原核Argonaute蛋白介导的干扰作用及其应用

Prokaryotic Argonaute⁃mediated interference and its application

摘要

Argonaute（Ago）蛋白是具有核酸结合能力的蛋白质，有些具有核酸内切酶活性。Ago蛋白在生物体中普遍存在，过去人们主要关注来源于真核生物的真核Ago蛋白，它可以结合小干扰RNA组成RNA诱导沉默复合体，是RNA干扰途径中的重要一环。近年来，人们开始关注原核Ago蛋白。与真核Ago蛋白不同，原核Ago蛋白的结构更加多样，可以分为长型原核Ago蛋白、短型原核Ago蛋白和PIWI⁃RE这三大类，而且更倾向于结合单链DNA进行DNA干扰。不同的原核Ago蛋白通过DNA引导的DNA干扰、RNA引导的DNA干扰等体内干扰途径，利用其识别和结合核酸的能力、核酸酶活性或与其他核酸酶协同作用来抵御外来核酸，为宿主提供免疫保护。由于部分原核Ago蛋白具有对DNA链或RNA链的靶向识别和切割能力，因此可以开发为可编程人工限制性内切酶，还能应用在核酸检测、基因突变检测、荧光原位杂交技术等方面，并且在基因编辑方面具有巨大的应用潜力。概述了Ago蛋白的分类、生理功能，以及原核Ago蛋白的体内干扰途径及其应用前景。

Abstract

Argonaute （Ago） proteins are nucleic acid⁃binding proteins， some of which have endonuclease activity. Ago proteins are widely present in organisms. In the past， researchers mainly focused on eukaryotic Ago proteins. Eukaryotic Ago proteins load small interfering RNAs to form the RNA⁃induced silencing complex， which is an important part of the RNA interference pathways. In recent years， people have begun to focus on prokaryote Ago proteins. Different from eukaryotic Ago proteins， prokaryotic Ago proteins are more structurally diverse and can be categorized into three main groups： long prokaryotic Ago proteins， short prokaryotic Ago proteins， and PIWI⁃RE. They are more inclined to bind to single⁃stranded DNA for DNA interference. Different prokaryotic Ago proteins participate in DNA⁃guided DNA interference， RNA⁃guided DNA interference and other interference pathways in vivo， providing immune protection to the host through their ability to recognize and bind nucleic acids， nuclease activity or synergistic interaction with other nucleases to resist foreign nucleic acids. Since some of the prokaryotic Ago proteins have the ability to target recognition and cleavage of DNA or RNA strands， they can be developed as programmable artificial restriction endonuclease. Prokaryotic Ago proteins can also be applied in nucleic acid detection， gene mutation detection， fluorescence in situ hybridization technology， etc.， and have great application potential in gene editing. In this paper， we provide a review of the classification and physiological functions of Ago proteins， the in vivo interference pathways and application prospect of prokaryotic Ago proteins.

Graphical abstract

关键词

原核Argonaute蛋白 / DNA干扰 / 核酸切割

Key words

prokaryotic Argonaute（pAgo） / DNA interference / nucleic acid cleavage

0 引 言

Argonaute（Ago）蛋白是一类能结合短的核酸向导链（guide strand），并利用它们进行序列特异性识别的蛋白质，有些Ago具有切割互补靶标链（target strand）的核酸内切酶活性。Ago广泛存在于各类生物体中^［1］，最早是在1998年对拟南芥（Arabidopsis thaliana）突变体的研究中发现的，由于该突变体植物的卷曲叶片类似于船蛸（argonaute）的触手，因此将该突变基因编码的蛋白命名为Argonaute^［2］。Ago蛋白家族根据其来源可分为真核Ago（eukaryotic argonaute， eAgo）和原核Ago（prokaryotic argonaute， pAgo）。eAgo在结构上具有较高的保守性，是RNA诱导沉默复合体（RNA⁃induced silencing complex， RISC）的重要组成部分，在RNA干扰（RNA interference， RNAi）过程中起着至关重要的作用^［3］。eAgo可以结合ssRNA向导链（guide RNA， gRNA），并利用其核酸酶活性切割靶标RNA（target RNA， tRNA）或招募其他沉默蛋白进行转录抑制^［3］。

eAgo发现数年后，pAgo才被人们关注。pAgo与eAgo最大的不同是，pAgo更倾向于结合ssDNA向导链（guide DNA， gDNA），而且大多以DNA作为靶标（target DNA， tDNA）。不同的pAgo能结合5'⁃OH/5'⁃P的ssDNA或ssRNA向导链，形成pAgo⁃guide二元复合物，特异性识别互补靶标链后，激活核酸内切酶活性，靶向切割DNA或RNA底物^［4］。如果向导链是5'⁃P链，那么pAgo在靶标链互补区域的第10到11个核苷酸间切割磷酸二酯键（图1），如果向导链是5'⁃OH链，则切割位点可能发生1~2个碱基的偏移^［4］。pAgo这种核酸靶向切割能力与规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR）/CRISPR相关蛋白（CRISPR associated protein， Cas）系统相似。CRISPR⁃Cas系统是原核生物体内的获得性免疫系统，可以识别外源性核酸，并进一步对其切割，近年来已被广泛应用于基因编辑、疾病治疗等领域^［5］。pAgo的核酸内切酶活性也使其被广泛应用于核酸的靶向切割、病毒核酸检测以及癌症早期诊断等方面^［6］。与CRISPR⁃Cas系统不同的是pAgo缺乏解旋酶功能，而且只有一个活性位点，一次只能切割一条DNA链，想要切割双链DNA，就需要让pAgo分别结合两条互补的靶向切割部位的向导链。切割方式的不同并不影响pAgo和CRISPR⁃Cas一样具有应用于基因编辑的潜力。

本文着重介绍不同种类Ago蛋白的基本性质，以及pAgo在体内的不同干扰途径，并概述基于pAgo体外性质（如特异性结合和切割核酸）设计的应用方向，以期为pAgo的体外应用以及基因编辑技术的进一步开发与改进提供参考。

1 Ago蛋白的分类

1.1 真核Ago蛋白

eAgo蛋白参与细胞内基因表达调控，它们结合小干扰RNA（small interfering RNA， siRNA）、microRNA（miRNA）或PIWI相互作用RNA（PIWI⁃interacting RNA， piRNA），通过与其他蛋白因子相互协作来使基因沉默，可以抑制转座子活性，保护细胞免受病毒感染^［7］。另外，部分eAgo具有核酸内切酶活性，与CRISPR⁃Cas系统中的Cas蛋白一样，eAgo可以结合RNA向导链，然后识别并切割互补的靶标RNA，但其靶标核酸中不需要含有PAM序列等额外的序列。

基于结构特征和作用机制，eAgo主要分为四大类，见图2（a）^［8］。第一类是参与细胞质中转录后基因沉默的Ago样（Ago⁃like）蛋白；第二类包括PIWI（pelement induced wimpy testis）样（PIWI⁃like）蛋白，主要存在于动物生殖细胞中，它们通过piRNA抑制转座元件的表达，有助于维持基因组的完整性^［9］；第三类是秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的WAGO蛋白；第四类是布氏锥虫（Trypanosoma brucei）的可干扰转座子活性的Trypanosoma Ago蛋白。

eAgo的数量和功能多样，但在结构上都非常保守，都由N端、PAZ（PIWI⁃argonaute⁃zwille）、MID（middle domain）和PIWI^［10］4个结构域组成，见图2（b）。N端结构域是4个结构域中保守性最低的，可能在双链RNA的解旋与分离过程中起促进作用^［10］。PAZ结构域是一个较小的结构域，大约140个氨基酸残基，参与了向导链3'端的结合，但不是绝对必要的；而且PAZ结构域不仅存在于eAgo中，也存在于核酸内切酶Dicer中，这说明eAgo可能和Dicer具有相似的祖先^［11］。MID结构域包含一个与向导链5'端结合相关的口袋，有的eAgo对向导链5'端首位核苷酸具有结合偏好性，比如人的hAgo2和多孢克鲁维酵母（Kluyveromyces polysporus）的KpAgo偏好结合5'端为尿嘧啶的向导链^［10］。PIWI结构域包含一个保守的催化四联体Asp⁃Glu⁃Asp⁃X（DEDX，其中X可以是天冬氨酸、组氨酸或赖氨酸残基），其与二价阳离子结合后激发核酸切割活性^［12］。

不同的eAgo与不同的小RNA结合，形成了多样的RNAi途径，而不同的RNAi途径可以在同一生物体甚至同一细胞中发挥作用^［7］。eAgo结合短的双链RNA后，释放一条RNA乘客链（passenger strand），之后eAgo与ssRNA向导链结合形成二元复合物，可以识别完全或部分互补的靶标mRNA，具有内切酶活性的eAgo可以进一步对靶标核酸进行切割，不具有内切酶活性的eAgo可以招募其他核酸酶对mRNA进行降解，导致翻译过程受到抑制。RNAi途径广泛参与了各种细胞功能，包括生长、发育、凋亡，及癌变等病理生理过程^［13］，eAgo在其中都起到了重要的作用。

1.2 原核Ago蛋白

通过基因组分析，人们发现细菌和古菌中同样存在编码Argonaute的基因，2018年统计pAgo数量为1 010个^［14］，随着基因组测序技术的不断发展，发现pAgo的数量还在不断增加。约10%~20%的细菌基因组和约30%的古菌基因组中至少含有一个pAgo基因。少数情况下，一种原核生物能同时含多个pAgo基因。

通过系统发育分析可将pAgo分为3大类：长型pAgo（long pAgo）、短型pAgo（short pAgo）和PIWI⁃RE，见图2（a）。长型pAgo具有与eAgo相同的4个结构域，每个结构域的功能也大致相同，长型pAgo又分为long⁃A和long⁃B两种类型^［15］。所有long⁃B pAgo都无核酸内切酶活性，它们通常还具有截短的PAZ结构域，而大多数long⁃A pAgo具有完整的DEDX催化四联体和PAZ结构域，见图2（b）。短型pAgo缺少N端和PAZ结构域，在PIWI结构域的催化四联体中发生一个或多个氨基酸突变，导致其缺乏核酸内切酶活性^［3，15］。PIWI⁃RE也不具有N端和PAZ结构域，其PIWI结构域中具有保守的精氨酸（R）和谷氨酸（E）残基，具有独特的生化特性和生理功能。

通过对pAgo生理功能的研究，发现虽然原核生物不具有RNAi途径，但pAgo可以参与细胞其他生理活动（见表1），或以其他方式保护原核细胞免受外来核酸的侵害。主要作用有：①参与DNA复制。有研究表明，来源于细菌嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）的TtAgo，在体内唯一的Ⅱ型嗜热菌拓扑异构酶⁃解旋酶被抑制的情况下，可以结合来自DNA复制终点的15~18 nt的DNA片段，并与DNA复制的相关蛋白互作，完成环状基因组的复制，表明TtAgo在体内的主要生理功能是帮助解开由DNA复制产生的环状染色体^{［16⁃22］}。②与CRISPR系统协同作用抵御外来核酸。生物信息学分析显示，pAgo基因通常位于防御岛（defense island）上，这是基因组中流动性较强的区域，具有各种与防御相关的基因，保护细菌和古菌免受外来核酸的侵害^［23］。有研究发现，一些pAgo与某些防御系统有关，部分pAgo基因与参与宿主防御的基因（如CRISPR⁃Cas系统）存在于同一个操纵子中^［1］。③与其他核酸酶协同作用抵御外来核酸。许多短型pAgo含有SIR2（silent information regulator 2）或TIR（Toll/interleukin⁃1 receptor）结构域，或者与SIR2和TIR基因相邻近^［3，24］。这些结构域是细菌抗噬菌体的Thoeris防御系统的一部分，SIR2/Ago和TIR/Ago系统保护细菌细胞免受噬菌体和质粒的侵害，在噬菌体感染细胞后，具有MID⁃PIWI结构域的短型pAgo识别外源DNA，通过MID结构域形成多聚体，激发SIR2或TIR的NADase活性，耗尽细胞内的NAD^+［24］，导致细胞死亡并阻止噬菌体在群体中的传播^［25］。也有部分长型pAgo与来自不同家族的核酸酶相互协作，利用这些核酸酶产生向导链，引发下一步切割。④诱导同源序列之间的DNA干扰。来源于丁酸梭菌（Clostridium butyricum）的CbAgo从质粒或其他多拷贝遗传元件中产生并结合gDNA，然后在同源位点引入双链断裂（double⁃strand breaks，DSB）^［26］，并与大肠杆菌（Escherichia coli）核酸外切酶RecBCD一起作用，介导DNA降解，产生更多能与CbAgo结合的ssDNA向导链，通过这种机制，可以有效靶向和消除多拷贝遗传元件，并抑制质粒的传播和噬菌体的感染^［17］。

2 pAgo的体内干扰途径

2.1 DNA引导的DNA干扰

有许多pAgo是在DNA引导下进行DNA干扰，其中的典型代表就是TtAgo。有研究发现，当嗜热栖热菌的TtAgo基因被转座子插入破坏后，嗜热栖热菌能够吸收外源DNA^［4］，这一现象表明，TtAgo可能在宿主防御方面起作用。进一步的研究发现，TtAgo不是在mRNA水平上调节其他参与宿主防御的基因的表达，而是通过DNA引导的DNA干扰，直接在DNA水平上切割入侵的核酸。

在体内，TtAgo与长度为13~25 nt的DNA向导链结合，在这些向导链的引导下结合和切割互补的DNA靶标。研究表明这些小的DNA向导链主要是TtAgo通过“chopping”机制产生的，见图3（a）^［27］。无向导链的TtAgo切割稳定性不高的DNA（例如富含AT的双链DNA或错配的DNA）并产生短双链DNA片段，这些片段随后结合到TtAgo上。之后双链DNA片段中与向导链互补的乘客链释放，形成TtAgo⁃gDNA复合物，复合物结合并切割与其互补的靶标DNA^［27］。分别具有互补的DNA向导链的两个TtAgo⁃gDNA复合物可以同时切割双链DNA的两条链，造成双链断裂^［4］。通过“chopping”机制，TtAgo可以从外源质粒上获得向导链，引发DNA引导的DNA干扰，切割入侵的DNA，降低细胞内外源质粒的水平。

与TtAgo类似，大部分具有切割活性的long⁃A pAgo都能以“chopping”机制从质粒DNA上获得向导链，进而在DNA引导下进行DNA干扰。pAgo可以通过几个因素来区分入侵DNA和自己的基因组DNA，如DNA染色质状态、入侵DNA的AT含量、基因拷贝数和Chi位点的存在与否^［19］。对于pAgo，“chopping”机制造成的切割不如ssDNA介导的靶向切割迅速高效。因此，尽管pAgo的DNA“chopping”机制可能提供一定的机会来抵抗入侵的核酸，但消除入侵DNA主要还是依靠效率更高的DNA引导的DNA干扰^［17］。此外，pAgo⁃gDNA复合物可以靶向同一入侵DNA的多个拷贝，因此可能会对入侵DNA进行多代干扰^［28］。

2.2 RNA引导的DNA干扰

来源于类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）的RsAgo^［21］是使用RNA引导的DNA干扰的典型代表。RsAgo不具备核酸酶活性，但可以通过靶向识别和结合能力对DNA进行干扰。RsAgo的PAZ结构域中没有与向导链3'端结合相关的口袋^［22］，这可能使RNA向导链和DNA靶标链之间的碱基完全配对，而不会引起RsAgo的构象变化，增强了RsAgo⁃gRNA复合物与DNA靶标结合的稳定性。

在类球红细菌基因组中，RsAgo基因与DNA酶基因相邻，在RsAgo结合靶标DNA后可以招募这些核酸酶进行DNA降解，见图3（b）^［22］。人们还发现，即使缺乏核酸酶，与不表达RsAgo的大肠杆菌相比，在大肠杆菌中异源表达RsAgo也会导致细胞内质粒浓度降低，质粒编码基因的表达也变低^［29］。与TtAgo类似，RsAgo不影响其他参与宿主防御相关的内源性基因的表达，这表明它能直接由RNA引导进行DNA干扰，参与宿主防御^［30］。

与RsAgo类似的部分长型pAgo可以从转录组中获得RNA向导链片段^［21］，在RNA引导下间接对DNA进行干扰，比如利用其识别和结合能力，通过抑制转录或复制来沉默DNA。也可能在结合靶标DNA后，招募基因共定位的核酸酶，对互补链进行降解^［29］。还有部分长型pAgo本身就具有靶向切割DNA的能力，可以在RNA引导下直接进行DNA干扰，这些DNA分子大部分来自质粒、基因组编码转座子或噬菌体基因的外源片段。

2.3 其他干扰途径

尽管长型pAgo的体内其他干扰途径未有明确报道，但通过体外研究发现，AaAgo由DNA引导进行RNA干扰^［31］；来源于耐氢海袍菌（Marinitoga hydrogenitolerans）的MhAgo可以使用所有类型的向导链（5'⁃OH/5'⁃P DNA/RNA）在体外靶向切割DNA和RNA^［32］。

短型pAgo缺乏N端和PAZ结构域，而且PIWI的催化四联体不完整^［24］，其编码基因通常与编码PAZ类似物APAZ结构域的基因相关联^［15］。部分情况下，APAZ结构域与Mrr、TIR等核酸酶连接，形成APAZ⁃核酸酶结构域，结合在短型pAgo上，见图3（c）^［24］。短型pAgo虽然没有核酸切割活性，但可以获取mRNA片段作为向导链，识别和结合靶标核酸，在结合靶标核酸之后，短型pAgo形成多聚体，相关的APAZ⁃核酸酶则在DNA/RNA干扰中发挥作用。

与短型pAgo类似，PIWI⁃RE同样缺乏N端和PAZ结构域，但其MID和PIWI结构域是保守的，这表明它们也具有靶标识别功能，一些PIWI⁃RE还具有完整的催化四联体，可以对靶标核酸进行切割。此外，PIWI⁃RE在N端含有一个独特的保守结构域X（Domain X）^［33］，其可能为与大多数与PIWI⁃RE共存的解旋酶和核酸酶提供了一个相互作用位点。大多数PIWI⁃RE基因在具有DinG型解旋酶和核酸酶的操纵子上，DinG型解旋酶作用于在噬菌体和质粒复制和转录过程中发现的RNA⁃DNA双链，这些解旋酶有可能参与PIWI⁃RE⁃guide二元复合物中向导链与靶标链的解离，或者将靶标核酸的双链解开以便PIWI⁃RE可以发挥切割作用^［33］；共同表达的核酸酶可能参与了向导链的生成或靶标链的切割，协助PIWI⁃RE进行DNA/RNA干扰。

3 pAgo的主要应用方向

3.1 可编程人工限制性内切酶

与普通限制性核酸内切酶不同，pAgo可以通过结合不同的ssDNA向导链，识别和靶向切割任何位点的DNA序列，并获得具有粘性末端或平末端的片段，不要求靶标链中存在固定的限制位点。根据这一特点，pAgo被开发为可编程的人工限制性核酸内切酶（artificial restriction enzyme， ARE），用于DNA组装和DNA指纹识别。部分pAgo已投入商用^［34］，比如PlasmidMaker平台利用来源于激烈热火球古菌（Pyrococcus furiosus）的PfAgo的人工限制性内切酶将多个DNA片段组装成质粒，该方法具有更高的灵活性和精确度。pAgo不仅比普通限制性核酸内切酶的使用范围更广，而且还能通过反应体系的调整或向导链的特殊设计来提升切割的活性和准确性。

3.2 核酸检测

pAgo的一个重要应用领域是检测生物样品中的靶标序列。基于pAgo的核酸检测方法灵敏度极高，可在多种情况下检测单核苷酸多态性^{［35，36］}。基于PfAgo开发了一种检测样品中保守序列的系统，称为PAND（PfAgo⁃mediated nucleic acid detection）^［35］，该技术对逆转录得到的SARS⁃CoV⁃2 DNA进行靶向切割，为随后切割荧光分子信标产生荧光输出提供向导链。由于pAgo的高转换率，使得信号的扩增来自快速的酶切，而不是传统qPCR检测中较慢的PCR扩增，这使得检测所需时间大大缩短，这一方法已被成功用于SARS⁃CoV⁃2 RNA及其突变体鉴定^［36］。

将PAND和连接酶链式反应结合，形成了PLCR（PfAgo coupled with modified ligase chain reaction for nucleic acid detection）^［37］，可以区分野生型SARS⁃CoV⁃2基因的单碱基突变，有效区分新型冠状病毒和其他冠状病毒，在70 min内实现多通路检测。此外，连接酶链式反应产物可以直接作为DNA向导链被使用，无需额外输入向导链，简化了核酸检测的流程^［37］。在所有这些分子诊断应用中，主要使用高温pAgo，因为较高的操作温度可以避免靶标识别或切割时对解旋酶的需求。基于pAgo的分子诊断方法具有与商业方法相当的灵敏度，成本较低，而且比qPCR更快产生结果。

3.3 基因突变检测

当向导链和靶标链互补区域的第10或第11位核苷酸出现错配情况时，与完全互补配对的情况相比，pAgo的核酸酶活性大大降低。根据这一特性，可以快速分析目标等位基因是否发生突变，如果基因发生突变，pAgo无法在未突变向导链的引导下对其进行切割，而野生型基因能被靶向切割，通过凝胶电泳就可以观察到条带的不同。根据相同的原理，也可以对单核苷酸突变进行检测，野生型DNA将被pAgo快速切割，而突变基因的相对数量将增加，这种富集完成后，可以提高后续检测（各种PCR技术、测序等）罕见基因突变的灵敏度^［38］。基于此原理开发了NAVIGATER方法（nucleic acids of clinical interest Via DNA guided Argonaute from Thermus thermophilus），用于检测罕见的单核苷酸突变，例如检测早期癌症，发现在癌细胞中发生的碱基替换^［38］。

3.4 Ago⁃PAINT

pAgo还可以应用在超分辨率成像技术中。DNA⁃PAINT（DNA point accumulation in nanoscale topology）是一种超分辨率显微成像技术，将DNA靶标链连接在目标分子上，作为对接链（docking strand），利用与荧光物质相连的成像链（imager strand）与对接链的结合和解离对目标分子进行荧光成像。目前的DNA⁃PAINT技术成像链与对接链的结合率低，导致荧光获取速度缓慢^［39］。有研究发现，不具有切割活性的pAgo可以将DNA成像链转换成螺旋结构，使其与对接链的结合速度提高10倍，将这种方法称为Ago⁃assisted DNA⁃PAINT（Ago⁃PAINT）^［39］。通过2D DNA折纸结构实验，研究者对Ago⁃PAINT和DNA⁃PAINT在每个时间点后的超分辨率图像质量进行了评估，发现Ago⁃PAINT在每个时间点的定位精度标准误差都小于DNA⁃PAINT，证明了Ago⁃PAINT可以在保证高分辨率的同时，将现有DNA⁃PAINT技术的速度提高一个数量级。

3.5 基于dTtAgo蛋白的AgoFISH

DNA荧光原位杂交（fluorescence in situ hybrid‍ization， FISH）是将标记生物素或荧光素的单链核酸作为探针，通过碱基互补配对，使探针与细胞内的DNA原位杂交，让细胞中的基因组区域可视化。当前FISH的探针制备方法具有合成成本高、实验程序复杂、结合效率较低等问题，限制了该方法的适用性。有研究发现基于失活TtAgo（dTtAgo）的DNA结合能力，可开发一种新的称为AgoFISH（Argonaute⁃based fluorescence in situ hybridization）的方法^［40］。该方法的原理为：N端含有荧光蛋白的dTtAgo与5'⁃P gDNA结合后，将荧光标记带到与DNA向导链互补的内源性DNA序列上，使基因组序列可视化。与传统的FISH技术相比，AgoFISH具有以下两个优势：一是AgoFISH使用的ssDNA向导链长度为15~21 nt，是传统FISH方法所需ssDNA长度的1/3到1/5，节约了单链核酸的合成成本；二是AgoFISH将荧光标记转移到dTtAgo上，dTtAgo作为一种可以在大肠杆菌中表达和纯化的蛋白，简化了探针制备程序。这种经济高效且简单的方法，为染色质精细结构研究以及基于FISH的临床分子诊断提供了方便而强大的工具^［40］。

3.6 基因编辑

从第一代锌指核酸酶（zinc finger nuclease， ZFN）技术，到第二代类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator⁃like effector nuclease， TALEN）技术，再到第三代CRISPR⁃Cas9（CRISPR⁃associated protein 9， Cas9）系统，基因组编辑工具在不断发展，人们也在不断寻找更简单和更完善的基因编辑方法。pAgo对于核酸的靶向切割能力使其很有可能成为编辑基因组和转录组的重要工具。

来源于格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacterium gregoryi）的NgAgo是一种中温嗜盐pAgo，2016年有报道称其可以结合DNA向导链在体内编辑人类细胞基因组^［41］，但由于可重复性问题在科学界引发了争议^{［42，43］}。在后续实验中发现NgAgo在体外和在大肠杆菌体内均表现出DNA引导的切割活性，并在大肠杆菌和多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）中增强了同源重组介导的基因插入或基因编辑。虽然目前尚不清楚这种现象是否仅由NgAgo的切割活性引起，但有证据表明，基因编辑与NgAgo结合的外源5'⁃P ssDNA向导链相关，而且依赖于PIWI结构域的切割活性^［18］。然而，NgAgo是一种来源于嗜盐古菌的蛋白质，在正常盐浓度条件下，这种蛋白质的溶解性不高，并且具有额外的ssDNA结合蛋白结构域，因此不适合进一步开发。

迄今为止，最有希望实现基因编辑的中温pAgo是CbAgo，CbAgo利用5'⁃P DNA作为向导链，可以在30~50 ℃对DNA底物进行切割，体外表达时在37 ℃具有最佳活性，也证明可以在37 ℃培养的大肠杆菌中切割DNA^［26］。CbAgo结合的向导链具有高拷贝数、存在Chi位点等特征，说明向导链可能是来源于质粒的内源性DNA分子，而不是外源输入的ssDNA^［26］。向导链生成和传递可能是pAgo进行基因编辑的限制性因素，因此可以自主生成内源向导链的CbAgo具有极大的应用潜力。

pAgo相比于Cas核酸酶具有应用优势。第一，pAgo分子的大小比Cas9分子小，而且不需要逆转录酶的协作，基于pAgo的基因编辑体系可以更加精简。第二，pAgo不受PAM限制，从而可以更灵活地选择靶标核酸，更精细地控制细胞表型^［5］。第三，大多数pAgo结合短DNA向导链^［15］，而Cas核酸酶需要结合长RNA。DNA相对于RNA更加稳定，而且DNA合成更加经济。以上因素将促进基于pAgo的基因组编辑系统的发展。迄今为止，对于中温pAgo的研究越来越多，虽然暂时还不能成功将pAgo用于体内基因编辑，但它们在37 ℃表现出的靶向切割活性，为基因编辑和其他应用打下基础^［8］。

4 展 望

pAgo较eAgo发现晚，但近年来对pAgo的结构和功能的研究已经取得了很大进展，发现不同的pAgo以不同的体内干扰途径参与宿主的生理活动，在免疫防御中起作用。大多数长型pAgo可以由DNA或RNA向导链介导，特异性识别和靶向切割DNA或RNA，这一性质使得pAgo具有广阔的应用范围，也说明pAgo具有作为基因编辑工具的潜在可能性。

由于高温pAgo最适温度较高，不适合对中温生物的细胞进行基因编辑，因此中温pAgo在基因编辑等应用方面具有巨大的潜力^［8］。虽然目前还未发现可以独立表现出有效的基因编辑能力的中温pAgo，但是未来人们可以探究pAgo进行基因编辑的适合反应条件，或者挖掘更多的pAgo蛋白。克服各种障碍后，pAgo将和CRISPR系统一样，用于基因表达调控、表观基因组编辑和体内成像^［44］，而且pAgo具有分子量小、不依赖PAM序列等独特的优势。基于pAgo的基因编辑体系有望成为CRISPR⁃Cas系统的替代品^［45］，在癌症研究、人类疾病动物模型的生成和作物开发等多个领域产生重大影响。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31770072)