煤矿废水中正十八烷降解菌C1801的分离鉴定及降解特性

Isolation， identification and degradation characteristics of n⁃octadecane degrading bacterium C1801 in coal mine wastewater

摘要

正十八烷是难以被降解的长链烷烃，会对环境、水生生物及人类健康造成危害，而利用生物降解法可以有效地去除正十八烷。从中国陕西神木某煤矿处理厂的煤矿废水水样中分离出正十八烷降解菌C1801，根据菌株形态特征观察、革兰氏染色以及16S rDNA基因序列的同源性分析，鉴定其为嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），并探究了其对正十八烷的适宜降解条件以及对其他长链烷烃的降解能力。结果表明，在以正十八烷为唯一碳源环境中培养8 d后，C1801对800 mg/L的正十八烷的降解率达到了92.45%。C1801菌株降解正十八烷的最适温度为35 ℃，最适pH值为9.0，底物浓度最高耐受范围为1 000 mg/L，最适宜的接种量为10%。此外，结果显示C1801菌株对正二十五烷、正二十一烷及正二十烷这些长链烷烃亦具有降解能力。

Abstract

N⁃octadecane is a long⁃chain alkane that is difficult to be degraded and can pose a risk to the environment， aquatic organisms and human health. It can be effectively removed by biodegradation. Strain C1801 was isolated from the coal mine wastewater sample of a coal mine treatment plant in Shenmu， Shaanxi， China， and identified as Stenotrophomonas maltophilia based on morphological characteristics， Gram staining and homology analysis of 16S rDNA gene sequences. The degradation of n⁃octadecane by strain C1801 and its degradation characteristics， and degradation of other long⁃chain alkanes by strain C1801 were investigated by using an indoor culture method. The results showed that the degradation rate of n⁃octadecane（800mg/L）reached 92.45% after 8 d in an environment with n⁃octadecane as the sole carbon source. The optimum temperature for n⁃octadecane degradation was 35 ℃， the optimum pH was 9.0， the maximum tolerance range of substrate concentration was 1 000 mg/L， and optimum inoculum size was 10%. In addition， the results showed that strain C1801 was also able to degrade n⁃25， n⁃21 and n⁃20 alkanes.

Graphical abstract

关键词

嗜麦芽寡养单胞菌 / 正十八烷 / 分离鉴定 / 生物降解

Key words

Stenotrophomonas maltophilia / n⁃octadecane / isolation and identification / biodegradation

0 引 言

煤矿是中国重要的能源之一，随着煤矿产业的蓬勃发展，煤矿开采过程中形成的煤矿废水也在不断地增加^［1，2］。未经妥善处理的煤矿废水随着时间的增长，其中的有机污染物的含量也逐渐提升。有机污染物不仅对环境、土壤和水资源造成严重的污染，其毒性还会对水生生物如鱼类和藻类造成危害，并对人类的身体健康造成影响^［3，4］。有机污染物中的长链烷烃在常温下一般处于固态，具有较高的毒性及较强的疏水性和稳定性，难以在自然的环境条件下被降解^［5，6］，为了有效去除废水中不同种类的长链烷烃，利用绿色环保且成本低廉的生物降解法，通过微生物对长链烷烃的降解，使得废水中的长链烷烃得以被消除。目前已报道过多种正十八烷降解菌，从原油中分离筛选出了一株高效烷烃降解菌XCZ，鉴定为假单胞菌（Pseudomonas sp.）^［7］。从原油污染土壤中分离筛选到一株石油烃降解菌15⁃3，鉴定为红球菌（Rhodococcus sp.）^［8］。有研究者将从受污染的油质土壤中分离出的芽胞杆菌（Bacillus sp.）对正十八烷的降解作用进行了研究^［9］。本文以正十八烷为唯一碳源，通过对废水微生物菌群的富集筛选，从中分离得到对正十八烷具有降解能力的菌株。通过形态特征观察、革兰氏染色鉴定以及16S rDNA基因测序对菌株进行鉴定，并探究菌株的降解特性及降解底物的范围，为环境修复提供了菌源、理论基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

中国陕西神木某煤矿处理厂的煤矿废水，将水样装入已灭菌的采样瓶中，于4 ℃冰箱中保存。

1.1.2 主要培养基

① 无机盐培养基（MSM）：每升MSM液体培养基中含有 KH₂PO₄ 338.8 mg，（NH₄）₂SO₄ 234.0 mg，Na₂CO₃ 100.0 mg，CaCl₂ 3.9 mg，MgSO₄·7H₂O 59.3 mg，Na₂HPO₄·12H₂O 890.7 mg，FeSO₄ 0.3 mg，FeCl₂·4H₂O 1.5 mg，CoCl₂ ·6H₂O 0.19 mg， MnSO₄·7H₂O 0.1 mg，ZnCl₂ 0.07 mg，NiCl₂·6H₂O 0.024 mg，NaMoO₄·2H₂O 0.024 mg，MnCl₂·4H₂O 0.006 mg，CuCl₂·2H₂O 0.002 mg。

② 富集培养基：0.5 g葡萄糖、1 L无机盐培养基。

③ LB培养基：10.0 g NaCl、5.0 g酵母提取物、10.0 g胰蛋白胨、1 L去离子水。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集、筛选与划线分离

取10 mL水样于100 mL富集培养基中，于35 ℃，200 rpm震荡培养7 d。取10 mL富集菌液转入含200 mg/L正十八烷的MSM液体培养基中，于35 ℃，200 rpm震荡培养5 d，分别将菌液涂布于终浓度为200、400、600、800、1 000 mg/L正十八烷的MSM固体平板放入35 ℃恒温培养箱培养5 d。筛选可降解正十八烷最高浓度的降解菌，于500 mg/L正十八烷的LB固体平板上进行划线分离纯化并在甘油保种。

1.2.2 菌株的鉴定

① 革兰氏染色鉴定：对菌株进行革兰氏染色，操作包括初染、媒染、脱色以及复染，最后用油镜观察菌体的颜色。

② 16S rDNA基因测序与同源性分析：将菌株送到擎科生物公司进行基因测序。将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对分析。使用MEGA11软件将菌株与模式菌株进行系统进化分析，利用邻位相连法构建系统发育树^［10］。

1.2.3 烷烃的降解及降解率的测定

① 培养降解正十八烷菌株：将培养后的菌液以 8 000 rpm离心2 min，弃去上清液，用无菌水重悬沉淀于底部的菌体，重复上述步骤一次。使用紫外分光光度计将菌悬液的OD₆₀₀值调至1.0，之后接种于50 mL以正十八烷为唯一碳源的MSM液体培养基中，于设置的不同条件下震荡培养^［11］。

② 回收正十八烷：利用液­液萃取法将残余的正十八烷从液体培养基中分离开来^［12］。用等体积的正己烷进行萃取，通过高速离心分离有机相和水相。取适量的无水硫酸钠作为干燥剂加入到有机相中彻底去除水分。接着将有机相用0.22 μm的有机相微孔滤膜进行过滤除去杂质，制得待测样品，随后用GC⁃MS对样品中剩余的正十八烷进行测定。

③ GC⁃MS检测条件：使用的色谱柱为TraceGOLD TG⁃5MS 30 m×0.25 μm；载气为30 m×0.25 μm氦气，1 mL/min；进样口和检测器温度为280 ℃；升温程序为70 ℃恒温1 min，30 ℃/min升温到180 ℃，10 ℃/min升温到230 ℃，30 ℃/min升温到280 ℃，保持3 min；进样量为1 μL。

④ 正十八烷标准曲线的制备：以正己烷作为溶剂，分别配制浓度为200、400、600、800、1 000、1 200 mg/L的正十八烷标品溶液。使用GC⁃MS测定正十八烷的峰面积，以峰面积与浓度的关系获得正十八烷的标准曲线。

⑤ 正十八烷降解率的计算：对照组所测得的浓度为C₁，实验组所测得的浓度为C₂，降解率的计算公式为：降解率=（C₁ -C₂ ）/C₁ ×100%。

1.2.4 以正十八烷为唯一碳源的菌株生长及降解探究

将菌悬液以10%的接种量接种于50 mL含有800 mg/L正十八烷MSM液体培养基中，以8 d为培养周期，于35 ℃，200 rpm震荡培养，并设置对照组。每隔2 d取样，测定培养液的OD₆₀₀值和剩余的正十八烷浓度，探究降解菌的生长与正十八烷降解之间的关系。

1.2.5 菌株降解特性的探究

以7 d为培养周期，分别于不同的培养温度（20、25、30、35、40 ℃）、培养基初始pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、正十八烷浓度（200、400、600、800、1 000 mg/L）以及菌液接种量（2、4、6、8、10%）的条件下进行培养，于各个条件设置对照组，测定菌株对正十八烷降解效率的影响，探究菌株降解正十八烷的最适温度，最适pH值，底物浓度耐受范围以及最佳菌液接种量。

1.2.6 菌株降解其他底物的能力探究

将菌悬液以10%的接种量分别接种于50 mL浓度为500 mg/L以正二十五烷、正二十一烷、正二十烷、正十七烷及正十六烷为单一碳源的MSM液体培养基中，于摇床35 ℃，200 rpm震荡培养7 d，观察培养基否浑浊以判断菌株的生长情况，确定菌株对其他底物是否具备降解能力。

2 结果与分析

2.1 C1801菌株的分离与鉴定

以正十八烷为唯一碳源通过对煤矿废水水样中的富集菌群进行筛选与单菌落的分离纯化，从中获得一株对正十八烷具有降解能力的菌株，命名为C1801。C1801菌株在LB平板上形成浅黄色、不透明、圆形、边缘整齐、表面隆起、湿润光滑的菌落，菌落形态如图1A所示。C1801菌株经革兰氏染色后，菌体为红色，呈革兰氏染色阴性，表明C1801菌株为革兰氏阴性菌，呈短杆状，挺直或略弯，单个或成对排列，革兰氏染色结果如图1B所示。

通过对C1801菌株进行16S rDNA基因测序，将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，结果显示，C1801菌株的16S rDNA序列与寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.）的多个菌株具有很高的序列相似性，其中C1801菌株与嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）PBCC9菌株的16S rDNA序列相似度高达99.86%，与此属的其他菌株的16S rDNA序列相似度高达99.72%，可以基本确定C1801菌株属于寡养单胞菌属。选取与C1801菌株序列相似性高的菌株，并以与亲缘关系远的葡萄嗜木杆菌（Xylophilus ampelinus）作为外源菌，利用MEGA11软件构建系统发育树。如图2所示，C1801菌株与嗜麦芽寡养单胞菌为同一个分支，呈现了明显的亲缘关系。结合C1801菌株的形态特征观察与16S rDNA序列相似性的比对结果以及系统发育树的分析，鉴定C1801菌株为嗜麦芽寡养单胞菌。

2.2 以正十八烷为唯一碳源的菌株生长及降解曲线

以正十八烷剩余率和菌液OD₆₀₀值与时间的关系获得降解菌以正十八烷为唯一碳源的生长及降解曲线，如图3所示。C1801菌株在800 mg/L正十八烷的MSM液体培养基中具有较长的延迟期，达到 4 d，随后迅速生长，降解正十八烷的速率也随之加快，生长量和正十八烷的降解是正相关的。在探索得到的最适条件下，培养至8 d时，800 mg/L的正十八烷降解率已达92.45%，菌液OD₆₀₀ 值为1.876。

2.3 C1801菌株对正十八烷降解特性的探究

培养条件是影响菌株对正十八烷的降解效率高低的重大因素。培养温度会影响降解菌的各种理化性质，当培养温度较低时，降解菌体内的酶活性会降低，烷烃的毒性会对菌体造成伤害，导致降解率的下降；随着温度的升高，降解菌降解正十八烷的效率也随着增加，但是当培养温度过高时，可能会导致降解菌体内的酶发生变性而失活，降低了降解效率^［13］。C1801菌株对降解正十八烷的最适温度为35 ℃，其降解效率达到84.97%，C1801菌株在20~40 ℃的范围内均能对正十八烷进行降解，其中在30~35 ℃时的降解效果较好，如图4（a）所示，展示出了其广泛的温度适应性。

不同的pH值会导致降解菌体内的蛋白质、核酸等生物大分子所带的电荷产生变化，会对酶的活性造成影响。pH值也会影响细胞膜的稳定性，引起细胞膜的电荷变化，使细胞膜的通透性发生改变，从而降低了降解菌从环境中吸收营养物质的能力，而且pH值还可以改变环境中有害物质的毒性^［14］。因此，pH值对降解菌的生长及其降解能力有重要影响。C1801菌株降解正十八烷的最适pH值为9.0，在碱性环境中降解率最高，其在酸性及中性环境中也具有一定的降解能力，如图4（b）所示，展现了C1801菌株具有适应广泛pH值的能力。

正十八烷作为降解菌生长的碳源，其初始浓度对降解菌降解的效率有重要的影响，从降解菌在不同初始浓度下对正十八烷进行降解，可以探究出降解菌的底物适应能力。低浓度的正十八烷可以被降解菌有效降解，随着正十八烷浓度的升高，降解率不断下降，这是由于高浓度的正十八烷的毒性较大，会对菌体造成一定的毒害作用，影响菌株的正常生长和代谢活性，从而导致降解效率低。C1801菌株对浓度为200 mg/L的正十八烷降解率达到75.32%，而当正十八烷浓度高达1 000 mg/L时，菌株仍具有一定的降解能力，如图4（c）所示，说明了菌株具有良好的底物耐受性，可以用于高浓度的正十八烷的降解体系

菌液初始接种量与效率有时间­效应关系，这是因为初始接种量跟微生物进入到新的胁迫环境后其延迟期的长短密切相关^［15］，从而影响降解菌在一定时间内对正十八烷的降解效率。培养7 d后，菌液接种量为10%的降解体系对正十八烷的降解达到47.04%，相比8%的菌液接种量，提高了12.61%的降解率，结果显示正十八烷降解率随着菌液接种量的增加而提升，如图4（d）所示。

2.4 C1801菌株降解其他底物的能力研究

对C1801菌株对其他长链烷烃的降解能力进行了定性探究，观察培养7 d后长链烷烃培养液的浑浊度以判断菌体的生长情况，由此探究菌株能够降解的底物范围，结果如表1所示。菌株能够以正二十五烷、正二十一烷及正二十烷为唯一碳源生长，表示菌株具有降解这些长链烷烃的能力，展现了其广泛的底物适应性。

3 结 论

本研究从煤矿废水中分离了一株能利用长链烷烃正十八烷作为唯一碳源的降解菌C1801，经形态特征观察、革兰氏染色鉴定与16S rDNA基因测序以及系统发育树的进化分析鉴定其为嗜麦芽寡养单胞菌。C1801菌株在以正十八烷为唯一碳源的生长环境下，在8 d时对800 mg/L的正十八烷的降解率达到了92.45%。C1801菌株降解正十八烷的最适温度为35 ℃，最适pH值为9.0，耐受底物浓度高达1 00 mg/L，最适宜的接种量为10%。此外，C1801菌株对正二十五烷、正二十一烷及正二十烷这些长链烷烃亦具有降解能力。C1801菌株对正十八烷的生物降解以及对环境修复的应用提供了理论依据和技术支持。

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基金资助

武汉大学本科教育质量建设综合改革项目(2023ZG115)

武汉大学实验技术项目(WHU-2021-SYJS-08)

武汉大学创新创业中心建设项目