但是还未明确统一酸藤子药材的质量标准。目前有对酸吉风（紫金牛科酸藤子的干燥根）质量标准进行初步研究^［10］，以及广西壮族自治区药品监督管理局制定了酸吉风的质量标准^［11］。本论文通过研究海南10批酸藤子药材，拟制定其质量标准，为酸藤子药材质量控制以及进一步药用开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材

本实验用的10批酸藤子药材分别采自海南省屯昌县、儋州市、海口市、定安县、琼中黎族苗族县等地，以上地点均属热带季风气候，具有风向多变、湿度较高、雨量充沛等气候特点。十批药材样品经中国医学科学院药用植物研究所海南分所李榕涛助理研究员鉴定，均为紫金牛科酸藤子属植物酸藤子野生种^［12］，样品信息见表1。其中，采于琼中黎族苗族县阳江农场25队（编号：STZ20230410QZ05）为酸藤子对照药材，弃去杂质和枝干，叶片在45 ℃烘干而得。酸藤子对照药材、白花酸藤果药材（样品编号：BHSTG20230410QZ10），见图1。

1.1.2 试剂

芦丁（批号：DSTDL001701；成都德斯特生物技术有限公司）、β⁃谷甾醇（纯度：98%；成都埃法生物科技有限公司）、pH=5.4的醋酸⁃醋酸钠缓冲液（厦门海标科技有限公司）、无水乙醇、三氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、三氯化铝（西陇科学，均为国产分析纯）。

1.1.3 仪器

ECLIPSE80i型生物显微镜（尼康映像仪器销售有限公司）、CM1950冷冻切片机（Leica Biosystems Nussloch Gmbh）、UV⁃1900紫外可见分光光度计（岛津仪器江苏有限公司）、YTH⁃4⁃10定时箱式电阻炉（绍兴市苏珀仪器有限公司）、1/10万电子天平（托利多（上海）有限公司）、DHG⁃9053A电热恒温鼓风干燥箱（浙江托普仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 性状鉴别

以2020年版《中国药典》四部0212性状检定方法为指导原则^［13］，对酸藤子药材的形状、大小、表面色泽与特征及气味等进行观察并描述。

1.2.2 显微鉴别

以2020版《中国药典》四部2001显微鉴别法为指导原则^［13］，将干燥酸藤子叶片和白花酸藤果叶片用水浸泡软化后，用刀片截取叶片中脉部分，再用冷冻切片机切片，切片加水合氯醛试液透化，放在载玻片上，盖上盖玻片后在显微镜下观察两种药材的叶片中脉横切面特征。

1.2.3 薄层色谱鉴别

将酸藤子药材粉末过四号筛，分别取粉末1.0 g，加三氯甲烷20 mL，超声提取30 min，抽滤，滤液用水浴锅蒸干，蒸干后向蒸发皿中加1 mL三氯甲烷溶解残渣，即得供试品溶液。取β⁃谷甾醇对照品加三氯甲烷溶解，制成1 mg/mL的对照品溶液。另取酸藤子对照药材1.0 g（过四号筛），制备方法同供试品溶液，作为对照药材溶液。

参照2020年版《中国药典》四部薄层色谱法试验^［13］，分别吸取供试品溶液、β⁃谷甾醇对照品溶液、对照药材溶液各5 μL，将三种溶液点在同一硅胶G板上。放入正己烷和乙酸乙酯（体积比为8∶2）的展开缸中，展开后晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，之后放在105 ℃的烘箱中加热至硅胶G板上的色谱点显色清晰，取出后在日光下检视。

1.2.4 浸出物、总灰分、水分含量测定

浸出物、总灰分、水分含量测定，分别按照2020年版《中国药典》四部通则下水溶性浸出物测定法（热浸法）、总灰分测定法、烘干法进行测定。

1.2.5 总黄酮含量测定

①对照品溶液制备：用1/10万电子天平精密称取芦丁对照品6.03 mg，加入70%乙醇溶解，定容至50 mL容量瓶中，摇匀，配置成浓度为0.12 mg/mL的芦丁对照品溶液。

②供试品溶液制备：精密称取酸藤子样品粉末1.0 g，按照表2正交试验设计表中的乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数进行超声提取，抽滤，合并滤液于100 mL容量瓶中，剩余体积用相应浓度乙醇补足，定容至刻度线，摇匀。

③正交试验优选酸藤子总黄酮提取条件：选取乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）和提取次数（D）为试验因素，以酸藤子总黄酮含量为指标进行正交试验。

④测定波长选择：精确吸取芦丁对照品溶液3 mL于25 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L的AlCl₃溶液4 mL，pH=5.4醋酸⁃醋酸钠缓冲液5 mL，用水定容至刻度线，混匀，放置20 min，以不加芦丁对照品溶液的试剂为空白对照，在紫外可见分光光度计200~800 nm范围内进行全波长扫描。

⑤线性关系考察：精密吸取对照品溶液1.25，2.50，3.75，5.00，6.25 mL于25 mL容量瓶中，按“1.2.5.④”项下方法显色后，以不加芦丁对照品溶液的试剂为空白，在最佳检测波长处测吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线。

⑥精密度试验：精密称取酸藤子药材（样品编号：STZ20230221HK03）粉末1.0 g，根据正交试验得出的最佳提取条件制备供试品溶液，精密吸取6份1 mL的酸藤子供试品溶液，按上述方法同法操作，分别显色测定6次，在最佳检测波长处测吸光度，计算相对标准偏差RSD。

⑦重复性试验：精密称取酸藤子药材（样品编号：STZ20230221HK03）粉末6份，每份1.0 g，根据正交试验得出的最佳提取条件制备供试品溶液，精密吸取1 mL，分别显色测定6次，在最佳检测波长处测吸光度，计算相对标准偏差RSD。

⑧稳定性试验：精密吸取酸藤子药材（样品编号：STZ20230221HK03）供试品溶液1 mL，按上述方法同法操作，显色后分别在0、10、20、30、45、60、90 min时，在最佳检测波长处测吸光度，计算相对标准偏差RSD。

⑨加样回收试验：精密称取酸藤子药材（样品编号：STZ20230221HK03）粉末1.0 g，根据正交试验得出的最佳提取条件制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液1 mL，按“1.2.5.②”项下方法制备供试品溶液，在25 mL容量瓶中加入一定量的芦丁对照品溶液，经显色反应后在最佳检测波长处测吸光度，计算相对标准偏差RSD。

⑩总黄酮含量测定：根据正交试验得出的最佳提取条件对10批酸藤子药材提取，制备供试品溶液。按“1.2.5.④”项下方法显色后，在418 nm处测定吸光度值，计算十批酸藤子药材的总黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 性状鉴别

对10批酸藤子药材进行性状观察，总结如下。酸藤子：叶片略卷曲，展平后倒卵形或椭圆形，长5~11 cm，宽1~2.5 cm，先端钝圆或微凹，基部楔形，全缘，侧脉不明显。上表面灰绿色或黄绿色，无腺点，两面无毛，叶柄长5~20 mm，叶片革质，气微，味酸、涩。

白花酸藤果：叶片略卷曲，展平后倒卵形或椭圆形，长5~10 cm，宽1.5~3 cm，先端钝圆或钝渐尖，基部楔形，全缘，侧脉不明显。上表面绿色或灰绿色，无腺点或腺点不明显，下表面有时被薄白粉，两面无毛，叶柄长3~10 mm，叶片革质，气微，味微酸、涩。

2.2 显微鉴别

酸藤子叶片横切图见图2A：上表皮细胞1列，形状较大，外被角质层。下表皮细胞较小，类圆形，外被角质层，可见腺鳞。栅栏组织1列，维管束外韧型，叶肉及薄壁组织中具分泌道及黄棕色内含物。

白花酸藤果叶片横切图见图2B：上表皮细胞1列，形状较大，外被角质层，下表皮细胞较小，类圆形至扁方形，外被角质层。栅栏组织1列，维管束外韧型，叶肉及薄壁组织中具分泌道及黄棕色内含物。

酸藤子粉末显微鉴别见图3。酸藤子药材粉颜色为黄棕色或绿色。叶表皮细胞多角形，垂周壁稍弯曲，气孔平轴式，副卫细胞2个，草酸钙簇晶存在于叶肉薄壁细胞中，多见。纤维成束或单个散在，导管为环纹导管和网纹导管。

2.3 薄层色谱鉴别

以样品5为对照药材，在薄层色谱相应位置上，9批酸藤子药材供试品与β⁃谷甾醇对照品、酸藤子对照药材显相同玫红色斑点，见图4。

2.4 浸出物、总灰分、水分含量测定

10批酸藤子药材的浸出物、总灰分、水分含量结果见表3。10批次酸藤子药材水溶性浸出物测定结果为27.09%~31.78%，平均含量为29.88%；总灰分测定结果为4.50%~9.83%，平均含量为6.19%；水分测定结果为6.78%~11.42%，平均含量为8.22%。

2.5 总黄酮含量测定

2.5.1 酸藤子总黄酮提取条件优选结果

由正交试验结果（表4）可知，A（乙醇浓度）、B（料液比）、C（提取时间）、D（提取次数）4个因素对酸藤子总黄酮提取率影响程度大小为：R_A>R_D>R_B>R_C，乙醇浓度影响最大，提取时间影响最小。根据表4正交试验直观分析结果，得到三氯化铝比色法超声提取酸藤子总黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇水溶液浓度为90%，料液比为1∶20，提取时间为30 min，提取次数为3次，即A₃B₃C₁D₃。

2.5.2 测定波长选择

芦丁标准品溶液显色后在200~800 nm范围内进行紫外扫描，结果发现芦丁对照品溶液有3个吸收峰，分别在209.00、272.50、418.00 nm，见图5。考虑到酸藤子药材中其他混合成分对测定结果的影响，选择可见光区的418 nm为测定波长。

2.5.3 线性关系考察

以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线。测得回归方程：y=35.78x+0.011 5，R²= 0.999 4。

2.5.4 精密度考察

测得吸光度平均值为0.331，RSD为0.92%，表明仪器精密度良好。

2.5.5 重复性试验

测得吸光度值的RSD为1.50%，表明该方法重复性良好。

2.5.6 稳定性试验

测得吸光度值的RSD为0.21%，表明该供试品溶液在90 min内稳定性良好。

2.5.7 加样回收试验

测得酸藤子药材总黄酮平均加样回收率为97.56%，RSD为0.74%，表明该方法准确度良好。

2.5.8 总黄酮含量测定

按干燥品计，10批酸藤子药材的总黄酮含量为1.64%~2.91%，样品7的白花酸藤果药材总黄酮含量最低，有1.64%，样品10的白花酸藤果药材总黄酮含量最高，有2.91%，见表3。

3 讨 论

3.1 酸藤子和白花酸藤果均可作为酸藤子药材基原

酸藤子和白花酸藤果都是紫金牛科酸藤子属植物。研究结果表明，两种药材的性状和显微特征相似，薄层色谱图斑点位置基本一致。酸藤子药材水分为6.90%~11.42%，白花酸藤果药材水分为6.78%~8.57%，因此两者水分有些许差异。酸藤子药材总灰分为4.50%~6.78%，白花酸藤果药材总灰分为5.99%~9.83%，白花酸藤果总灰分高于酸藤子，这可能是因为白花酸藤果叶片含有的纤维较多^［14］。酸藤子药材水溶性浸出物含量为27.09%~33.30%，白花酸藤果药材为24.96%~31.78%，因此两者水溶性浸出物含量差别不大。酸藤子药材总黄酮含量为1.80%~2.55%，白花酸藤果药材总黄酮含量为1.64%~2.91%，因此两者总黄酮含量差别不大。综上所述，酸藤子药材和白花酸藤果药材的质量指标差异不大，两个药材均可作为酸藤子药材基原。

3.2 限量标准

研究结果表明，10批酸藤子药材水分含量为6.78%~11.42%，将10批酸藤子药材水分含量最大值乘120%^［15］，可得酸藤子药材水分含量限定标准：11.42%×1.20=13.7%，故酸藤子药材水分含量应≤13.0%。10批酸藤子药材总灰分含量为4.50%~9.83%，将10批酸藤子药材总灰分含量最大值乘120%，可得酸藤子药材总灰分含量限量标准：9.83%×1.20=11.8%，故酸藤子药材总灰分含量应≤12.0%^［16］。10批酸藤子药材水溶性浸出物含量为24.96%~33.30%，将10批酸藤子药材水溶性浸出物含量最小值乘80%^［16］，可得酸藤子药材水溶性浸出物含量限量标准：24.96%×0.80=20.0%，故酸藤子药材水溶性浸出物含量应≥20.0%。

3.3 总黄酮含量

本研究采用超声提取法提取酸藤子药材总黄酮，并采用正交试验优选提取条件，按最佳优选条件进行提取，结果显示，10批酸藤子药材总黄酮含量为1.64%~2.91%，将10批酸藤子药材总黄酮含量的最小值乘80%，得到酸藤子药材总黄酮含量限定标准：1.64%×0.8≈1.3%，故酸藤子药材按干燥品计算，总黄酮含量应≥1.3%。由此结果可知，来自海南不同地区的酸藤子药材、白花酸藤果药材总黄酮含量差异明显。文献报道酸藤子叶的总黄酮提取率为1.01%~1.66%^［17~20］，通过正交试验优选酸藤子总黄酮提取条件，总黄酮提取率显著提高。酸藤子叶、白花酸藤果叶富含黄酮类化合物，黄酮类药物具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤作用等，可治疗炎症、心脑血管等疾病。因此，研究总黄酮含量对制定酸藤子药材质量标准具有重要意义。

4 结 论

酸藤子和白花酸藤果在海南各地极为常见，分布广泛，资源丰富。酸藤子叶富含氨基酸、矿物质元素，如钾、钙、镁、铁等。其中钾含量为1.44%，这说明酸藤子有潜在的家禽饲料、食品、药品开发价值。酸藤子作为海南黎医常用药之一，药效明确，有较高的药用价值。本研究以2020年版《中国药典》质量检定基本原则为指导，通过研究酸藤子药材的性状和显微特征、薄层色谱、水分、总灰分、水溶性浸出物、总黄酮含量，初步拟定了酸藤子药材质量标准。为确保酸藤子药材临床疗效及用药安全，今后应加强对其质量控制方面的研究，为海南习用药材酸藤子的药用开发提供参考。

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基金资助

海南省重大科技计划项目(ZDZX2021034)

万宁市科研项目(2022wnkj10)