一点缀螟肠道降解食物营养及次生代谢物可培养细菌的筛选研究

Screening studies on culturable bacteria for degradation of food nutrients and secondary metabolites in the intestinal tract of Paralipsa gularis

摘要

一点缀螟Paralipsa gularis（Zeller）是近年来在云南玉米产区发现的一种严重危害玉米果穗的害虫，为了明确其肠道可培养细菌对食物营养及次生代谢物质的代谢功能，本研究采用透明圈生物测定法结合高效液相色谱技术，筛选研究了一点缀螟幼虫肠道可培养淀粉、纤维素、蛋白质、阿魏酸、香草醛和对羟基苯甲酸的降解菌。结果表明，从一点缀螟肠道可培养细菌中共筛选到18株分别具有淀粉、纤维素、蛋白质、阿魏酸、香草醛和对羟基苯甲酸降解力的细菌，其中淀粉降解能力最强的为枯草芽胞杆菌（DH3），透明圈直径(H_p)和菌落直径(D_p)的比值为1.70；纤维素的降解能力最强的是苏云金芽胞杆菌（BS1），H_p/D_p为4.46；蛋白质降解能力最强的为粘质沙雷氏菌（BS5），H_p/D_p为3.46；阿魏酸降解能力最强的是枯草芽胞杆菌（DH3），降解率达99.92%；香草醛的降解能力最强的是假格里尼翁布鲁氏菌（DH5），降解率达99.82%；腐生葡萄球菌（BS2和BS7）、平流层芽胞杆菌（BS4）、粘质沙雷氏菌（BS5）、蜡样芽胞杆菌（BS8）和假格里尼翁布鲁氏菌（DH5）的对羟基苯甲酸降解能力都很强，降解率均达100%。综上所述，一点缀螟肠道富含能降解玉米营养物质及玉米次生代谢物质的细菌，这些肠道细菌在一点缀螟的营养物质和次生代谢物质代谢中发挥了重要作用。该结果将为一点缀螟肠道细菌功能的研究及综合防治提供理论依据，同时为功能菌株的开发利用提供菌株资源。

Abstract

Paralipsa gularis （Zeller） （P.gularis） is a serious pest of corn cob found in Yunnan maize production areas in recent years. To clarify the metabolic function of its intestinal culturable bacteria on food nutrients and secondary metabolites， we used the combination method of thylakoid bioassay and high-performance liquid chromatography， to screen and study the degrading bacteria of the larval intestine of P.gularis that can be cultured for starch， cellulose， protein， ferulic acid， vanillin， and p-hydroxybenzoic acid. The results show that 18 bacterial strains are screened from P.gularis intestinal culturable bacteria with starch， cellulose， protein， ferulic acid， vanillin， and p-hydroxybenzoic acid degrading power， respectively. Among them， Bacillus subtilis （DH3） has the strongest starch degrading ability， with the ratio of hyaline circle (H_p) and colony diameter (D_p) of 1.70. Bacillus thuringiensis （BS1） has the strongest degradation of cellulose， with H_p/D_p of 4.46. Serratia marcescens （BS5） has the strongest protein degradation， with H_p/D_p of 3.46. Bacillus. subtilis （DH3） has the strongest degradation of ferulic acid， with a degradation rate of 99.92%. Brucella pseudogrignonii （DH5） has the strongest degradation of vanillin， with a degradation rate of 99.82%. Staphylococcus saprophyticus （BS2 and BS7）， Bacillus stratosphericus （BS4）， Serratia marcescens （BS5）， Bacillus cereus （BS8）， and Brucella pseudogrignonensis （DH5） all have a strong ability to degrade p-hydroxybenzoic acid （degradation rates： 100%）. In summary， the intestinal tract of P.gularis is enriched with bacteria that can degrade maize nutrients and maize secondary metabolites， and these intestinal bacteria play an important role in the metabolism of nutrients and secondary metabolites in P.gularis. The results will provide not only a theoretical basis for the study of the functions of P.gularis intestinal bacteria and the comprehensive control of P.gularis， but also the strain resources for development and utilization of functional bacterial strains.

Graphical abstract

关键词

玉米 / 一点缀螟 / 肠道细菌 / 营养物质 / 次生代谢物质 / 降解功能

Key words

maize / Paralipsa gularis （Zeller） / intestinal tract / nutrient / secondary metabolite / degradability

0 引 言

一点缀螟Paralipsa gularis （Zeller） （P.gularis）又名一点谷螟、一点织螟，隶属鳞翅目Lepidoptera螟蛾科Pyralidae，源起于东南亚，随农产品贸易进入欧洲，在中国除西北地区和西藏未发现外，其余各地均有发现。一点缀螟可以危害种子、坚果、麦麸、罗望子等植物^［1］，中国在2018年首次报道一点缀螟表现出特殊的食性，严重危害玉米果穗表面和穗芯，同时引起玉米穗腐病的发生，若防治不及时或未防治，会导致玉米绝收^［2-4］。

昆虫肠道为微生物提供了一个特定的定殖环境，肠道菌群为宿主昆虫提供了很多潜在的有益作用^［5］：（1）协助消化植物组织结构物质和为昆虫提供一些自身无法合成的特定营养物质，如B族维生素、固醇和氨基酸等，还可产生一些酶类^［6，7］；（2）影响宿主昆虫的生长发育和行为，如斑翅果蝇（Drosophila suzukii）去除肠道菌后生长发育迟缓，在食物中添加共生肠道菌弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundi）和产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）后，能促进宿主的生长发育^［8］，沃尔巴克氏菌在昆虫体内可以合成或分解产生代谢物，对宿主的睡眠、学习、记忆、交配、进食和攻击行为均会造成影响^［9］；（3）提升昆虫的解毒作用，肠道微生物在解毒过程中诱导宿主合成解毒酶，通过矿化作用或共代谢过程降解农药和植物次生代谢物质^{［10，11］}；（4）通过质粒介导的水平转移获得和传播抗生素抗性基因，可能促进蜜蜂肠道菌及环境之间耐药基因的传播和富集等^［12］；（5）调节宿主的免疫系统，增强昆虫对病原微生物和寄生虫的抵抗能力^［13］；（6）促进宿主与寄主间的种间通讯等^［14］。香草醛、对羟基苯甲酸和阿魏酸是玉米籽粒主要的酚类次生代谢物质^［15］，这3种物质对昆虫具有拒食、毒杀、吸引或排斥作用，从而保护植物免受昆虫的侵害^［16-19］，测定宿主昆虫肠道微生物对营养物质和次生代谢物质的降解作用有助于解释寄主植物的适应性和为功能细菌的开发利用提供菌株资源。

目前，国内外对一点缀螟的研究报道较少，关于其肠道细菌功能和寄主适应的研究还未见有报道。因此，本研究通过筛选已分离得到的一点缀螟肠道细菌对寄主植物主要营养物质淀粉、纤维素和蛋白质及次生代谢物质阿魏酸、香草醛和对羟基苯甲酸的降解菌，采用高效液相色谱仪测定了共生菌对阿魏酸、香草醛和对羟基苯甲酸降解能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 可培养肠道细菌

供试肠道细菌为分离自一点缀螟幼虫肠道的细菌菌株，保存于云南农业大学植物保护学院昆虫病原体实验室。

1.1.2 主要试剂

阿魏酸、对羟基苯甲酸和香草醛标准品（北京索莱宝科技有限公司）。

LB培养基：胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、酵母浸粉5.0 g、琼脂20.0 g，无菌水1 000 mL，调至pH 7.0^［20］。

酪蛋白培养基：酪素5.0 g，牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂15.0 g，无菌水1 000 mL，pH 7.0~7.5^［21］。

淀粉培养基：蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，牛肉膏5.0 g，可溶性淀粉20.0 g，琼脂20.0 g，pH 7.0，无菌水1 000 mL^［22］。

羧甲基纤维素钠培养基：NaNO₃ 2.0 g，K₂HPO₄ 1.0 g，MgSO₄ 0.5 g，KCl 0.5 g，CMC 2.0 g，蛋白胨0.2 g，琼脂20.0 g，pH 7.2，无菌水1 000 mL，121 ℃灭菌15 min^［23］。

碘液：称取2.0 g KI溶于少量水中，加入1.0 g I₂，溶解后用去离子水定容至300 mL。

无机盐液体培养基：MgSO₄·7H₂O 0.2 g，（NH4）₂SO₄ 1.0 g，KH₂PO₄ 0.5 g，NaCl 0.5 g，K₂HPO₄ 1.5 g，琼脂 20.0 g，无菌水1 000 mL，阿魏酸、对羟基苯甲酸和香草醛浓度为0.1 g/L。

1.1.3 主要仪器

游标卡尺ARZ-1331（艾瑞泽）；电子天平GBT23111（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；台式冷冻离心机2-16R（湖南恒诺仪器设备有限公司）；超净工作台SW-CJ-2F（苏州安泰空气技术有限公司）；高压蒸汽灭菌锅LT-CPS（立德泰勒上海科学仪器有限公司）；精密可编程烘箱LT-DBX60N（立德泰勒上海科学仪器有限公司）；恒温光照培养箱RG-300（宁波赛福实验仪器有限公司）；摇床ZQLY-180F（上海知楚仪器有限公司）；超高效液相色谱仪LC-20A（岛津仪器（苏州）有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 可培养细菌对淀粉、纤维素和蛋白质的降解作用测定

采用透明圈法测定可培养细菌对淀粉、纤维素和蛋白质的降解能力。将分离纯化得到菌株的单菌落接种于20 mL LB液体培养基中，25 ℃下180 r/min振荡培养24 h，吸取5 μL菌悬液分别点接在淀粉培养基、羧甲基纤维素钠培养基和酪蛋白培养基上，每个平板重复3次，在25 ℃条件下培养48 h，在淀粉培养基、羧甲基纤维素钠培养基中加入适量碘液，在酪蛋白培养基中加入适量1%三氯乙酸后静置10 min，观察各菌株透明圈产生情况，采用“十字交叉法”进行测量，依据菌株产生的透明圈直径（H_p）与菌落直径（D_p）的比值（H_p/D_p）大小判断各菌株对淀粉的降解能力，并拍照记录^{［21，22］}。

1.2.2 可培养玉米籽粒次生代谢物质降解菌的筛选

采用点解法将纯化培养的菌株分别接种至以阿魏酸、香草醛和对羟基苯甲酸为唯一碳源的无机盐培养基上，在25 ℃培养箱培养72 h，观察是否长出明显菌落。

1.2.3 用高效液相色谱仪测定香草醛、对羟基苯甲酸和阿魏酸降解率

将筛选到的香草醛、对羟基苯甲酸和阿魏酸降解菌活化接种于LB液体培养基中，在28℃、220 r/min条件下过夜培养作为种子液。取种子液1 mL接入50 mL以苯甲酸作底物的无机盐液体培养基中，底物浓度均为0.10 g/L。分别取零时样品和37℃、180 r/min振荡培养3 d的末时样品，0.22 μm滤膜过滤后用高效液相色谱法检测底物量，从而计算底物降解效率。高效液相条件：色谱柱为Shimadzu Shim-pack XR-ODS Ⅲ（2.0 mmI.D.×75 mmL.，1.6 μm）；柱温：40℃；流动相为A-5Mm甲酸铵（含0.05%甲酸），B-甲醇；洗脱方式为梯度洗脱1~3 min；流速为0.3 mL/min；进样体积为5 μL。

1.2.4 数据分析

利用Excel 2016软件和IBM SPSS Statistics 26软件进行数据处理及统计分析；利用GraphPad Prism 9软件和Adobe Illustrator 2023软件制图。

2 结果与分析

2.1 一点缀螟肠道可培养细菌对淀粉、纤维素和蛋白质的降解作用

2.1.1 淀粉降解菌的筛选

通过淀粉培养基上产生的透明圈筛选出具有淀粉降解作用的菌株，结果显示，在一点缀螟肠道可培养细菌中共筛选出10株淀粉降解菌（见表1，图1），分别是苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）BS1，腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）BS2、BS7，平流层芽胞杆菌（Bacillus stratosphericus）BS4、DH4，粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）BS5，蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）BS8、DH7，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DH3和嗜线虫沙雷氏菌（Serratia nematodiphila）DH8。其中菌株DH3的产淀粉酶能力较强（H_p/D_p=\mathrm{1.70},\mathrm{大于}\mathrm{1.5}），与菌株BS5的降解能力有显著性差异，如图2所示。

2.1.2 纤维素降解菌的筛选

在一点缀螟肠道可培养细菌中共筛选出11株纤维素降解菌（见表2，图3），分别是苏云金芽胞杆菌BS1，平流层芽胞杆菌BS4、DH4，粘质沙雷氏菌BS5，深红沙雷氏菌（Serratia rubidaea）BS6，蜡样芽孢杆菌BS8、DH7，非脱羧勒克氏菌（Leclercia adecarboxylata）BS10，枯草芽胞杆菌DH3，假格里尼翁布鲁氏菌（Brucella pseudogrignonensis）DH5和嗜线虫沙雷氏菌DH8。有3株产纤维素酶能力较强(H_p/D_p>\mathrm{2.5})，分别是BS1、BS8和DH5。其中，菌株BS1的产纤维素酶能力最强（H_p/D_p=\mathrm{4.46}），与其余2株差异显著（见图4）。

2.1.3 蛋白质降解菌的筛选

在一点缀螟肠道可培养细菌中共筛选出15株蛋白质降解菌（见表3，图5），分别是苏云金芽胞杆菌BS1，腐生葡萄球菌BS2、BS7，高地芽胞杆菌（Bacillus altitudinis）BS3、DH2，平流层芽胞杆菌BS4、DH4，粘质沙雷氏菌BS5，深红沙雷氏菌BS6，蜡样芽胞杆菌BS8、DH7，解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）DH1，枯草芽胞杆菌DH3，假格里尼翁布鲁氏菌DH5和嗜线虫沙雷氏菌DH8。有3株产蛋白酶的能力较强(H_p/D_p>\mathrm{2.5})，分别为BS5、BS6和BS7。其中，菌株BS5的产蛋白酶能力最强(H_p/D_p=\mathrm{3.46})，与菌株BS6和BS7相比具有极显著性差异，如图6所示。

2.1.4 一点缀螟肠道菌产酶能力分析

从一点缀螟肠道可培养细菌中筛选出的功能菌株其产酶种类和能力各异（见图7）。综上所述，一点缀螟肠道可培养细菌19株中有16株具有产消化酶的功能，占比高达84.21%。产酶综合能力比较结果如图7所示，菌株BS1、BS4、BS5、BS8、DH3、DH4、DH7和DH8都具有产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶的能力，其中，苏云金芽胞杆菌BS1的产酶综合能力最强，同时产纤维素酶的能力最强。菌株BS2和BS7具有产淀粉酶和蛋白酶的能力，菌株BS6和DH5具有产蛋白酶和纤维素酶的能力。菌株BS3、DH1、DH2和BS10分别具有产蛋白酶和纤维素酶的能力，未发现产其余2种酶的能力。其中苏云金芽孢杆菌BS1、粘质沙雷氏菌BS5、蜡样芽胞杆菌BS8和枯草芽胞杆菌DH3综合产酶能力突出，具有开发利用潜力。

2.2 对玉米籽粒主要次生代谢物降解菌筛选

以阿魏酸、香草醛和对羟基苯甲酸为唯一碳源培养基筛选到的玉米籽粒次生代谢物质降解菌株如表4所示，除非脱羧勒克氏菌（BS10）和阿尔莱特葡萄球菌（BS11）外，其余菌株都能至少利用一种玉米籽粒次生代谢物质。根据菌株是否能较好利用阿魏酸、香草醛和对羟基苯甲酸，共筛选出阿魏酸降解菌11株9种，其中，苏云金芽胞杆菌（BS1）、蜡样芽孢杆菌（BS8）、枯草芽胞杆菌（DH3）和嗜线虫沙雷氏菌（DH8）生长情况较好。

香草醛降解菌16株12种，其中苏云金芽胞杆菌（BS1）、粘质沙雷氏菌（BS5）、深红沙雷氏菌（BS6）、蜡样芽胞杆菌（BS8）、解淀粉芽胞杆菌（DH1）、枯草芽胞杆菌（DH3）和假格里尼翁布鲁氏菌（DH5）生长情况较好。

对羟基苯甲酸降解菌15株12种，其中，腐生葡萄球菌（BS2和BS7）、平流层芽胞杆菌（BS4和DH4）、粘质沙雷氏菌（BS5）、蜡样芽胞杆菌（BS8）、鹌鸡肠球菌（BS9）和假格里尼翁布鲁氏菌（DH5）生长情况较好。

2.3 一点缀螟肠道菌对玉米籽粒主要次生代谢物降解率测定

将筛选得到的一点缀螟肠道阿魏酸、香草醛和对羟基苯甲酸降解菌经过无机盐液体培养基震荡培养72 h后，通过高效液相色谱仪得到标准峰面积（见图8），根据降解率公式计算17株菌分别对阿魏酸、香草醛和对羟基苯甲酸的降解率（见表5），11株阿魏酸降解菌中只有1株对阿魏酸的降解率在99%以上，为DH3枯草芽胞杆菌（99.92%）；菌株BS3高地芽胞杆菌、BS8蜡样芽胞杆菌和DH2高地芽胞杆菌对阿魏酸的降解率在90%以上，分别为97.22%、94.38%、96.55%；16株香草醛降解菌中，有10株的香草醛降解率在99%以上，分别是BS1苏云金芽胞杆菌、BS2腐生葡萄球菌、BS4平流层芽胞杆菌、BS5粘质沙雷氏菌、BS6深红沙雷氏菌、BS7腐生葡萄球菌、BS8蜡样芽胞杆菌、DH3枯草芽胞杆菌、DH4平流层芽胞杆菌和DH5假格里尼翁布鲁氏菌，DH5的香草醛降解能力最强，降解率达到99.82%；菌株DH1解淀粉芽胞杆菌和DH6嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的香草醛降解率在90%以上，分别为96.33%和96.65%；15株对羟基苯甲酸降解菌中有6株对对羟基苯甲酸的降解率为100.00%，分别是BS2腐生葡萄球菌、BS4平流层芽孢杆菌、BS5粘质沙雷氏菌、BS7腐生葡萄球菌、BS8蜡样芽胞杆菌和DH5假格里尼翁布鲁氏菌，菌株DH3枯草芽胞杆菌的对羟基苯甲酸降解率在90%以上，为94.80%。

综上，菌株BS8蜡样芽胞杆菌和菌株DH3枯草芽胞杆菌对3种玉米籽粒次生代谢物质的降解率均在90%以上，具有较好的降解作用。

3 讨 论

昆虫与植物之间有着复杂的关系，昆虫从植物获得食料是最原始的生态关系，植物所含的营养成分是昆虫生长发育和繁殖的必要条件，而昆虫肠道内的菌群会给昆虫的营养带来影响^{［24，25］}。昆虫缺乏完整的酶系统，需要肠道微生物为食物消化、营养吸收和生物代谢提供不同种类的酶^［26］。本研究通过分离培养，从一点缀螟肠道中筛选出具有降解淀粉、纤维素、蛋白质、阿魏酸、香草醛和对羟基苯甲酸能力的细菌，共18株14种，占所有肠道可培养细菌（19株）的94.74%。这些结果表明，一点缀螟的肠道细菌可以帮助其消化、吸收和代谢玉米的营养物质和次生代谢物质。

本研究共筛选出淀粉降解菌10株7种，其中，枯草芽胞杆菌的淀粉降解能力最强，这与枯草芽胞杆菌分泌的胞外产物中具有淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶是分不开的^［27］。本研究共筛选出纤维素降解菌11株9种，其中，苏云金芽胞杆菌的纤维素降解能力最强。草地贪夜蛾和蝗虫肠道中的芽胞杆菌具有很强的纤维素降解能力，本研究也发现了类似的现象，在一点缀螟筛选出的7株芽胞杆菌也验证了这一结果^{［28，29］}。本研究发现非脱羧勒克氏菌可以降解纤维素，与Adams等^［30］的研究结果相同。沙雷氏菌属细菌具有较高的产酶活性，因此具有较强的生物降解能力^［31］。本研究共筛选出蛋白质降解菌15株11种，其中，粘质沙雷氏菌的蛋白质降解能力最强。张利等^［32］发现粘质沙雷氏菌可以产蛋白酶，蛋白酶可以催化蛋白质水解，帮助宿主提高蛋白质消化利用率。本研究结果与德国小蠊和番茄潜叶蛾肠道中粘质沙雷氏菌能够分解利用蛋白质的研究结果一致^{［33，34］}。江宇航等^［35］在马尾松毛幼虫肠道中发现芽胞杆菌属细菌能产生蛋白酶，其中主要是地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌表现出较强的蛋白质降解作用。此外，本研究发现假格里尼翁布鲁氏菌和腐生葡萄球菌也可以分解利用蛋白质。降解蛋白质的菌株是最多的，而一点缀螟主要以成熟的玉米雌穗为食，推测这种现象与一点缀螟的食性有关。

植物次生代谢物质是许多植物抵抗草食性昆虫的关键物质，玉米籽粒对抗昆虫取食的防御化学物质主要为酚酸类物质^{［15，36］}，酚酸降解菌主要是从土壤和植物自身分离^［37］。然而，关于昆虫肠道微生物降解酚酸类物质的情况知之甚少，本研究从19株一点缀螟肠道可培养细菌中筛选出17株酚酸降解菌，表明一点缀螟肠道细菌可以很好地帮助宿主应对玉米雌穗的防御化学物质。其中，蜡样芽胞杆菌和枯草芽孢杆菌同时能降解阿魏酸、香草醛和对羟基苯甲酸，且降解作用最为显著。夏青等^［38］只对枯草芽胞杆菌对土壤酚酸的降解作用及应用进行了研究，蜡样芽胞杆菌和对酚酸的降解作用还未见报道，两种菌是怎样协助一点缀螟适应酚酸的还需进一步研究。这些细菌在一点缀螟肠道中的生理作用可能与其他植食性昆虫肠道共生细菌的生理作用相同，但值得注意的是，目前的工作还不够，深入的研究应集中于测试体内的生理作用及菌株外的环境测试，并阐明这些细菌在代谢降解这些物质中的代谢途径。

从一点缀螟肠道中分离到能降解淀粉、纤维素和蛋白质的细菌分别有7种、9种和11种，其中枯草芽胞杆菌的淀粉降解能力最强，粘质沙雷氏菌的蛋白质降解能力最强，苏云金芽胞杆菌的纤维素降解能力最强；能降解阿魏酸、香草醛和对羟基苯甲酸的细菌分别有9种、12种和12种，其中枯草芽胞杆菌的阿魏酸降解能力最强，假格里尼翁布鲁氏菌的香草醛降解能力最强，腐生葡萄球菌、平流层芽孢杆菌、粘质沙雷氏菌、蜡样芽胞杆菌和假格里尼翁布鲁氏菌可完全降解对羟基苯甲酸，具有降解功能的细菌占可培养细菌的94.74%，肠道细菌在一点缀螟吸收利用玉米雌穗中的营养物质和抵御防御化学物质发挥了重要功能。

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基金资助

云南省科技计划基础研究专项(202401AS070089)

云南省教育厅科学研究基金项目(2023Y1045)