0 引 言
根际微生物是消落区根际生态系统的重要组成部分,参与调控多种重要的生物地球化学过程,并对植物与土壤环境的相互作用有显著影响
[1,2]。根际微生物不仅能通过解磷、固氮、产生植物激素等对植物产生促生作用,调节植物的免疫能力,还能提高植物对于逆境胁迫的耐受性
[3,4]。同时,植物根际可通过对有机碳的分泌以及有益根际微生物的富集,促进凋落物和土壤有机质的分解,调节土壤生态系统的物质循环
[5]。
根际微生物的群落结构与多样性受众多生物与非生物因素的综合影响,主要包括植物地理位置、气候条件、根际分泌物以及水体和土壤理化性质等
[6‑9]。有研究表明,水文条件对消落区植物根际微生物的群落结构也有重要塑造作用
[10]。引江济巢工程作为安徽省水资源配置的战略跨区域调水工程,参与调节诸多区域经济社会可持续发展过程,但其对沿线气候、水文、植被和土壤理化性质等的改变也必然会对根际微生物产生持续影响。目前中国对于引江济巢工程沿线的调查主要集中于水质与水动力、有机污染物和水生生物方面
[11‑14],但对不同区域植物根际微生物的调查鲜有报道。
引江济巢工程包含菜子湖和西兆河2条输水线路,其中菜子湖线为新辟线路,水体通过枞阳闸进入长河,经菜子湖后依次进入孔城河、罗埠河和白石天河,最后进入巢湖。引江济巢工程通过增加江湖水量交换、缩短巢湖水体置换时间,可抑制巢湖蓝藻暴发并改善湖泊水质
[15]。为了解引江济巢工程(菜子湖线)运行前沿线消落区植物根际微生物的群落特征及其主要影响因素,本研究于2023年4月对沿线4个不同区域进行了系统调查。相关研究结果不仅可为后续评估引江济巢工程运行对根际微生物群落的影响提供本底数据,还可为闸坝生态调控提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 采样区域及样点概况
引江济巢菜子湖线路全长113.18 km,所流经区域的生态功能类型、经济发展状况以及土地利用方式等不同,其水环境和沿岸带植被状况差异较大。长河为菜子湖入江河段,全长24 km,沿线消落区属于自然堤岸,植被多样性和盖度均较高,植被群落以薹草(Carex spp.)、虉草(Phalaris arundinacea)和天蓝苜蓿(Medicago lupulina)等为主。菜子湖由白兔湖、嬉子湖和菜子湖3个湖区共同组成,湖滨带消落区生境自然、植被丰富,其植被群落以薹草、紫云英(Astragalus sinicus)和狗牙根(Cynodon dactylon)等为主。白石天河为巢湖主要支流之一,沿线均为硬化堤岸,植被多样性和盖度均极低,输水线路未开通前水质较差。巢湖是中国第五大淡水湖,水体严重富营养化,消落区均为硬化堤岸,植被多样性和盖度均较低,其植被群落组成以芦苇(Phragmites australis)和狗牙根等为主。
2023年4月,在引江济巢菜子湖线共设置15个不同采样点。根据沿线水系情况,可划分为巢湖、白石天河、菜子湖和长河-长江等4个区域,本研究中4个区域采样点个数分别为4、3、4和4个(见
图1)。
1.2 野外测量与样品采集
每个样点根据消落区植被特征沿垂直河岸或湖岸方向设置3~6个样方(1 m×1 m)。每个样方内使用土壤水分检测仪(Delta⁃T/WET⁃2⁃KIT)测量基质含水率,使用激光测距仪(Trueyard/SP⁃2000H)测量样方间的距离及高度差,使用便携式水质分析仪(YSI ProPlus)测量样点水体pH、温度、溶氧量及电导率;使用取土钻(1.0 m×50 mm)钻取样方内基质样本(钻取深度≥15 cm),重复取样3次,混合后作为一个样品用于测定土壤理化性质。现场鉴定每个样方内植被的种类并记录每种植被的密度、盖度及生物量。根据植物数据,从每个样方选取两种优势度最高的植物,采集其根际1~2 mm范围内的根际土壤样本用于根际微生物群落的测定。
1.3 理化参数测定
依据《土壤农业化学分析方法》
[16],使用电位法测定土壤pH值;使用高温外热重铬酸钾氧化⁃容量法测定土壤有机质含量;使用开氏消煮法测量土壤全氮;使用碱熔⁃钼锑抗分光光度法测量土壤全磷。根据采样区土壤质地特征,使用赋值法对基质类型进行分类,主要分为黏土(1.0)、淤泥(2.0)、壤土(3.0)、沙土(4.0)和石砾(5.0);根据采样区域人类活动频率、外来入侵种数量以及硬化堤岸覆盖程度,使用赋值法对研究区干扰强度进行分类,主要分为轻度干扰(1)、中度干扰(2)和重度干扰(3)
[17]。
1.4 基因组DNA提取、PCR扩增和16S rRNA基因测序
首先使用试剂盒[QIAGEN, DNeasy Blood and Tissue Kit(100)]从所采集的优势植物根际土壤样本中提取DNA样品,然后采用Nanodrop 2000分光光度计测定DNA的质量并将DNA稀释至10 ng/µL应用PCR扩增。采用通用引物515F(5'⁃GTGYCAGCMGCCGCGGTA⁃3')和907R(5'⁃CCGTCAATTCMTTTRAGT⁃3')引物扩增微生16S rRNA基因的V4~V5高变区,其中引物515F的5'端连接12 nt长度的barcode序列用于后续的样品分选。
每25 µL PCR反应液中含有1×PCR buffer、1.5 mM MgCl2、0.2 mM dNTP、1.0 µM引物、0.25 U Ex Taq (TaKaRa,中国)和10 ng DNA模板。PCR 扩增条件为94 ℃预变性3 min,然后进行30个循环的常规扩增,最后72 ℃延伸10 min。同一个样品同时扩增2次,将同一个样品扩增得到的2份PCR产物混合,使用1.2%的琼脂糖凝胶电泳切胶后采用sanPrep DNA凝胶回收试剂盒(生工,中国)纯化,将所有纯化的DNA等量混合后,采用Illumina Miseq进行PE250测序。
1.5 生物信息学和统计分析
1.5.1 根际微生物组成分析
对于测序所得到的下机序列,通过去除低质量、接头污染等过程完成数据过滤,得到可信的目标序列,用于后续分析。将双端测序的相应的Read 1与Read 2利用序列拼接软件FLAsH软件(Win, 34.0.0.192)进行拼接,作为测序数据量统计的序列;然后利用软件QIIME 1.9.0进行筛选,去除与引物不匹配的序列、长度小于300 bp的序列、含有模糊碱基N的序列及平均碱基质量小于30的序列
[18, 19]。然后采用Usearch软件包(
http://drive5.com/usearch/)中的Uchime程序进行嵌合体检测
[20],去除检测到的嵌合体序列。分析前对每个样品的OTUs(operational taxonomic units)表进行均一化处理,然后使用QIIME 1.9.0 软件按照序列97%的相似性进行OTUs划分
[21]。物种注释则采用Ribosomal Database Project classifier方法,原核生物参考数据库greengenes gg_13_8。对于测序所得到的结果,在门水平上,将至少在一个样品的相对丰度超过1%的门列为优势门;基于相同区域根际微生物优势属的平均值,使用Python 2.7软件绘制热图。使用单因素方差分析检验不同区域根际微生物主要优势门或优势属是否存在显著差异。
1.5.2 根际微生物多样性分析
使用R程序
[22]中的“Vegan”包计算所有样品的
多样性指数(包括Chao1指数、辛普森指数、香农指数和Goods coverage指数),样点及区域间
多样性指数为范围内所有优势门样品的均值。使用单因素方差分析检验不同区域根际微生物
多样性指数是否存在显著差异。
1.5.3 根际微生物与环境因子相互关系分析
使用斯皮尔曼相关来检验所有环境因子之间的相关性,排除高度相关(|
r|>0.7)的两个环境因子中重要性较低的一个,剩余环境因子用于和微生物相互关系的分析
[23]。采用Canoco 5.0软件对根际微生物组成(纲水平)和环境因子进行梯度分析,首先对根际微生物组成进行除趋势对应分析,根据分析结果中各排序轴长度判断采用线性或非线性模型
[24];本研究选择冗余分析,实际参与分析的有13个环境因子。将丰度超过总OTUs 0.5%的OTUs定义为优势OTUs
[25]。采用斯皮尔曼相关来检验环境因子与优势OTUs之间的相关性。
2 结果与分析
2.1 环境因子特征
15个样点土壤有机质质量分数、pH、全氮、全磷、含水率和基质类型的变化范围依次为26.7~233.3 g/kg、4.6~7.9、705.9~1 146.4 mg/kg、78.6~407.8 mg/kg、14.4%~59.4%和1.0~4.0;水体pH、温度、溶解氧和电导率的变化范围分别为8.0~9.3、13.8~26.1 ℃、4.6~7.5 mg/L和171.0~398.3 μS/cm;水距和高程的变化范围为6.5~57.6 m和133.0~2 436.7 cm;干扰强度、植物种类数、植物密度、植物盖度和植物生物量的变化范围分别为1.1~2.8、4.5~13.0、75.8~2 582.8 ind./m
2、12.1%~100.0%和65.5~2 142.3 g/m
2 (详细信息见
表1)。
4个区域相比,白石天河和长河⁃长江区域由于基质粒径较大,土壤含水率相对低于巢湖和菜子湖区域;菜子湖区域基质pH明显低于其他3个区域;长河⁃长江区域土壤全磷明显高于其他3个区域,但这4个区域土壤全氮无明显差异。水体理化性质方面,巢湖区域由于水体严重富营养化,电导率明显高于其他3个区域。此外,菜子湖和长河⁃长江区域由于人为干扰较小,植物密度、盖度和生物量均明显高于其他2个区域。
2.2 引江济巢沿线根际微生物群落组成
在引江济巢沿线的根际微生物样品中共获得6 580 392条有效序列,每个研究样本的测序深度为30 041~390 927条。得到的序列可分为717 603个OTUs,每个研究样品有3 084.7~7 301.8个OTUs。整个调查区域根际微生物群落组成在门水平上存在差异,共检出75门(其中有3个古细菌门和72个细菌门),其中变形菌门(Proteobacteria)最丰富,其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)和酸杆菌门(Acidobacteria),其他优势门包括绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、泉古菌门(Crenarchaeota)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、WS3、装甲菌门(Armatimonadetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、软壁菌门(Tenericutes)、绿菌门(Chlorobi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、TM7、迷踪菌门(Elusimicrobia)、NC10、梭杆菌门(Fusobacteria)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、OP11、广古菌门(Euryarchaeota)、OP3和螺旋体门(Spirochaetes)等22门。
4个不同区域根际微生物群落组成亦有明显差异。巢湖区域根际微生物群落以变形菌门、拟杆菌门和酸杆菌门等为主,其中变形菌门的相对丰度在4个区域中最高;白石天河区域根际微生物以变形菌门、拟杆菌门和放线菌门等为主,其中拟杆菌门的相对丰度在4个区域最高;菜子湖区域根际微生物以变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门等为主,其中酸杆菌门在4个区域相对丰度最高;长河⁃长江区域根际微生物以变形菌门、拟杆菌门和放线菌门为主,但其相对丰度均较低(
图2)。单因素方差分析结果表明,4个区域变形菌门无显著差异,但酸杆菌门(
F=12.096,
P<0.001)、拟杆菌门(
F=3.758,
P=0.013)和放线菌门(
F=4.893,
P=0.003)均存在显著差异。
热图从属水平上显示了研究区域根际微生物优势类群的分布(
图3)。巢湖区域的主要优势属为一种称为Chitinophagaceae科中的菌属、一种称为
Flavobacterium的菌属、一种称为ⅰ1~15目中的菌属和一种称为envOPS12目中的菌属;白石天河区域的主要优势属为称为
Variovorax、
Arthrobacter和
Flavisolibacter的菌属以及一种称为Chitinophagaceae科中的菌属等;菜子湖区域的主要优势属为一种称为Koribacteraceae科中的菌属、一种称为
CandidatusKoribacter的菌属、一种称为Ellin329目中的菌属和一种称为Ellin6513目中的菌属等;长河⁃长江区域的主要优势属为一种称为Chitinophagaceae科中的菌属、一种称为
Flavobacterium的菌属、一种称为envOPS12目中的菌属和一种称为ⅰ1~15目中的菌属等。单因素方差分析结果表明,4个区域中,称为
Flavobacterium的菌属不存在显著差异,但称为Chitinophagaceae科(
F=3.561,
P=0.017)和Koribacteraceae科(
=23.500,
<0.001)中的菌属、称为ⅰ1~15目(
F=8.306,
P<0.001)、envOPS12目(
F=5.876,
P=0.001)、Ellin329目(
=14.862,
<0.001)和Ellin6513目(
=21.985,
<0.001)中的菌属以及称为
Variovorax(
=20.754,
<0.001)、
Arthrobacter(
=9.302,
<0.001)、
Candidatus Koribacter(
=13.765,
<0.001)和
Flavisolibacter(
=11.212,
<0.001)的菌属等均存在显著差异。
2.3 引江济巢沿线根际微生物群落多样性
由
表2可知,15个样点根际微生物的Chao1指数、辛普森指数、香农指数和Goods coverage指数的变化范围分别为10 457.57~25 390.75、0.99~1.00、9.49~11.08和0.74~0.88。3个指数的均值分别为16 029.15、0.99、10.30和0.83。4个区域根际微生物Chao1指数(
F=8.247,
P<0.001)、香农指数(
F=4.367,
P=0.006)和Goods coverage指数(
F=8.461,
P<0.001)均存在显著差异,而辛普森指数无显著差异。其中巢湖和白石天河区域Chao1指数显著低于菜子湖和长河⁃长江区域,但Goods coverage指数却显著高于菜子湖和长河⁃长江区域;白石天河区域香农指数显著低于菜子湖和长河⁃长江区域(
图4)。
2.4 引江济巢沿线根际微生物群落对环境变化的响应
RDA分析结果表明,前两轴根际微生物与环境因子的相关性分别为0.991和0.996,分别解释了41.93%和20.09%的物种⁃环境变量。蒙特卡罗(Monte⁃Carlo)检验分析表明,排序轴的特征值具有显著性差异(
P<0.05)。13个环境因子当中,基质pH和有机质质量分数为影响根际微生物群落结构的主要环境因子,二者解释率分别为34.8%和11.3%(
表3),其中基质pH主要贡献于第一排序轴,有机质质量分数主要贡献于第二排序轴。4个象限中,长河⁃长江区域样点主要分布在基质pH和有机质质量分数均较高的区域,菜子湖区域样点主要分布在基质pH较低而有机质质量分数较高的区域,巢湖和白石天河区域样点则主要分布在基质pH较高而有机质质量分数较低的区域(
图5)。
斯皮尔曼相关性分析进一步证实了这些相关性,研究样本中大多数优势OTUs均与基质pH和有机质质量分数显著相关。其中,称为
Variovorax、
Arthrobacter的菌属以及称为ⅰ1~15目、Ellin6067目和RB41目中的菌属(OTU 194414、OTU 136733、OTU 470261、OTU 525244、OTU 431443和OTU 477830)均与基质pH显著正相关;一种称为Enterobacteriaceae科中的菌属以及称为
Variovorax、
Arthrobacter、
Pseudomonas、
Janthinobacterium和
Flavobacterium的菌属(OTU 40470、OTU 194414、OTU 136733、OTU 141577、OTU 470261和OTU 51694)均与有机质质量分数显著负相关;一种称为
Bradyrhizobium的菌属(OTU 337875)与基质pH和有机质质量分数分别呈显著负相关和显著正相关,如
表4所示。
3 讨 论
3.1 根际微生物群落组成与多样性
本研究结果表明,整个引江济巢沿线共检出根际微生物75门(古细菌3门、细菌72门),其中优势门25门,最丰富的为变形菌门、拟杆菌门和酸杆菌门。与对亚热带湖泊湖滨带根际微生物的研究结果相比,菌门数量较为接近,且优势门的组成也较为相似
[10]。与典型沼泽化湖泊武昌湖主要优势种菰(
Zizania latifolia)的根际微生物组成相比,优势门的组成也表现出极高的相似性
[26]。这表明亚热带区域水陆交错带根际微生物在较大的空间尺度可能存在一定的趋同性。此外,本研究中变形菌门的相对丰度在所有样点均最高,这主要是由于变形菌门本身是细菌中最大的一门,且在土壤氮循环和硫循环相关的大量生物化学过程中起主导作用。在多项研究中,变形菌门均被证实是湖泊湿地微生物群落中的核心根际细菌群落
[27,28]。
4个不同区域相比,巢湖和白石天河区域在优势门组成上更为相似,但巢湖的变形菌门相对丰度在4个区域最高,这是因为变形菌门多为兼性或专性厌氧菌,多存在于污染较重的土壤和废水中
[29];4个区域内巢湖水质最差,更容易导致变形菌门的大量滋生。白石天河区域拟杆菌门相对丰度在4个区域最高,可能主要跟引江济巢工程的施工有紧密联系;拟杆菌门多存在于水生环境中,白石天河在引江济巢施工过程中被高强度开掘清淤,使许多本存在于水体和底泥中的拟杆菌门细菌混入消落区基质中。菜子湖区域酸杆菌门相对丰度在4个区域最高,可能主要跟该区域较低的pH有关;目前对于此门的研究相对较少,已知其在土壤生态系统中有重要作用,且为嗜酸菌,因此菜子湖区域明显更低的pH值与这一变化趋势相吻合。长河⁃长江区域除广泛分布的变形菌门和拟杆菌门以外,还有大量放线菌门分布;已有研究表明,放线菌门相对丰度常与土壤氮含量呈显著正相关关系
[30],长河⁃长江区域土壤较高的全氮含量可能是出现这一现象的主要原因,在其他亚热带湖泊湖滨带和湿地植物根际微生物群落中放线菌门也是大量存在的优势菌门
[10, 26]。
4个区域根际微生物的
多样性也存在显著差异,其中生境相对更为自然的菜子湖和长河⁃长江区域Chao1指数和香农指数明显高于人为干扰较大的巢湖和白石天河区域,这表明消落区生境质量对根际微生物多样性存在重要影响。已有研究表明,过度的人为干扰会造成消落区植被稀疏以及土壤结构与质量的变化,进而导致土壤微生物多样性的降低;而受人类活动干扰较少的河岸带植物群落生长状况较好,植物残体为微生物的生长代谢提供了丰富营养,微生物多样性相对较高
[31]。本研究中白石天河区域由于引江济巢工程施工,大量河道被改造挖掘,河岸带植被破坏严重,干扰强度最高,因此多样性在4个区域最低。巢湖虽然也存在大量硬化堤岸,且植物群落的种类数、密度、盖度和生物量也相对较低,但其人为干扰强度低于白石天河,因此多样性也略高于后者。然而,巢湖和白石天河区域的Goods coverage指数却显著高于其他两个区域,这主要是因为这两个区域个别优势菌门占有更高的比重。
3.2 根际微生物群落与环境因子关系
从RDA分析结果可以看出,引江济巢沿线对根际微生物群落影响最大的环境因子是基质pH,其次是有机质质量分数。4个区域相比,长河⁃长江区域样点主要分布在基质pH和有机质质量分数均较高的区域,菜子湖区域样点主要分布在基质pH较低而有机质质量分数较高的区域,巢湖和白石天河区域样点则主要分布在基质pH较高而有机质质量分数较低的区域(
图5)。4个区域相比,菜子湖基质pH明显低于其他3个区域,但菜子湖和长河⁃长江区域有机质质量分数明显高于巢湖和白石天河区域(
表1),这与RDA排序结果一致。此外,其他一些研究也表明土壤微生物的代谢过程受土壤pH、土壤有机质质量分数、土壤水分和植物群落等的影响
[32‑34]。pH会影响微生物的分子结构,破坏细胞活性,因此微生物群落常与pH呈现显著的相关关系
[35];土壤有机质多来自于植物枯枝落叶及死根的腐殖作用
[36],可为微生物的生长代谢提供营养物质,导致微生物丰富度的提高。这与本研究结果一致。此外,在亚热带湖泊湖滨带区域土壤TN和TP也是显著影响微生物群落的环境因子
[10],但在本研究中却并无显著影响。这主要是由于土壤TN和TP含量的差异可能更多体现于不同季节之间;本研究仅对春季进行了调查,不同样点土壤总氮和总磷差异不大。
斯皮尔曼相关分析结果表明,本研究中大多数优势OTUs丰度虽与主要环境因子均存在显著相关关系,但其与有机质质量分数呈显著负相关,与基质pH呈显著正相关,这与他人研究结果不同。一般在pH相对较低而有机质质量分数更高的环境中微生物丰度会更高
[37, 38]。本研究中15个样点基质pH的变化范围为4.6~7.9,且大多数更接近中性或碱性水平,说明本研究区域大多数优势根际微生物可能更喜欢偏中性的环境。已有研究发现,一些广泛存在于土壤和水体的优势细菌更适应pH较高的环境
[39],以本研究中节杆菌属(OTU 136733,
Arthrobacter属)为例,其广泛存在于空气、水、污染的土壤和污泥等环境中,且许多节杆菌属细菌对有机污染物的最大降解率都是在中性或碱性环境下达到的
[40‑43]。有机质质量分数与优势根际微生物的相互关系有待进一步深入分析。
3.3 总结与建议
本研究结果表明引江济巢沿线4个不同区域生态环境差异较大,且植物根际微生物群落结构和多样性也存在明显不同。人为干扰强烈的白石天河区域和巢湖区域Chao1指数和香农指数明显低于菜子湖区域和长河⁃长江区域。考虑到微生物群落易受水系连通而进行扩散,因此引江济巢工程的运行必然会对4个区域根际微生物群落产生深远影响。基于本研究的结果,建议:(1)积极开展白石天河以及巢湖区域消落区植被的生态恢复工作,改善根际微生物栖息生境,提高根际微生物多样性;(2)加强引江济巢沿线根际微生物的监测与科学研究,促进沿线消落区基底环境的有效改善;(3)开展沿线优势植物与根际微生物相互关系研究,构建更加稳固⁃高效的水陆交错带。