猕猴桃细菌性溃疡病生防放线菌的筛选与鉴定

Screening and identification of actinomycetes for biocontrol of kiwifruit bacterial canker

摘要

对分离自新疆巴里坤盐湖和达坂城盐湖的179株放线菌进行拮抗丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种筛选，从中筛选到8株具有拮抗作用的放线菌，其中ZBW8⁃1、E14⁃3和ZB5⁃6抗菌活性最显著，其抑菌圈直径分别为27.5 mm、23.6 mm和26.2 mm。针对这3株放线菌进行菌落形态观察，16s rRNA扩增、测序及系统进化分析，并对其进行抗生素合成相关基因的PCR鉴定。结果表明，放线菌ZBW8⁃1、E14⁃3和ZB5⁃6分别与糖霉菌属（Glycomyces）的Glycomyces fuscus TRM 49117、原小单孢菌属（Promicromonospora）的维也纳原小单孢菌（Promicromonospora vindobonensis）V45^T以及拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）的Nocardiopsis terrae YIM 90022^T 16s rRNA序列同源性最高，分别为99.86%、99.10%和99.86%。在系统进化关系上，这3株菌也分别与上述菌株聚类在同一个分支上。ZBW8⁃1、E14⁃3和ZB5⁃6菌株中均携带有NRPS基因，其中ZBW8⁃1和ZB5⁃6菌株中还含有PKS⁃II基因，且ZBW8⁃1菌株中还含有PKS⁃I基因。对这3株抗菌活性放线菌进行进化地位分析及抗生素合成相关功能基因的鉴定，将为研究这些菌株中的活性次生代谢产物奠定理论基础。

Abstract

179 actinomycete strains isolated from Barkol and Dabancheng salt lakes in Xinjiang were screened for antagonistic effects against Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Eight actinomycete strains with antagonistic effects were identified， among which ZBW8⁃1， E14⁃3， and ZB5⁃6 showed the most significant antimicrobial activity， with the diameters of inhibition zones of 27.5 mm， 23.6 mm， and 26.2 mm， respectively. Colony morphology observation， 16s rRNA amplification and sequencing， and phylogenetic analysis based on 16s rRNA sequences were conducted on these three strains of actinomycetes. PCR identification of antibiotic synthesis⁃related genes was performed on these strains. The results show that the actinomycetes ZBW8⁃1， E14⁃3， and ZB5⁃6 have the highest 16s rRNA sequence homology with Glycomyces fuscus TRM 49117（99.86%）， Promicromonospora vindobonensis V45^T（99.1%）， and Nocardiopsis terrae YIM 90022^T（99.86%）， respectively. In terms of evolutionary relationships， these three strains are also clustered on the same branch as the aforementioned strains. ZBW8⁃1， E14⁃3， and ZB5⁃6 strains all carry the NRPS gene， among which ZBW8⁃1 and ZB5⁃6 strains also contain the PKS⁃Ⅱ gene， and ZBW8⁃1 strain also contains the PKS⁃I gene. Analyzing the evolutionary status of these active actinomycetes and identifying their functional genes related to antibiotic synthesis will lay a theoretical foundation for studying the bioactive secondary metabolites in these strains.

Graphical abstract

关键词

放线菌 / 丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种 / 抗菌活性 / 系统进化树 / 功能基因

Key words

actinomycete / Pseudomonas syringae pv. actinidiae / antimicrobial activity / phylogenetic tree / functional gene

0 引 言

丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syingae pv. actinidiae）是猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌，该病菌在一定条件下能够通过侵染猕猴桃树的枝条、叶及果实^［1］，危害植株生长，对果实的品质和产量造成严重影响。另外，猕猴桃溃疡病菌除了危害猕猴桃外，也能够浸染西红柿、蚕豆、大豆、魔芋及洋葱等多种农作物，对农业生产造成非常严重的影响。由于该病菌具有适应范围广、致病性强，发病快、根除难度大等特点^［2］，经常引起大面积植株感染甚至死亡，造成重大经济损失。因此，猕猴桃溃疡病的防治一直是国内外科研工作者研究的热点之一。

目前对于猕猴桃细菌性溃疡病的防治，主要通过生物防治和化学药剂防治，以及通过切断侵染途径、增加土壤肥力和选育抗病品种等农业防治方法^［3~6］。其中生物防治以安全性高、不污染环境等特点越来越受到国内外研究人员的广泛关注。当前，以植物内生细菌、放线菌及噬菌体等为来源的微生物防治已成为猕猴桃细菌性溃疡病生物防治的有效防治策略之一^［7~10］。从牛蒡茎部分离得到的内生放线菌TGNBSA5对猕猴桃细菌性溃疡病菌有较好的抑菌活性^［11］。从发病果园健康植株的根际土壤中筛选到放线菌ZWP15和CXG2⁃5对丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种拮抗效果显著^［12］。从猕猴桃植株中分离到3株内生芽胞杆菌，对猕猴桃细菌性溃疡病致病菌具有很强的抑菌活性^［13］。虽然微生物防治具有抗菌活性显著、特异性高、环境友好等优点，但是其在自然环境中的不稳定性以及长期单一使用，容易使病原菌产生耐药性，影响其防治效果。因此，从自然环境中不断分离鉴定抗菌活性高且稳定的微生物菌株，作为可替代的菌株资源在猕猴桃细菌性溃疡病的生物防治中应用，是解决上述问题的最有效手段之一。

本研究拟对分离自新疆巴里坤盐湖和达坂城盐湖的179株放线菌进行拮抗丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种筛选，通过对具有抗菌活性的放线菌进行菌株形态观察，基于16S rRNA序列的系统进化分析，以及抗生素合成相关基因的鉴定，为猕猴桃细菌性溃疡病的生物防治提供菌株资源，同时也为深入研究抗菌活性放线菌次生代谢产物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试放线菌菌株

179株放线菌菌株分离自新疆巴里坤盐湖（43°36′36″~43°44′35″E，92°58′11″~93°6′7″N，干旱寒冷）和达坂城盐湖（88°3′53″~88°12′15″E，43°21′00″~43°25′25″N，干旱多风），经纯化后保存于新疆医科大学实验室。

1.1.2 供试病原菌

丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种购买自宁波泰斯拓生物技术有限责任公司。

1.1.3 培养基

高氏1号固体培养基（GA）：K₂HPO₄•3H₂O 0.5 g、KNO₃ 1 g、MgSO₄•7H₂O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO₄•7H₂O 0.01 g、可溶性淀粉20 g、琼脂粉18 g，加入无菌水配置成1 L，pH 7.2~7.4；LB液体及固体培养基配置参考文献［14］。

1.1.4 试剂与仪器

高压灭菌锅（美国致微，GR60DA），PCR仪（美国伯乐，T100），电泳仪（北京六一，DYY⁃6D），凝胶成像仪（美国伯乐，Gel Doc EZ），立式恒温振荡培养箱（欧莱博，BJPX⁃SL20⁃L）等；DNA Marker、Taq酶、胶回收试剂盒以及引物合成均购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗菌活性放线菌的筛选

179株放线菌经活化后，分别接种在GA固体培养基上，在30 ℃下培养3~7 d，备用。将活化的供试病原菌用无菌ddH₂O稀释后，吸取100 μL稀释液接种在LB平板上，将培养好的放线菌制成6 mm的菌饼，并接种于涂布有上述病原菌的LB平板上，在恒温培养箱中25 ℃培养2~3 d。阴性对照为相同直径的无菌琼脂块，每组测试均做3次重复，拮抗效果以抑菌圈直径大小衡量。

1.2.2 抗菌活性放线菌的菌落形态观察

选取拮抗效果显著的放线菌，接种在GA固体平板上，30 ℃下恒温培养5 d后观察。采用插片法进行放线菌菌丝观察，具体方法参见文献［15］。

1.2.3 16S rRNA基因片段的扩增、测序及系统进化树构建

放线菌基因组DNA的提取方法、引物序列信息及PCR扩增程序参考文献［16］，PCR产物经电泳检测及胶回收后，送华大基因公司进行测序。16S rRNA测序信息在EzBioCloud数据库中分析后，提交至NCBI数据库中获取登录号。采用邻接法（MEGA7.0）进行系统进化树的构建。

1.2.4 抗生素合成相关基因的鉴定

PCR扩增抗菌活性放线菌中非核糖体多肽合成酶（NRPS）、I型和Ⅱ型聚酮合酶（PKS）、氨基糖苷磷酸转移酶（APH）和3⁃羟基⁃3⁃甲基戊二酰辅酶 A（HMG⁃CoA）还原酶等抗生素合成相关蛋白酶的编码基因序列，引物及预测扩增产物片段大小参见表1^［16］，扩增产物经电泳检测后，选取目标片段进行测序验证。

2 结果与分析

2.1 放线菌的抗菌活性筛选

通过对179株放线菌进行拮抗丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种活性筛选，共获得8株放线菌对该病原菌具有不同程度的抗菌活性，其中ZBW8⁃1、E14⁃3和ZB5⁃6抗菌活性最强（图1），其他菌株抗菌活性较弱（见表2）。选取抗菌活性最高的3株放线菌ZBW8⁃1、E14⁃3和ZB5⁃6进行后续的菌株菌落形态观察，系统进化分析和抗生素合成相关基因的鉴定。

2.2 三株抗菌活性放线菌的菌落形态观察

ZBW8⁃1菌株在GA培养基上形成底部为浅黄色，表面呈白色，边缘不规则的圆形菌落，菌落较大且疏松，表面无光泽、平滑，边缘有微绒毛型气生菌丝，菌丝交叉缠绕，呈网状；孢子丝较少，部分分化为杆状分生孢子，菌落易被接种环挑取（图2~1A、2~1B）；E14⁃3菌株菌落为浅黄色不透明，菌落较小，圆形，无光泽，边缘不规则，有微绒毛型菌丝，气生菌丝呈分枝状生长，孢子丝较多，呈螺旋状生长，菌落不易被挑取（图2~2A、2~2B）；ZB5⁃6菌株菌落底部为棕黄色，菌落呈圆形，中间凸起，边缘不规则，表面光滑，表面有白色气生菌丝，菌丝呈分枝状生长，菌落易被挑取（图2、3A、2、3B）。

2.3 三株抗菌活性放线菌16s rRNA序列分析及系统进化树分析

放线菌ZBW8⁃1、E14⁃3和ZB5⁃6的16s rRNA序列经测序及序列比对分析，其结果表明：ZBW8⁃1与糖霉菌属的Glycomyces fuscus TRM 49117菌株16s rRNA序列同源性最高，为99.86%；E14⁃3则与原小单孢菌属的维也纳原小单孢菌V45^T同源性最高，为99.10%；ZB5⁃6与拟诺卡氏菌属的Nocardiopsis terrae YIM 90022^T存在最高的序列同源性，为99.86%。将上述菌株16s rRNA序列提交NCBI并分别获得登录号为OR507840、OR507841和OR507844。基于16s rRNA序列，对放线菌ZBW8⁃1、E14⁃3和ZB5⁃6进行系统进化分析，结果表明：3株放线菌在进化关系上与其16s rRNA序列比对结果一致，均与序列同源性最高的菌株聚类在相同进化分支上（见图3）。

2.4 三株抗菌活性放线菌中抗生素合成相关基因鉴定

对放线菌ZBW8⁃1、E14⁃3和ZB5⁃6中抗生素合成相关基因进行PCR扩增，从ZBW8⁃1菌株中扩增得到NRPS、PKS⁃I和PKS⁃Ⅱ基因片段，从E14⁃3菌株中扩增得到NRPS基因片段，从ZB5⁃6菌株中扩增到NRPS和PKS⁃Ⅱ基因片段，上述PCR产物大小均与表1中对应基因的产物片段大小一致（见图4），且PCR产物经测序验证后均为目标片段。虽然在E14⁃3菌株中进行PKS⁃Ⅱ基因的PCR鉴定中扩增到一个约250 bp基因片段，但该片段长度与预测产物的片段大小不一致（见图4C）。另外在这3个菌株中未扩增到APH和HMG⁃CoA。因此上述结果表明：该3株放线菌中均携带有NRPS基因，其中ZBW8⁃1和ZB5⁃6菌株中还含有PKS⁃Ⅱ基因，另外，ZBW8⁃1菌株还含有PKS⁃Ⅰ基因（见表3）。

3 讨 论

ZBW8⁃1菌株在16s rRNA序列比对和菌落形态上均与糖霉菌属的Glycomyces fuscus TRM 49117菌株非常类似，Glycomyces fuscus TRM 49117菌株是从新疆高盐环境中分离得到的^［17］，这与本研究中所分离的放线菌来自类似的生态环境。糖霉菌属放线菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌以及肺癌和结肠癌细胞等都有较好的抑制作用^{［18， 19］}。E14⁃3菌株与维也纳原小单孢菌V45^T在进化上最为接近，维也纳原小单孢菌V45^T是一株从奥地利维也纳的维吉留斯礼拜堂（Virgilkapelle）的空气中分离得到的^［20］，这与E14⁃3菌株所生存的环境差异显著。目前关于原小单孢菌属的放线菌活性代谢产物的文献资料较少，更多是关于新亚种的发现。从放线菌Promicromonospora sp. RL 26中鉴定得到一个对人体恶性胸膜间皮瘤ACC⁃MESO⁃1和宫颈癌HeLa肿瘤细胞具有一定细胞毒活性的大环双内酯类化合物JBIR⁃101^［21］。ZB5⁃6与拟诺卡氏菌属的Nocardiopsis terrae YIM 90022^T存在最高的序列同源性，Nocardiopsis terrae YIM 90022^T是一株兼性嗜盐放线菌，分离自青海盐碱土壤样本。对该菌株的次生代谢产物进行抗肿瘤细胞活性研究，结果发现其对人体肺癌、胃癌、皮肤癌等多种肿瘤细胞均具有较强的体外抗肿瘤细胞活性^［22］。在2014年对该菌株的次生代谢产物进行分离纯化和抗菌活性分析，结果表明该菌株的抗菌代谢产物对燕麦镰刀菌、禾谷镰刀菌和秆镰刀菌和稻瘟病菌4种病原真菌以及金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽胞杆菌3种致病细菌具有一定的抑菌效果^［23］。目前，上述3个属的放线菌还没有文献报道对丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种是否有抗菌活性。

抗生素合成相关基因编码蛋白主要参与合成具有抗菌、抗癌、抗寄生虫、抗真菌和免疫抑制等生物活性的代谢产物。为了进一步评估ZBW8⁃1、E14⁃3和ZB5⁃6菌株生产活性代谢产物的潜力，因此通过PCR方法对上述菌株进行NRPS、PKS⁃I、PKS⁃Ⅱ、APH和HMG⁃CoA蛋白酶编码基因的鉴定。这些蛋白酶在相应抗生素类化合物形成过程中起关键催化作用。例如，NRPS主要参与催化合成多肽类抗生素^{［16， 24］}；PKS则在聚酮类化合物的生物合成过程中起关键催化作用^［25］。其中大环内脂类、聚醚类、安莎类、和多烯类抗生素的生物合成主要由PKS⁃I催化，PKS⁃Ⅱ则在生物合成四环类和蒽环类抗生素中起关键催化作用^{［16， 26］}；链霉素和新霉素等氨基糖苷类抗生素的合成则主要由APH参与催化^{［16， 27］}；HMG⁃CoA则在类异戊二烯化合物的形成过程中起关键催化作用^［28］。

本研究结果表明，ZBW8⁃1和ZB5⁃6菌株对丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种表现出很强的抑制效果，与其进化关系最接近的菌株也有较为广谱的抗菌、抗肿瘤细胞活性，另外这两株放线菌中均同时含有NRPS和PKS⁃Ⅱ基因，且ZBW8⁃1菌株还携带PKS⁃I基因。因此，在后续的研究中有必要对这两株菌扩大抗菌活性的筛选范围，并对其次生代谢产物进行深入研究，为这些菌株在农业及卫生领域的应用奠定基础。

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基金资助

渭南市科技计划项目(2021ZDYF-JCYJ-299)

陕西省教育厅2021年度一般专项科研计划项目(21JK0639)