基于SSR和ISSR标记的鱼腥草遗传多样性分析

Genetic diversity analysis of Houttuynia cordata Thunb. based on SSR and ISSR markers

摘要

鱼腥草作为一种重要的药食同源植物，其种质资源丰富，但近五年来关于其遗传多样性的系统性研究较为匮乏，尤其是利用SSR分子标记的研究相对不足，这限制了鱼腥草品种改良和资源保护工作的进展。为解决这一问题，采用SSR和ISSR两种分子标记，对中国8个省级行政区10个地理居群的140份鱼腥草样本进行遗传多样性分析。结果显示，SSR标记的多态性位点比例为94.20%，ISSR标记为93.20%，表明鱼腥草具有较高的遗传多样性。遗传分化与基因流表明，鱼腥草的遗传变异主要存在于居群间，遗传分化系数分别为0.950 8和0.890 3，基因流较低，表明地理隔离可能是导致遗传分化的主要原因。聚类分析和主成分分析结果显示，部分居群（如四川绵阳和成都、广东茂名和贵州六枝）表现出较近的遗传距离，而其他居群的遗传距离与地理位置的关联性不明显。研究结果为鱼腥草的种质资源保护、育种提供了参考。

Abstract

Houttuynia cordata is an important medicinal and edible plant with abundant germplasm resources. How‍ever， systematic studies on its genetic diversity have been relatively scarce in the past five years， particularly those utiliz‍ing SSR molecular markers， which has hindered progress in variety improvement and resource conservation. To address this issue， this study employed both SSR and ISSR markers to analyze the genetic diversity of 140 H. cordata samples collected from 10 geographic populations across eight provincial-level administrative regions in China. The results revealed a high proportion of polymorphic loci， with SSR and ISSR markers showing rates of 94.20% and 93.20%， respectively， indicating high genetic diversity in H. cordata. Genetic differentiation and gene flow analysis demonstrated that the majority of genetic variation existed among populations， with genetic differentiation coefficients （GST） of 0.9508 （SSR） and 0.8903 （ISSR） and low number of migrants （Nm）， suggesting that geographic isolation may be the primary driver of population differentiation. Cluster analysis and principal component analysis （PCA） further revealed close genetic relationships between certain populations （e.g.， Mianyang and Chengdu in Sichuan； Maoming in Guangdong and Liuzhi in Guizhou）， while the genetic distances of other populations showed no obvious correlation with geographic distribution. These findings provide valuable insights for the conservation and breeding of H. cordata germplasm resourc‍es.

Graphical abstract

关键词

鱼腥草 / 简单序列重复 / 简单重复序列间区 / 遗传多样性

Key words

Houttuynia cordata / simple sequence repeats （SSR） / inter-simple sequence repeat （ISSR） / genetic diversity

0 引 言

蕺菜（Houttuynia. cordata Thunb.）俗称鱼腥草、侧耳根等，属双子叶植物三白草科（Saururaceae）蕺菜属（Houttuynia）腥臭草本，喜阴凉潮湿，在山野、田间及水沟都可见其生长，广泛分布于中国中部、东南及西南地区^［1］。鱼腥草作为中草药有悠久的历史，在《本草纲目》《名医别录》等中药著作中均有记载：味辛，性微寒，有小毒；可清热解毒，利尿消肿，治肺炎，肺脓疡等^［2］。在现代研究中，人们发现鱼腥草还具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗辐射、增强免疫功能等作用^［3］。在《中华人民共和国药典》（2020版）中有近20种以鱼腥草作为主要成分的中药制剂^［4］，甚至被称为“天然第一抗生素”^［5］。中国食用鱼腥草的历史最早可追溯到春秋战国时期，在《吴越春秋》记载，曰：“越王从尝粪恶之后，遂病口臭，范蠡乃令左右皆食岑草，以乱其气。”南北朝诗人谢灵运《山居赋》记载：“畦町所艺，含蕊藉芳，蓼蕺葼荠，葑菲苏姜。”可见当时已有地区将鱼腥草作为一种时蔬食用^［6］。

2021年11月10日，在国家卫生健康委发布“关于印发《按照传统既是食品又是中药材的物质目录管理规定》的通知”中，鱼腥草作为一种药食同源植物，包含在既是食品又是药品的中药名单中^［7］。湖北省当阳市被誉为“中国鱼腥草之乡”，其种植面积达到2.5万亩、年产量约13万吨，年产值超过5亿元^［8⁃9］。近年来，贵州省遵义市鱼腥草种植面积达到1.4万亩，每亩经济效益约为9千到1.2万元^［10］。在广西壮族自治区全州县，通过与制药公司合作，来加快当地鱼腥草产业的发展，目前全村集体收入共计10万元^［11］。然而目前鱼腥草栽培以地方农家品种为主，关于鱼腥草种质资源的基础研究较为滞后，阻碍了鱼腥草品种的选育。

DNA分子标记是一种基于DNA序列遗传变异的技术，将生物体内遗传物质的差异（DNA长度、序列差异）作为一种用于检测的标记，从而实现对种质资源的鉴定或育种^［12］。该技术的发展历程可追溯至20世纪80年代，随着分子生物学领域的突破性进展，分子标记技术经历了从简单到复杂、从低效到高效的显著演变。其中，简单序列重复（simple sequence repeats，SSR）是一种由1~6个核苷酸组成的短串联重复序列，由于不同物种基因组中重复单元数量的变化，使其具有高度多态性，目前常用于遗传图谱的构建、亲缘关系及遗传多样性分析等^［13］。简单重复序列间区（inter-simple sequence repeat，ISSR）是一种基于微卫星的分子标记技术，其引物设计无需基因组序列信息，因其操作方便、多态性好、重复性好的优点，目前也常被用于种质资源鉴定、遗传图谱的构建及遗传多样性分析等领域^［14］。

因此，本研究利用SSR与ISSR分子标记，解析不同省份的鱼腥草种质资源群体内及群体间的遗传关联及亲缘关系，为鱼腥草种质资源育种栽培、品种鉴别及保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究样本涵盖中国8个省级行政区（包括云南、四川、贵州等主产区）的10个地理居群。采样点覆盖中国东、中、西部三大地理区域，所选居群分布于平原、丘陵、山地等多种地形单元，以确保样本具有广泛的地理及生态代表性；同时优先选择鱼腥草传统种植区（如四川和贵州地区）以及具有地方特色的栽培品种（如湖北当阳“长坂坡1号”）。采用系统抽样，以3 m为最小采样间距设置采样点，降低采集到克隆样本的概率，每个地理居群按14份个体样本（n=14）进行采集，共获取140份鱼腥草试验材料（表1），将其新鲜叶片装于硅胶中干燥，贴好标签，记录备用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

利用天根生化科技（北京）有限公司植物基因组提取试剂盒（DP305-03）对充分干燥的鱼腥草叶片进行DNA提取，提取步骤按说明书进行。将提取所得的DNA溶液利用1%的琼脂糖凝胶电泳（JY-CX2B型测序电泳槽及JY-300C型通用电泳仪电源，北京君意东方电泳设备有限公司）检验质量，同时通过分光光度计（NanoDrop 2000）检测DNA的质量和浓度。检验合格的DNA溶液存放在-20 ℃的冰箱中备用。

1.2.2 SSR分子标记扩增

根据实验室对长坂坡1号鱼腥草测序结果进行分析，以Krait 1.5^［15］设计SSR引物，引物由奥科生物科技（武汉）有限公司合成。随机挑选50对引物，最终筛选出6对具备良好重复性且条带清晰的SSR引物（详见表2），以供后续分析使用。PCR扩增使用的2×TSINGKE Master Mix购于北京擎科生物科技股份有限公司。PCR反应（A200，杭州朗基科学仪器有限公）在10 μL反应体系中进行，包括：模板DNA1.5 μL （20 ng/μL），正向引物0.5 μL （10 mmol/L），反向引物0.5 μL （10 mmol/L），2×TSINGKE Master Mix 5.0 μL，ddH₂O 2.5 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52~60 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共循环36次，然后72 ℃后延伸10 min，最后在4 ℃下保温。将PCR产物用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（JY-CX2B型测序电泳槽及JY-300E型通用电泳仪电源，北京君意东方电泳设备有限公司）进行分离，采用银染法染色。

针对SSR扩增片段展开统计工作，当存在条带时，将其标记为“1”；而当不存在条带时，便标记为“0”。将这些标记加以整理，构建出二元矩阵（1/0）。此二元矩阵中一共包含了69个条带（表2），后续将利用二元矩阵开展数据分析工作。

1.2.3 ISSR分子标记扩增

选用哥伦比亚大学（University of British Columbia Biotechnolgy，UBC）设计的100条ISSR引物进行PCR扩增，引物由奥科生物科技（武汉）有限公司合成，最终筛选出7条具备良好重复性且条带清晰的ISSR引物（详见表3），以供后续分析使用。PCR扩增使用的2×TSINGKE Master Mix购于北京擎科生物科技股份有限公司。PCR反应（A200，杭州朗基科学仪器有限公司）在10 μL反应体系中进行，包括：模板DNA 1.5 μL（20 ng/μL），ISSR引物 1.0 μL（10 mmol/L），2×TSINGKE Master Mix 5.0 μL，ddH₂O 2.5 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，46~50 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共循环36次，然后72 ℃后延伸10 min，最后4 ℃下保温。将PCR产物用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（JY-CX2B型测序电泳槽及JY-300E型通用电泳仪电源，北京君意东方电泳设备有限公司）进行分离，采用银染法染色。

针对ISSR扩增片段进行统计，当存在条带时，将其标记为“1”；不存在条带时，标记为“0”。将这些标记加以整理，从而构建出二元矩阵（0/1）。此二元矩阵中一共包含了103个条带（表3），后续将利用二元矩阵开展数据分析工作。

1.2.4 数据分析

将0/1矩阵转化为文本格式后，使用POPGENE 1.32和Excel 2021进行遗传多样性分析，包括多态性位点比例（proportion of polymorphic loci，PPL）是衡量群体遗传多样性的基础指标之一，其计算公式为：

\mathrm{P}\mathrm{P}\mathrm{L}=\frac{n_p}{n}（1）

式中，n为所检测的位点总数；n_p 为其中呈现多态性的位点数。该指标通过量化多态位点的相对丰度反映遗传多样性水平，PPL值域范围与遗传多样性呈正相关关系。

观测等位基因数（observed number of alleles，N_a ），通过计算群体内各基因座等位基因数的算术均值来表征等位基因多样性（allelic diversity，\overline{N}_a），其计算公式为：

N_a=\frac{\mathrm{1}}{n}\underset{i=\mathrm{1}}{{\displaystyle \sum _{}^n}}{a}_i（2）

式中，a_i 代表第i个位点的等位基因数。当\overline{N}_a的值越大，表明群体内各基因座可检测的等位基因数量增加，进而显示更高的遗传多样性水平。

有效等位基因数（effective number of alleles，N_e ），通过修正频率偏差提供了更精确的遗传多样性评估，其计算基于群体纯合度的倒数原理，其计算公式为：

N_e=\frac{\mathrm{1}}{\frac{\mathrm{1}}{n}\underset{}{{\displaystyle \sum _{i=\mathrm{1}}^n}}\underset{}{{\displaystyle \sum _{j=\mathrm{1}}^{a_i}}{P}_{ij}^{}}}（3）

式中，P_ij 表示第i个等位基因的频率。N_e 的值趋近\overline{N}_a时，意味着各等位基因频率越接近，说明该群体具有更高的遗传多样性水平。

Nei氏遗传多样性指数（Nei’s gene diversity index，H），通过等位基因频率的平方和计算遗传变异程度其计算公式为：

H=\mathrm{1}-\underset{}{{\displaystyle \sum _{i=\mathrm{1}}^n}{P}_i^{\mathrm{2}}}（4）

式中，P_i 表示特定等位基因的频率；n为群体中基因座的总数。该指标的取值范围在0到1之间，数值越大表明其遗传多样性水平越高。

香农多样性指数（Shannon’s information index，I）基于信息熵理论构建，适用于显性标记数据的遗传多样性评估，其计算公式为：

I=-\underset{}{{\displaystyle \sum _{i=\mathrm{1}}^r}{p}_i\mathrm{l}\mathrm{n}{p}_i}（5）

式中，r表示群体中所有基因座的总等位基因数，当各等位基因频率均等时（即p_i=\frac{\mathrm{1}}{r}），此时I有最大值I_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}=-\mathrm{l}\mathrm{n}\frac{\mathrm{1}}{r}。I越大，其遗传多样性越高。

后续再评估群体遗传分化程度时，计算群体间遗传分化指数（fixation index，F_ST），当物种存在具有基因交流的亚群体时，基于单一位点双等位基因模型，定义q_{k(i)}为第k个亚群体中第i个等位基因的实际频率（i=1，2），{\omega }_k为各亚群体在总群体中的权重系数（\sum {\omega }_k=\mathrm{1}），则总群的等位基因频率均值可表达为：

{\overline{q}}_i={\displaystyle \sum _{k=\mathrm{1}}^s}{\omega }_k{q}_{k(i)}^{\mathrm{2}}（6）

在此基础上，分别构建亚群体内杂合度期望值（H_S）与总群体杂合度期望值（H_T）：

H_{\mathrm{S}}=\mathrm{1}-{\displaystyle \sum _{i=\mathrm{1}}^{\mathrm{2}}}{\displaystyle \sum _{K=\mathrm{1}}^S}{\omega }_k{q}_{k(i)}^{\mathrm{2}},H_{\mathrm{T}}=\mathrm{1}-{\displaystyle \sum _{i=\mathrm{1}}^{\mathrm{2}}}{\overline{q}}_i^{\mathrm{2}}（7）

遗传分化指数F_ST通过量化群体结构对杂合度的影响来表征遗传分化强度，其公式为：

F_{\mathrm{S}\mathrm{T}}=\frac{H_{\mathrm{T}}-H_{\mathrm{S}}}{H_{\mathrm{T}}}（8）

当F_ST趋近于0时，表明亚群体间遗传同质化程度高（H_S≈H_T），当F_ST趋近于1时，则反映亚群体间存在显著的遗传隔离。

遗传分化系数（differentiation index，G_ST），假设某物种存在s个亚群体，目标基因座具有r个等位基因，定义qki为第k个亚群体中第i个等位基因的实际频率（k=1，2，…，s；i=1，2，…，r），表示各亚群体权重（\sum {\omega }_k=\mathrm{1}）。基于此，亚群体内杂合度期望值（H_S）与总群体杂合度期望值（H_T）可分别表示为：

H_{\mathrm{S}}=\mathrm{1}-{\displaystyle \sum _{k=\mathrm{1}}^s}{\omega }_K\left({\displaystyle \sum _{i=\mathrm{1}}^r}{q}_{k(i)}^{\mathrm{2}}\right)（9）

H_{\mathrm{T}}=\mathrm{1}-{\displaystyle \sum _{i=\mathrm{1}}^r}{\left({\displaystyle \sum _{k=\mathrm{1}}^s}{\omega }_k{q}_{k(i)}\right)}^{\mathrm{2}}=H_{\mathrm{S}}+D_{\mathrm{S}\mathrm{T}}（10）

式中，D_ST表示亚群体间遗传变异对总变异的贡献度。遗传分化系数为：

G_{\mathrm{S}\mathrm{T}}=\frac{D_{\mathrm{S}\mathrm{T}}}{H_{\mathrm{T}}};H_{\mathrm{T}}=H_{\mathrm{S}}+D_{\mathrm{S}\mathrm{T}}（11）

G_ST和F_ST具有同源性，当r=2时，G_ST=F_ST，其值在0到1之间，其值越接近1，则群体间分化程度越大。

基于岛屿模型（island model）的基因流估算方法，揭示了群体间遗传交换与遗传分化间的定量关系。群体间基因流（number of migrants，N_m）是为不同群体间每世代迁移个体的有效数量，其经典估算公式可表示为：

N_{\mathrm{m}}=\frac{\mathrm{1}-F_{\mathrm{S}\mathrm{T}}}{\mathrm{4}{F}_{\mathrm{S}\mathrm{T}}}（12）

该公式的核心为假设无限等位基因模型与对称迁移模型。而针对复等位基因系统，引入遗传分化系数（G_ST）推导出修正公式：

N_{\mathrm{m}}=\frac{\mathrm{1}-G_{\mathrm{S}\mathrm{T}}}{\mathrm{2}{G}_{\mathrm{S}\mathrm{T}}}（13）

遗传漂流（genetic drift）与基因流的拮抗效应是岛屿模型的核心预测。当N_m=1时，迁移产生的基因交换强度恰好可平衡遗传漂流引起的群体分化。因此N_m=1被当做确立基因流强度的分类基准，若N_m>1，表明群体间存在足以维持遗传同质化的强基因流；反之，若N_m<1，则预示遗传漂流主导亚群体分化进程。

评估遗传分化程度^{［16⁃18］}。采用GenAlEx 6.5计算样本间Nei氏遗传距离，利用分子方差分析量化居群间、个体间及个体内的遗传变异比例，并获取分化系数等参数，并对所有样本进行主成分分析（PCA）^［19］。使用MEGA X软件的非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）进行聚类分析，通过iTOL 7.1在线平台对聚类结果进行可视化处理和注释优化^{［20⁃21］}。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性分析

本试验采用SSR与ISSR分子标记，对10个居群共计140份样品进行基因分型，从扩增产物中选择条带清晰且重复性好的位点进行统计，分别得到69个与103个条带（图1和图2）。所有引物的多态性条带百分率在85%~100%。SSR引物的平均条带数为11.50，平均多态性条带数为11.50，平均多态性条带百分率为100.00%（表2）；ISSR引物的平均条带数是14.71，平均多态性条带数为14.14，平均多态性条带百分率为95.00%（表3）。

将位点信息导入POPGENE 1.32中进行遗传多样性分析，其中利用SSR分子标记所获得的结果中，PPL为94.20%，N_a 为1.942 0±0.235 4，N_e 为1.626 9±0.335 9，H为0.354 6±0.153 6，I为0.522 4±0.197 2；其中利用ISSR分子标记所获得的结果中，PPL为93.20%，N_a 为1.932 0±0.252 9，N_e 为1.633 6±0.318 2，H为0.359 8±0.148 3，I为0.528 4±0.194 9；将SSR与ISSR两组数据整合，进行遗传多样性分析，其结果为：PPL为93.60%，N_a 为1.936 0±0.245 4，N_e 为1.630 9±0.324 5，H为0.357 7±0.150 0，I为0.526 0±0.195 2（表4）。H和I是研究种质资源遗传多样性中重要的参考指标^［22］。结果表明，供试的鱼腥草具有较丰富的遗传多样性。

2.2 遗传分化与基因流

对供试的10个居群鱼腥草之间的分化程度进行分析，SSR分子标记的结果表明，在所有居群间，H_T为0.354 6±0.023 6，H_S为0.017 4±0.000 6，G_ST为0.950 8，N_m为0.025 9；ISSR分子标记的结果表明，在所有居群间，H_T为0.359 8±0.022 0，H_S为0.039 5±0.002 1，G_ST为0.890 3，N_m为0.061 6；将SSR与ISSR两组数据整合，所得结果表明，在所有居群间，H_T为0.357 7±0.022 5，H_S为0.030 6±0.001 6，G_ST为0.914 4，N_m为0.046 8（表5）。方差分析表明，无论使用哪种分子标记，供试鱼腥草的遗传变异主要存在于居群间，在不同分子标记中，其分别占总变异的93%、89%和92%（表6）。遗传分化结果表明，供试鱼腥草具有较高的遗传分化但基因流较低，这可能是不同居群的地理隔离所导致的，而方差分析进一步验证了这一猜想。

2.3 聚类分析

基于Nei氏遗传距离构建的UPGMA聚类树（图3），不同分子标记所构建的聚类树也并不一致，但从中也能发现一个共同点，不论哪种分子标记分析，MY（四川绵阳）和CD（四川成都）、MM（广东茂名）和LZ（贵州六枝）、CZ（江苏常州）和GH（四川广汉），每组都可聚类在一起，而DY（湖北当阳）、HS（安徽黄山）、TN（福建泰宁）、JY（广东揭阳）每次聚类结果都有所不同。

基于Nei氏遗传距离的PCoA分析（图4），虽然结果并不相同，但大体上每个居群基本都可以较好地聚在一起，同时MY（四川绵阳）和CD（四川成都）、MM（广东茂名）和LZ（贵州六枝）、CZ（江苏常州）和GH（四川广汉）3组展示出的结果与UPGMA聚类树类似，都是成组聚集在一起。综合以上结果，尽管MY（四川绵阳）和CD（四川成都）、MM（广东茂名）和LZ（贵州六枝）两组表明鱼腥草居群间遗传距离越近，其地理位置也越近，而CZ（江苏常州）和GH（四川广汉）尽管地理距离较远，但却聚为一组，推测可能是两地通过人工引种或商业流通共享了相同的种质资源，导致遗传相似性高。

3 讨 论

分子标记技术主要基于DNA序列的遗传变异特征，通过检测生物体内遗传物质的差异（如DNA长度、序列多态性）建立可识别标记，为种质资源鉴定、指纹图谱构建及辅助育种提供技术手段^{［23，24］}。SSR分子标记属于共显性标记，其扩增产物通常具有较高分辨率，并能提供丰富的遗传信息，但其应用依赖于已知SSR位点的序列信息，需预先开发特异性引物；相比之下，ISSR分子标记作为显性标记，具有操作便捷、成本较低的优势，其通用引物在一定程度上可跨物种使用，但重复性易受实验条件影响^［25］。本研究采用SSR与ISSR两种分子标记对全国10个鱼腥草居群进行遗传多样性分析，结果显示：SSR标记多态性位点比例达94.20%，多态性条带检出率为100.00%；ISSR标记多态性位点比例为93.20%，多态性条带百分率为95.00%，表明SSR标记对于鱼腥草具有更多的多态性。这一研究结果与苜蓿、大豆及白扁豆中的研究结果一致。有研究采用ISSR和SSR分子标记对30份苜蓿材料进行遗传多样性分析，发现SSR标记的遗传多样性指数普遍高于ISSR标记，SSR标记可能在苜蓿多态性检测中具有更高灵敏度^［26］。类似地，另一项研究利用大豆SSR和ISSR标记对64份豆类材料进行分析，数据显示，SSR标记对崇明白扁豆亲缘关系显示出更强的区分能力^［27］。此外在印度番荔枝研究中，其SSR标记多态性条带百分率（83.72%）显著高于ISSR标记（75.43%）^［28］。然而，在其他部分物种中，ISSR的多态性要高于SSR。例如，杂交野大麦新品系中ISSR标记在该物种中检测到更高的多态性水平^［29］。对菜豆的遗传多样性分析显示，SSR与ISSR标记的多态性比率分别为75%和82.1%，ISSR标记可能更适用于该物种的多态性检测^［30］。值得注意的是，在叙利亚桑属植物研究中发现，ISSR标记检测到的多态性（90.31%）显著超过SSR标记（68.05%）^［31］。这些差异可能源于物种间基因组特性的不同。由于SSR分布密度、重复单元类型及侧翼序列保守性在不同物种中存在显著变异，对于富含高度变异微卫星位点的物种，SSR标记更易捕获多态性信号；反之，当基因组重复间隔区（ISSR靶向区域）呈现较大变异时，ISSR标记可能更具技术优势。与已有研究相比，SSR标记在鱼腥草中展现出更优的多态性检测能力，而ISSR标记的通用性优势为大规模资源初筛提供了成本效益方案。

目前也有许多研究利用分子标记对鱼腥草遗传多样性进行分析，揭示了其种质资源在分子水平上的丰富变异及其与地理分布存在一定的关联。有研究采用RAPD分子标记对来自中国11省市共24份鱼腥草种质资源样本进行了分析，并结合了形态学特征的考察，发现遗传差异与表型特征之间存在联系^［32］。另一项研究利用ISSR分子标记对来自四川、重庆、贵州、江苏等地的共70份鱼腥草进行遗传多样性分析，发现这些鱼腥草种质资源均表现出较高的多态性，尤其是在接近盆地周边和边缘地区的样本中，遗传多样性表现得更为丰富，并推测这些类别可能与染色体的数量存在相关性^［33］。此外，针对湖南、四川、云南等等地的17份鱼腥草进行ISSR分析显示，样本的聚类与其地理分布存在一定的相关性^［34］。进一步研究利用AFLP和ISSR分子标记技术对中国13个省市的鱼腥草种质资源进行研究，结果表明所采集的鱼腥草种质资源具有较高的遗传多样性，通过聚类分析，大部分样本的遗传特征与其地理分布相符，但也有少数样本的遗传特性较为分散，难以归入特定类别^{［35⁃36］}。此外，对全国12个省份的鱼腥草样本进行SRAP分子标记分析发现，居群间的遗传相似性与地理位置密切相关，地理相近的居群在聚类分析中倾向于归为一类^［37］。在印度东北部的鱼腥草种质资源的ISSR分子标记分析中，发现所收集的材料可划分为4个大类，且居群间的遗传变异显著大于居群内的遗传变异^［38］。本研究发现，鱼腥草居群间遗传分化显著，而基因流较低，表明不同地理居群的鱼腥草可能已形成了独特的遗传特性。例如四川绵阳与成都、广东茂名与贵州六枝表现出较近的遗传距离，而江苏常州与四川广汉虽地理距离较远却聚为一组。后续研究中可以选择高遗传多样性居群（如四川绵阳、成都等地）进一步分析其个体的品质指标，挖掘优势基因，为培育具有抗病、高产或特定药用成分的新品种提供育种材料；同时针对不同地理环境，选择适应性强的居群进行定向培育，可提高鱼腥草在不同生态区的种植成功率。

本研究通过SSR和ISSR标记成功区分了不同地理居群的鱼腥草。因此，可以利用SSR和ISSR引物，建立鱼腥草品种的DNA指纹图谱，为品种鉴定和知识产权保护提供技术手段，并且通过遗传标记明确不同产区鱼腥草的遗传特征，来推动地理标志产品的认证和保护，从而提升市场竞争力。在种质资源保护方面，鱼腥草遗传多样性主要集中在居群间，且基因流较低，表明其遗传资源易受地理隔离影响而丧失。因此，可以对遗传多样性丰富的地区建立自然保护区或种质资源圃，保护其原生境，收集不同地理居群的种质资源，建立基因库，避免因环境变化或人为活动导致的遗传资源流失，并定期开展遗传多样性监测，评估保护措施的有效性，及时调整保护策略。

本研究受限于样本规模（10个居群），小样本可能导致稀有等位基因漏检，影响遗传结构解析的全面性；并且未量化群体分化指数与环境因子的互作效应，限制了对多样性维持机制的深入探讨。未来研究需进一步扩大样本量并记录周围生态环境情况，从而探寻鱼腥草遗传与环境之间的规律；整合多组学技术（如GBS-SNP、表观基因组）构建多维遗传信息网络，阐明多样性形成的分子基础，为鱼腥草资源的保护和开发提供参考。

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基金资助

武汉轻工大学人才引进科研启动基金(2021RZ099)