胡杨根际土壤来源放线菌分离及其拮抗活性筛选

Isolation of actinomycetes from rhizosphere soil of Populus euphratica and screening of their antagonistic activity

摘要

根际土壤微生物在抵御病原微生物的入侵、提高植物的抗病能力等方面具有重要作用。胡杨作为沙漠地区的常见植物，其根际土壤微生物种类丰富且具有很高的研究价值。为了探究根际土壤微生物的作用，丰富和完善极端环境拮抗活性微生物菌种库，本研究基于选择培养基筛选法分析了新疆南疆地区10种不同地区的胡杨根际土壤的放线菌资源多样性，并采用细菌的16S rDNA测序和平板对峙法筛选。结果表明：经过分离与筛选，共获得269株菌株，选择生长状态较好的78株进行分析鉴定，分别为5个属，其中链霉菌属（Streptomyces）为优势类群。利用平板对峙法和琼脂扩散法以白色念珠菌（Candida albicans）、细极链格孢菌（Alternaria tenuissima）、大丽轮枝菌 （Verticillium dahliae）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌 （Klebsiella pneumoniae）、解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylohydrolylic）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）为靶标菌，对分离出来的菌株进行拮抗活性检测，筛选出32株活性放线菌。这些结果丰富了微生物资源并为新疆主要农牧业病害的防控提供了菌种基础。

Abstract

Rhizosphere soil microorganisms are crucial in resisting the invasion of pathogenic microorganisms and enhancing plant disease resistance. Populus euphratica， a commonly found plant in desert areas， possesses a diverse range of rhizosphere soil microorganisms and holds significant research value. This study aims to investigate the microbial interactions in the rhizosphere soil of Populus euphratica and enrich the extreme environmental antagonistic microbial strain library. The diversity of actinomycete resources in 10 different regions of Populus euphratica rhizosphere soil in southern Xinjiang was analyzed using the selective medium screening method. The strains were subjected to 16S rDNA sequencing and plate confrontation method for screening. The results revealed the isolation and screening of a total of 269 strains， with 78 strains exhibiting good growth status selected for analysis and identification. These strains were classified into 5 genera， with the genus Streptomyces being the dominant group. Furthermore， 32 strains of active actinomycetes were screened for antagonistic activity， and targeting pathogens included Candida albicans， Alternaria tenuissima， Verticillium dahliae， Fusarium oxysporum， Staphylococcus aureus， Pseudomonas aeruginosa， Escherichia coli， Klebsiella pneumoniae， Erwinia amylohydrolylic， and Salmonella typhi. These findings contribute to the enrichment of microbial resources and provide a microbial strain foundation for the prevention and control of major agricultural and animal husbandry diseases in Xinjiang.

Graphical abstract

关键词

胡杨根际土壤 / 放线菌 / 物种多样性 / 抗菌活性

Key words

Populus euphratica rhizosphere soil / actinomycete / species diversity / antimicrobial activity

0 引 言

放线菌是一类呈分枝状生长，主要以孢子繁殖的单细胞原核细胞型微生物^［1］，作为微生物中最经济、最具生物技术价值的一类^［2］，它们的丰富度反映了生态环境的多样性，对自然界的物质循环起着重要的作用，同时还是良好的生防菌资源^［3］。放线菌易降解的特性，使其在农药的开发中占据着重要的位置^［4］。因其是生物活性代谢产物的主要来源，故使其成为微生物研究工作者关注的焦点^［5］。

放线菌的代谢产物多样，特别突出的是抗生素，截至目前所报道的抗生素中，约70%是由放线菌产生的，如土霉素、链霉菌、多黏霉素等^［6］。但是近几年来抗生素药物被大量使用，使微生物对抗生素产生了极大的耐药性^［7］。故而为了找到更多的抗生素，需要从不同的途径去获得更多的放线菌资源。

胡杨（Populus euphratica），又称胡桐^［8］，是杨柳科（Salicaceae）胡杨亚属（Populus euphratica subgenus）中的一个古老物种，研究表明，距今已有300~600万年的历史，被称为“活化石”。它通常生长于沙漠等干旱地区，在中国主要分布于内蒙古中西部、新疆南部、青海、宁夏、甘肃等地。据估计，新疆胡杨约占全国胡杨总面积的90%以上，占世界胡杨总面积的55%左右。作为新疆沙漠地区仅存的天然乔木，具备耐旱、耐盐碱等特性^［9］，它不仅对维护当地生态平衡、改善荒漠气候具有重要作用，而且为沙漠地区撑开了一片生命绿洲。由于生长于干旱、缺水、高温、高辐射的环境中，其根际土壤中可能蕴藏着较为特殊的微生物群落。

植物病害是由病原微生物侵染植物后引起，如细极链格孢菌（Alternaria tenuissim）引起红枣黑斑病害，大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起棉花黄萎病害，尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起棉花枯萎病害。早期防治植物病害主要是利用化学农药，但是随着农药的滥用，不仅造成了环境的污染，而且生成耐药的病原菌不断增多^［10］。

本研究选择新疆南疆地区的10种胡杨根际土壤样品（该地区属于典型的温带大陆性干旱气候，年降水量小于50 mm，年蒸发量超过3 000 mm，是欧亚大陆最大的极端干旱地区），采用11种培养基，研究塔里木盆地放线菌资源代谢产物的多样性，并对其进行筛选，以评估其对多个植物病原真菌和细菌的抑制活性。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 土壤样品

采集了新疆南疆地区10个不同地点的胡杨根际土壤样品，并将其置于无菌样品盒中，储存在4℃下备用，如表1所示。

1.1.2 培养基

①用于分离放线菌的分离培养基包括：高氏一号培养基：可溶性淀粉20 g，FeSO₄ 0.01 g，KNO₃ 1 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，K₂HPO₄ 0.5 g，琼脂17 g，pH 7.0~7.5；甘油⁃精氨酸培养基：精氨酸2 g，甘油12 g，MgSO₄ 0.5 g，K₂HPO₄ 1 g，琼脂17 g，pH 7.5；ISP4培养基：可溶性淀粉10.0 g，MgSO₄·7H₂O 2.0 g，NH₄SO₄ 4.0 g，K₂HPO₄ 2.0 g，CaCO₃ 1.0 g，琼脂18.0 g，氯化钠适量，pH 7.0~7.4；TRM1：葡萄糖4 g，酵母提取物4 g，麦芽膏10 g，CaCO3 2 g，琼脂16 g，pH 7.2；TRM2：蔗糖30 g，NaNO₃ 3 g，K₂HPO₄ 1 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，酵母提取物2.0 g，蛋白胨5.0 g，琼脂15 g，pH 7.3；TRM3：葡萄糖10 g，可溶性淀粉20 g，酵母提取物5 g，酸水解酪蛋白5 g，CaCO₃ 1 g，琼脂15 g；TRM4：蛋白胨2 g，酵母提取物2 g，酸水解酪蛋白2 g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.5 g，KH₂PO₄ 1 g，柠檬酸钠1.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.6 g，吐温0.5 g，琼脂15 g；TRM5：蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，柠檬酸铁0.1 g，NaCl 19.45 g，MgCl₂ 5.9 g，NaSO₄ 3.24 g，CaCl₂ 1.8 g，KCl 0.55 g，NaHCO₃ 0.16 g，KBr 0.08 g，SrC_l2 34 mg，H₃BO₃ 22 mg，NaSiO₄ 4 mg，NaF 2.4 mg，NH₄NO₃ 1.6 mg，Na₂HPO₄ 8 mg，琼脂37.4 g；TRM6：葡萄糖10 g，可溶性淀粉20 g，酵母提取物5 g，酸水解酪蛋白5 g，CaCO₃ 1 g，琼脂15 g，pH 7.2；TRM7：葡萄糖10 g，酸水解酪蛋白5 g，酵母提取物5 g，牛肉膏5 g，CaCl₂·2H₂O 0.74 g，琼脂15 g，pH 7.2；TRM8：可溶性淀粉10 g，（NH₄）₂SO₄ 2 g，K₂HPO₄ 1 g，MgSO₄·7H₂O 1 g，NaCl 1 g，CaCO₃ 2 g，微量元素溶液1 mL，琼脂15 g，pH 7.2。

②MHA（MHB）培养基：用于细菌的培养和拮抗活性筛选^［9］。SDA（SDB）培养基：用于白色念珠菌的培养和拮抗活性筛选。PDA（PDB）培养基：用于棉花枯黄萎病菌的培养和拮抗活性筛选^［10］。OA（OB）培养基：用于链格孢的培养和拮抗活性筛选^［11］。

1.1.3 供试菌株

病原细菌：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae），解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora），伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）。

病原真菌：白色念珠菌（Candida albicans）、细极链格孢菌、大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌。所有菌株保存于新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室微生物资源研究室。

1.2 实验方法

1.2.1 放线菌的分离

称取1 g土壤样品置于9 mL经过无菌处理的生理盐水中，充分振荡混匀，得到10^-1的土壤悬浊液。随后，采用倍性稀释法逐步稀释土壤悬浊液，分别得到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的土壤悬浊液。使用iChip技术^［12］，选取不同区域的样品，分别利用高氏1号培养基、5号培养基、8号培养基和甘油精氨酸培养基进行放线菌的分离培养。在所使用的培养基中加入重铬酸钾、放线菌酮、蔡啶酮酸和制霉菌素以抑制细菌和霉菌的生长。将培养瓶置于28 ℃的恒温培养箱中倒置培养3~20 d，分离得到的放线菌经过纯化培养后，收集于20%甘油中，以-80 ℃冷冻保存。

1.2.2 胡杨根际土壤菌株的鉴定

采用CTAB法提取放线菌的基因组DNA，以提取的DNA作为模板进行PCR扩增。使用27F和1492R引物进行扩增，引物序列分别为27F（5'⁃ACACTTTCATCCTCCCTCAC⁃3'）和1492R（5'⁃CCTTACCTTCTTACCACTT⁃3'）。扩增产物进行测序后，将测序得到的16 S rDNA序列提交至EzBiocloud（http：//www.ezbiocloud.net）进行相似性比对搜索，以鉴定菌株的种类。选取与目标菌株相似的序列，使用NCBI的BLAST（basic local alignment search tool）工具进行比对并分析菌株的相似性（BLAST）。进一步使用MEGA 10软件，在GenBank中选择与菌株同源性较高的模式菌株的16S rDNA序列来构建基于Neighbor⁃Joining方法的系统发育树，进行菌株的系统发育分析。

1.2.3 抗菌筛选

将待测的菌株接种于高氏培养基，28 ℃培养一周，制成直径7 mm的菌饼备用。对于细菌病原菌，采用平板对峙法，将靶标菌单菌落接种至5~10 mL液体MHB培养基中，取100 μL涂布于MHA固体培养基，接种放线菌菌饼，置于培养箱中培养18 h。对于真菌，靶标菌为白色念珠菌时，将菌种接种至SDB培养基中，取100 μL涂布于SDA培养基上，接种放线菌菌饼，置于培养箱中培养72 h；靶标菌为棉花枯萎病菌或棉花黄萎病菌时，培养基为PDA，将培养基上菌株的孢子，用无菌棉签或竹签收集至无菌水中，取100 μL涂布于PDA培养基上，接种放线菌菌饼，72 h后观察结果；靶标菌为链格孢菌时只需将培养基换为OA。各设置平行实验3组，计算抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 胡杨根际土壤放线菌分离结果

本研究采用可培养方法以10个地点的胡杨根际土壤样品为材料，采用11种分离培养基进行放线菌的分离与纯化，挑取放线菌单菌落，最终分离获得269株放线菌菌株，部分菌株的形态特征见图1。培养基分离放线菌情况比较见表2所示。由表2可知，从高氏一号培养基中分离出的放线菌菌株数目最多，其次是甘油精氨酸琼脂培养基。结果表明，高氏一号培养基和甘油⁃精氨酸培养基是适合分离胡杨根际土壤放线菌的培养基。

2.2 胡杨根际土壤微生物多样性分析

将测序结果通过EZbiocloud进行比对分析。结果表明，生长状态较好的78株放线菌分属于放线菌纲的5个属，分别是链霉菌属（Streptomyces）、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）、单孢菌属（Brevundimonas）和不动杆菌属（Acinetobacter）。从中选取相似性较高菌株的16S rDNA序列作为比较对象，采用MEGA 10软件以邻位连接法（neighbor⁃joining）进行分析，并构建系统进化树，结果如图2所示。TRM75032和TRM75013、TRM75090和TRM75074、TRM75045和TRM75042、TRM75084和TRM75085、TRM75009和TRM75028的亲缘关系较近。

2.3 胡杨根际土壤放线菌抗菌活性筛选

采用平板对峙法，以10种病原菌为靶标菌，对269株菌株进行拮抗活性分析，结果如表3所示。对大肠杆菌有拮抗活性的菌株有11株，其中TRM75183和TRM75222抑菌圈最大，约12 mm；对铜绿假单胞菌有拮抗活性的菌株有4株，其中TRM75105拮抗活性最好，抑菌圈直径达15 mm；对肺炎克雷伯菌有拮抗活性的菌株有4株，其中TRM75088抑菌圈最大，直径为14 mm；对金黄色葡萄球菌有拮抗活性的有15株，其中TRM75183抑菌圈最大，直径为16 mm；对解淀粉欧文氏菌有拮抗活性的菌株有4株，其中TRM75105抑菌圈最大，直径为12 mm；对伤寒沙门氏菌有拮抗活性的菌株有2株，分别为TRM75013和TRM75105，直径均为10 mm；对白色念珠菌有拮抗活性的菌株有4株，其中TRM75222抑菌圈最大，直径为11 mm；对细极链格孢菌有拮抗活性的菌株有18株，其中TRM75178抑菌圈最大，直径为16 mm；对尖孢镰刀菌有拮抗活性的菌株有9株，其中TRM75242抑菌圈最大，直径为18 mm；对大丽轮枝菌有拮抗活性的菌株有4株，其中TRM75101抑菌圈最大，直径为14 mm。综上，菌株对细极链格孢菌的拮抗活性最好，共有18株对其有拮抗活性；菌株对伤寒沙门氏菌的拮抗活性最差，只有两株对其有拮抗活性，且抑菌效果都较差。菌株TRM75105有较好的拮抗活性，对8种病原菌均有拮抗活性。

3 结论与讨论

在过去十几年的时间里，由链格孢属引起的红枣黑斑病^{［13，14］}、以大丽轮枝菌作为主要病原菌引发的棉花黄萎病^［15］和棉花枯萎病^［16］严重影响了红枣和棉花的产量和品质，给国家及农户造成了巨大的经济损失。目前，南疆地区对于这类植物病虫害的主要防治措施是喷洒农药。这种防治措施不仅造成了严重的环境污染问题，而且农药残留严重，农药防治虽然能在短期内取得效果，但是不能根治病虫害的发生^［17~20］。随着可持续发展的理念深入人心以及人们对绿色农产品的追求，通过放线菌等微生物进行病虫害的防治成为理想的选择^［21］。本研究以不同地区采集的10份胡杨根际土壤为材料，分析其放线菌的多样性，探讨了荒漠植物根际土壤放线菌在抗菌方面的潜在应用价值。研究表明，链霉菌在土壤中广泛分布，是根际土壤的优势放线菌。在本研究中，链霉菌也是优势属，占鉴定总数的94%，在10份土壤样品中均有分布。最适宜分离的培养基为高氏一号培养基和甘油⁃精氨酸培养基，大部分菌株对铜绿假单胞菌、解淀粉欧文氏菌、白色念珠菌和大丽轮枝菌的拮抗活性较好。因此，研究胡杨根际土壤放线菌具有重要的意义。本研究中所选用的病原菌都为常见的病原菌，在今后的实验中可以验证其生物防治作用，以期得到有应用价值的放线菌。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32360009)

塔里木大学博创项目(TDBSCX202302)

大学生创新创业项目(202210757017)