提高微生物角蛋白酶产量和催化性能的研究进展

Research progress on improving the production and catalytic performance of microbial keratinase

摘要

角蛋白酶是一类能水解难溶性角蛋白废物的广谱蛋白酶，在饲料、肥料、医疗、制革和洗涤剂等领域具有良好应用前景。但目前已报道的天然角蛋白酶存在产量低、活性低和稳定性差的问题，限制了角蛋白酶的应用。提高角蛋白酶产量和催化性能的策略主要包括寻找新的角蛋白酶资源、改造天然宿主、异源表达、优化发酵条件和通过随机突变与（半）理性设计修饰角蛋白酶。利用上述一种或多种策略，有望提高角蛋白酶产量和催化性能，缩短生产时间，降低生产成本，促进角蛋白酶在各领域的应用。

Abstract

Keratinase is a kind of broad⁃spectrum protease capable of hydrolyzing insoluble keratin waste， and has good application prospects in fields such as feed， fertilizer， medical treatment， leather making， and detergent. However， low yield， low activity， and poor stability are the main problems limiting the application of natural keratinase. This review focuses on recent progress in the strategies to improve the production and catalytic performance of keratinase， including searching for new keratinase resources， modifying natural hosts， heterologous expression， optimizing fermentation conditions， and modifying keratinase through random mutations and （semi） rational design. By utilizing one or more of the above strategies， it is expected to increase the yield and catalytic performance of keratinase， shorten production time， reduce production costs， and promote the application of keratinase in various fields.

Graphical abstract

关键词

角蛋白酶 / 产量 / 催化性能

Key words

keratinase / yield / catalytic performance

0 引 言

角蛋白酶（keratinase）是一类能够水解如牛毛、头发、羽毛和指甲等富含二硫键、结构稳定的不溶性角蛋白的蛋白水解酶，大多数由细菌、真菌或放线菌产生^［1］，通常是一种较为广谱的胞外蛋白酶，对酪蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白等其他底物也具有水解活性^［2］。由于角蛋白酶在角蛋白废物处理、医疗、美容、制革和洗涤剂添加等方面具有良好的应用前景，因此被广泛研究和应用。目前人们已从自然界中获得了多种角蛋白酶，但生产角蛋白酶的天然菌株存在发酵周期长、角蛋白酶产量低和菌株本身可能具有致病性等问题^［3］，这会延长角蛋白酶的生产时间和提高其生产成本。此外，角蛋白酶的工业化应用场景涉及复杂多样的极端条件，如颗粒饲料的造粒过程需要高温，这意味着利用角蛋白酶处理角蛋白废物以生产饲料时会涉及高温条件；又如在洗涤剂中添加角蛋白酶时，要求角蛋白酶能够耐受洗涤剂中的氧化剂、漂白剂、表面活性剂和碱性环境等^［4，5］。而天然角蛋白酶存在催化活性低和稳定性差的问题，限制了角蛋白酶的广泛应用。因此，需要通过一定的手段提高角蛋白酶的产量，优化角蛋白酶性能，降低生产成本，以促进其在各领域的应用。

1 角蛋白酶基本性质

角蛋白酶通常是一种较为广谱的蛋白酶，能水解角蛋白、酪蛋白、胶原蛋白等多种底物。一般是根据同一种酶对角蛋白水解活性和酪蛋白水解活性的比值，即K∶C，来区分角蛋白酶。当K∶C值大于0.5时，该酶被认为是一种潜在的角蛋白酶，反之则不是^［6］。

目前报道的角蛋白酶通常由信号肽、N端前肽和成熟酶构成^［7］，部分角蛋白酶还具有独立的C端延伸区，如角蛋白酶KerSMD^［8］。信号肽能引导新合成的角蛋白酶分泌到胞外，前肽作为分子伴侣参与角蛋白酶的加工成熟^［9］，C端延伸区中存在一些氨基酸或结构域会影响角蛋白酶的稳定性和活性^{［8， 10］}。大多数角蛋白酶属于subtilase家族^［9］，含有Ca²⁺结合位点，所结合的Ca²⁺能使酶的结构更紧凑而起到稳定酶的作用^［7］。

不同来源的角蛋白酶性质有所差异，但目前已报道的大多属于丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，活性会被苯甲基磺酰氟（phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF）或EDTA抑制^［10］，分子量通常在25~50 kDa^［5］，最适pH一般在pH 7~10，最适反应温度大多在40~60 °C^［9］。

2 发掘新的角蛋白酶资源

目前已报道的角蛋白酶绝大部分由微生物产生，但自然界中超过99%的微生物并未被分离^［11］。含有较多角蛋白废物的环境如家禽养殖场等通常存在能产生角蛋白酶的微生物。在极端环境中生活的微生物，其所产蛋白酶能适应极端条件。因而，在含有角蛋白废物的极端自然环境中有望获得具有高产量和良好催化性能的角蛋白酶，从而推动角蛋白酶在各领域的应用。

2.1 分离新的角蛋白酶产生菌

分离具有角蛋白降解活性菌株的大致过程如图1所示。从热喷泉中分离得到阿尔及利亚热粪杆菌TH7C1T（Caldicoprobacter algeriensis TH7C1T），所产角蛋白酶KERCA在50 °C的半衰期达168 h，在含硫醇试剂的条件下50 °C处理1 h，仍维持100%活性^［12］，能对羊和牛的皮革完全脱毛，表明KERCA对高温和化学试剂具有耐受性，在皮革加工等领域具有应用前景。但该方法建立在微生物分离和培养基础上，而自然界中只有不到1%的微生物能用现有的培养技术培养^［13］。因此，这种方法获取角蛋白酶资源具有一定的局限性。

2.2 宏基因组法

宏基因组法大致步骤如图2所示，该方法克服了微生物难以培养的缺点^［14］。获得宏基因组文库后，进一步进行DNA测序和角蛋白酶活性测定以鉴定角蛋白酶基因。如利用宏基因组法，从江苏省某皮革工厂的土壤和水样中分离得到角蛋白酶基因kerBv^［13］，实验表明，1 mmol/L Ni²⁺、Cd²⁺、Fe³⁺等金属离子和1%（V/V）吐温、曲拉通等表面活性剂能增强角蛋白酶KerBv的活性，暗示该酶在皮革加工、洗涤剂等领域具有应用前景。

但公共蛋白质数据库（如UniProtKB）的信息并不全面，且存在大量未经实验表征的不确定和错误标注数据，构建宏基因组文库所选的宿主和载体不能百分百确保蛋白酶能正常表达和成熟^{［14， 15］}，这些问题限制了宏基因组法的应用。目前，研究人员已从自然界中分离到众多角蛋白酶，在https：//lens.org网站中以keratinase为关键词，能搜索到4 891项关于角蛋白酶的专利（截至2024年2月6日）。因此，对现有角蛋白酶进行改造、提高其产量和改善其催化性能的思路，受到了研究者青睐。

3 提高角蛋白酶产量

天然菌株产角蛋白酶通常是营养胁迫诱导的，只会产少量的角蛋白酶来缓解营养压力^［3］。改造天然宿主、异源表达和优化发酵条件能提高角蛋白酶产量，降低生产成本，促进其应用。

3.1 改造天然宿主菌

分泌角蛋白酶的天然宿主具备水解角蛋白废物的能力，可借助过表达和菌株改造等技术提高天然宿主的角蛋白酶产量，以增强其降解角蛋白废物的能力。构建来自于链霉菌属（Streptomyces sp.）菌株SCUT⁃3的角蛋白降解相关酶基因sep39的过表达质粒，转入原宿主SCUT⁃3中，使菌株的角蛋白降解活性增加至原始菌的4倍^［16］。芽胞杆菌产芽胞相关基因的表达往往会抑制蛋白酶的产生，敲除或过表达蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus）NYA101中产芽胞相关调控基因，获得了不产芽胞的突变株，突变株所产角蛋白酶活性约为原始菌株的2倍^［17］。

3.2 异源表达

部分角蛋白酶产生菌具有致病性^［10］，这会限制致病微生物及其所产角蛋白酶的应用。克隆致病微生物的角蛋白酶基因并进行异源表达，有望克服该问题。

3.2.1 宿主的选择

表1展示了角蛋白酶异源表达常用宿主及其优缺点。选择合适的宿主，能提高角蛋白酶产量。如将枯草芽胞杆菌（B. subtilis）B⁃3的角蛋白酶基因kerC在毕赤酵母（Pichia pastoris）X⁃33菌株异源表达时，角蛋白酶活力是其在大肠杆菌（Escherichia coli）中异源表达的11.15倍^{［18，19］}。目前常用宿主存在分泌量较低和密码子偏好性等问题，可利用密码子优化、启动子工程等手段，进一步提高角蛋白酶异源表达的产量。

3.2.2 启动子选择

使用角蛋白酶基因上游的天然启动子表达角蛋白酶，产量往往较低，难以满足大规模生产的需求^［7］。将角蛋白酶基因插入强启动子之后，能提高角蛋白酶产量^［11］。用枯草芽胞杆菌基因组数据库中的aprE启动子替换角蛋白酶基因kerBv的原始启动子后，转入枯草芽胞杆菌WB600中异源表达，使角蛋白酶KerBv的产量提高了约15.8倍^［20］。

3.2.3 信号肽优化

角蛋白酶在异源宿主中积累会限制产量的增加，信号肽能引导新合成的角蛋白酶分泌到胞外，从而促进其产量提高^［9］。但不同信号肽对同一蛋白分泌的引导水平并不相同，且异源表达蛋白本身的信号肽可能对表达宿主有害^［3］。因此，选择合适的信号肽促进角蛋白酶在异源宿主中的分泌，能提高角蛋白酶的产量^［5］。将芽胞杆菌属（Bacillus sp.）菌株LCB12的角蛋白酶基因在枯草芽胞杆菌SCK6中异源表达^［21］，通过替换天然信号肽使角蛋白酶胞外产量提高为野生型的2倍。

3.2.4 前肽改造

角蛋白酶中的前肽作为分子伴侣，会协助成熟酶结构域进行正确折叠，并暂时结合在成熟酶区域形成无活性的前肽⁃酶复合物。成熟酶在前肽的C端与成熟酶连接的位置进行切割，释放并降解前肽后，才能得到成熟的有活性的角蛋白酶^{［9， 22］}。因此，在前肽的适当位置改造，提高角蛋白酶的折叠速率，能提高其表达量^［5］。来自地衣芽胞杆菌（B. licheniformis）BBE11⁃1的角蛋白酶会在前肽C端的-1位点的Leu处切割，将该位点Leu突变成Ala后，角蛋白酶产量较野生型提高了50%^［22］。

3.2.5 密码子优化

密码子具有偏好性，如果角蛋白酶基因中存在稀有密码子，或其对应的同义密码子与异源宿主偏好的不一致，则可能会导致角蛋白酶产量降低。对角蛋白酶基因进行密码子优化，能在不改变所编码氨基酸的前提下提高翻译速率，从而提高重组角蛋白酶产量^{［3， 7］}。将地衣芽胞杆菌S90角蛋白酶基因kerA的密码子，替换成毕赤酵母偏好的密码子后在毕赤酵母中表达，密码子优化后菌株的角蛋白降解活性是优化前的两倍^［19］。

3.2.6 染色体整合

由于质粒拷贝数不稳定，因此利用质粒作为异源表达载体时常常要使用抗生素来维持其稳定，这意味着角蛋白酶产量不稳定且生产成本高^［3］。染色体整合是将角蛋白酶基因整合到宿主的染色体上，使其在宿主中稳定存在并表达^［7］。将地衣芽胞杆菌PWD⁃1的角蛋白酶基因kerA整合到了地衣芽胞杆菌T399D的染色体上。结果表明，宿主染色体上有3~5个kerA基因拷贝时最有利于角蛋白酶的产生，但当基因拷贝数增加到16时却不利于产量增长，可能是翻译、翻译后加工和分泌的速度限制了产量增长^［23］。

3.2.7 其他策略

除了上述常用策略外，还有一些新型的方法被用于提高角蛋白酶产量。将来自于地衣芽胞杆菌BBE11⁃1的角蛋白酶基因，转入敲除细胞自溶基因的枯草芽胞杆菌WB600中异源表达，自溶基因的敲除让角蛋白酶产量增加^［24］，说明减少细胞自溶以增加角蛋白酶产量的策略是可行的。原核mRNA的5'⁃UTR （5'⁃untranslated region）包含起始密码子、SD序列和翻译增强子序列，在mRNA稳定性和翻译起始中起重要作用。通过优化重组角蛋白酶KerZ1表达元件的5'⁃UTR，提高了其在枯草芽胞杆菌WB600中的表达量^［25］。

3.3 优化发酵条件

碳/氮源的种类及比例、培养基添加剂、温度、pH、通气量、接种量等培养基组成成分和培养条件，是影响微生物生长和角蛋白酶生产的重要因素。但每种微生物的生长代谢都是独特的，故没有特定的培养基用来高效生产角蛋白酶^［26］，可通过优化发酵条件来提高天然宿主或异源宿主的角蛋白酶产量。优化贝莱斯芽胞杆菌（B. velezensis）ZBE1的接种量、培养基碳氮源、pH和金属离子等因素，使其角蛋白酶产量较优化前提高了3.74倍^［27］。

4 改善角蛋白酶催化性能

天然角蛋白酶往往还存在催化活性低、抗逆性差、底物范围广等问题，限制了角蛋白酶的应用。通过随机突变和（半）理性设计等手段修饰角蛋白酶分子，有望改善其催化性能。

4.1 随机突变

随机突变是通过物理/化学诱变或定向进化的方法，使角蛋白酶基因发生大量随机突变，然后靶向筛选具有良好催化性能的突变角蛋白酶^［5］。

物理/化学诱变是利用电离辐射（如α、β、γ和x射线）、非电离辐射（如紫外线）和化学制剂破坏DNA或与DNA反应，从而诱发突变^［5，11］。利用N⁃methyl⁃N′⁃nitro⁃N⁃nitrosoguanidine诱变枯草芽胞杆菌，筛选得到活性是野生型2.5倍的突变株KD⁃N2^［28］。利用紫外照射羽毛降解菌榕奇异球菌（Deinococcus ficus），获得角蛋白降解活性增加约2倍的突变株CC⁃ZG207^［29］。但物理和化学诱变因素对人体有害，故需要开发新型的、无害的随机突变技术。

定向进化是指在实验室条件下模拟自然进化，通过易错PCR（error⁃prone PCR）和体外DNA重组（DNA shuffling和StEP）等技术提高角蛋白酶基因的突变率或将阳性突变重组在一起^［30］，原理如图3所示^［31］。通过易错PCR在角蛋白酶kerBp基因中引入随机突变，筛选获得角蛋白酶活性由1 150 U/mL提高到8 448 U/mL的突变体^［30］。

4.2 半理性和理性设计

随机突变会产生许多无意义或有害突变，筛选工作量大，耗时长^［32］。随着蛋白结晶结构数量的增多、蛋白质结构与功能关系研究的深入和计算机算法分析的迅速发展，计算机辅助的理性或半理性设计越来越多地被用于改造角蛋白酶^［30］。

4.2.1 影响角蛋白酶稳定性和活性的因素

通常来说，更多的离子键、氢键、二硫键、更大的疏水核心和Ca²⁺的结合，能增加蛋白质的刚性^［7］。角蛋白酶底物结合口袋处氨基酸的带电状态、疏水性和侧链大小，会影响角蛋白酶的活性和底物特异性^{［5， 33］}。据报道，不同角蛋白酶的前肽对酶的折叠会产生不同的影响^{［3， 9］}，C端延伸区中一些氨基酸或结构域也会影响酶的折叠^{［8， 10］}。成熟的角蛋白酶处于极端环境时，通常会从结构最松散的柔性环区域（loop区）开始解折叠而变性失活。

因此，通过（半）理性设计改造角蛋白酶，可以从前肽、C端延伸区或成熟酶的loop区入手。前肽和C端延伸区通过影响酶的整体构象来影响角蛋白酶的活性和稳定性。对于成熟酶的loop区，则是引入氢键、离子键和金属离子结合位点等来刚化蛋白结构^［11］。此外，还可从底物结合位点入手，突变部分口袋处的氨基酸残基而直接影响酶的活性^［5］。

4.2.2 突变位点的选择策略

通过（半）理性设计改造角蛋白酶，最重要的是找到最不稳定的氨基酸残基和底物结合口袋处影响活性的氨基酸残基作为突变位点。基于角蛋白酶一级序列、三级结构、计算机模拟分析和已知实验结果选择突变位点，是人们普遍接受的突变位点选择策略。

一级序列和三级结构相似性高的蛋白酶往往具有相似的功能^［34］，对稳定性和活性重要的氨基酸残基在同源蛋白中通常是保守的^［35］。B⁃factor用来量化由热运动引起的原子的动态迁移，均方根波动（root mean square fluctuation，RMSF）表示一段时间内某原子与初始构象间的结构变化，两者均反映原子的灵活性，值越高越灵活，即越不稳定^{［5， 36］}。

因此，利用RCSB PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）、同源建模^［37］或从头预测^［38］获取角蛋白酶三级结构后，通过与同源性高且催化性能好的其他角蛋白酶进行多序列比对和三级结构叠合，来寻找非保守的潜在突变位点^［34］。或利用表2中的FoldUnfold等预测柔性环^［39］，PredyFlexy^［39］和分子动力学模拟^［36］分别计算氨基酸残基的B⁃factor和RMSF，基于B⁃factor或/和RMSF确定柔性环中的最不稳定氨基酸残基。此外，也可利用PoPMuSiC^［37］等计算的折叠自由能变化（ΔΔG）来选择突变位点。ΔΔG表示野生型蛋白与突变体蛋白的折叠自由能差值，为正值时，说明突变有利于稳定；反之，则不利^{［39，40］}。最后，将已经报道的具有良好催化性能突变体的突变策略或已有实验结果，运用到新角蛋白酶的改造。

4.2.3 运用（半）理性设计改造角蛋白酶催化性能的实例

选择突变位点时，通常会综合考虑4.2.2中的4种策略来选择待突变位点。结合使用同源建模、IUPred2A和FoldUnfold预测柔性环、PredyFlexy计算B⁃factor和RMSF、MUpro和CUPSAT计算突变体ΔΔG、多序列比对等策略，对来自短芽胞杆菌（B. pumilus）的角蛋白酶KerBp进行突变位点选择。最终获得了稳定性提高突变体A165E、Q170T、N292F、L190Q、H92N和S171G，并将这6个位点进行组合，获得的组合突变体最适反应温度从40 °C提高到60 °C，半衰期从17.3 min提高到66.1 min^［39］。分析发现该组合突变体稳定性提高主要是由于引入了Ca²⁺结合位点和氢键。

通过同源建模得到来自地衣芽胞杆菌BBE11⁃1角蛋白酶的三级结构，并结合PoPMuSiC计算的ΔΔG来选择突变位点，获得了稳定性提高的突变体N122Y、N217S、A193P和N160C。4个位点组合的组合突变体在60 °C下的半衰期较野生型增加了8.6倍^［37］。

利用同源建模获得来自嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）的角蛋白酶KerSMD的三级结构，并通过多序列比对分析其底物结合口袋的氨基酸保守性，发现KerSMD同源酶的底物结合口袋主要由疏水氨基酸构成^［33］。挑选非保守氨基酸位点进行突变，获得活性提高的突变体Y215G和Y215A，分析发现这两个突变体的底物结合口袋的体积变大、疏水性增强。

总之，目前已有许多利用半理性/理性设计来改造角蛋白酶稳定性的报道，且通常会同时考虑多个策略来选择突变位点，主要集中在柔性环处引入离子键、氢键、脯氨酸和金属离子结合位点等。仅针对角蛋白酶活性进行改造的报道目前较少，大多都是在改造稳定性的时候间接地提高活性。

5 总结与展望

角蛋白酶在角蛋白废物利用、医药、美容、洗涤剂、去垢剂等多方面具有良好的应用前景，但角蛋白酶生产菌株发酵周期长、角蛋白酶产量低、活性弱和稳定性差等限制了其应用。图4综合展示了本文所介绍的、目前已被用来获取高产量和良好催化性能角蛋白酶的策略。一方面可以从自然界中发掘新的角蛋白酶，另一方面可以对已经获得的角蛋白酶进行改造。这些工作需要对角蛋白酶及其突变体进行大量的筛选，但目前还没有关于角蛋白酶的快速、准确的高通量筛选平台。且目前研究还主要是实验室规模，需要进一步进行扩大化培养和应用的研究。此外，由于角蛋白富含二硫键等作用力而结构坚硬，将角蛋白酶应用到饲料、肥料和沼气生产等角蛋白废物利用领域，还需要充分了解角蛋白酶与其他蛋白酶间的协同作用。因此，还需要克服上述问题，以实现高产量、高活性和强稳定性的角蛋白酶的大规模商业化生产和应用。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31770072)