一株高效产IAA枳壳内生真菌菌株的筛选鉴定及其促生作用

Screening and identification of an efficient endophytic fungal strain producing IAA in Citrus aurantium and its growth-promoting effect

摘要

植物内生真菌功能活性菌株对植物有促生作用，以35株前期从枳壳中分离得到的内生真菌为研究对象，通过Salkowski显色法筛选具备产吲哚-3-乙酸（IAA）能力的功能活性菌株。结合形态学特征观察和rDNA ITS序列分析对筛选出的目标菌株进行分类学鉴定，并通过回接实验和盆栽试验验证其促生效果。结果显示：从35株枳壳内生真菌中成功筛选出1株高效产吲哚乙酸（IAA）的功能活性菌株（编号：ZYY007）。经形态学观察并结合分子生物学鉴定，该菌株为层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）；通过正交试验设计对ZYY007菌株的发酵条件进行优化，确定其产IAA的最佳培养参数为：接种量6块菌块（直径7 mm）、发酵温度为24 ℃、摇床转速为180 r/min。此条件下，发酵液中IAA产量可达48.079 μg/mL；促生效应研究显示，ZYY007菌株发酵液在中低浓度条件下能显著提高小麦种子发芽率，促进胚根和胚芽的生长发育。盆栽试验进一步证实，该菌剂处理可显著提高小麦幼苗的株高、干重和叶绿素含量。本研究为开发新型微生物菌剂在农业生产中的应用提供了理论依据和优质菌种资源。

Abstract

To explore the growth-promoting effects of functional endophytic fungal strains on plants， 35 endophytic fungi strains previously isolated from Citrus aurantium L. were tested by Salkowski colorimetric method to screen for strains capable of producing indole-3-acetic acid （IAA）. Morphological characteristics and rDNA ITS sequence analysis were combined to taxonomically identify the target strains. Inoculation and pot experiments were conducted to verify their growth-promoting effects. The results showed that one functional strain （ZYY007） with high-efficiency IAA production was successfully screened from the 35 endophytic fungi. Morphological and molecular identification confirmed that this strain belonged to Fusarium proliferatum. Orthogonal experimental design was used to optimize the fermentation conditions for strain ZYY007. The optimal parameters for IAA production were determined as follows： inoculum size of 7 fungal blocks （diameter 7 mm）， fermentation temperature of 24 °C， and shaking speed of 180 r/min. Under these conditions， the IAA yield in the fermentation broth reached 48.079 μg/mL； Growth-promoting assays showed that the fermentation broth of strain ZYY007 at medium and low concentrations significantly enhanced wheat seed germination rate and promoted the growth of radicles and plumules. Pot experiments further confirmed that treatment with this microbial agent significantly increased plant height， dry weight， and chlorophyll content of wheat seedlings. This study provides a theoretical basis and high-quality microbial resources for the development of novel microbial agents in agricultural production.

Graphical abstract

关键词

枳壳 / 内生真菌 / 吲哚-3-乙酸 / 促生作用

Key words

Citrus aurantium L. / endophytic fungi / indole-3-acetic acid / growth-promoting effect

0 引 言

植物内生真菌（endophytic fungi）作为植物微生态系统的重要组成部分，其与宿主植物建立了复杂的互惠共生关系^［1］。研究表明，内生真菌不仅能够参与植物的生长调控，还能显著提升宿主植物的抗病能力，在植物的整个生命周期中发挥着至关重要的作用^［1］。近年来，植物内生真菌对植物代谢产物的形成与积累已成为当前植物学与微生物学交叉领域的研究热点。

吲哚-3-乙酸（IAA）作为植物体内广泛存在的一种内源生长素，在植物生长发育进程中扮演着核心角色。通过激活多元信号传导通路，IAA 能够精准调控植物细胞的生长、分化与分裂，从细胞层面到组织器官层面，全方位驱动植物的生长发育进程。近年来，围绕植物内生真菌产活性物质对植物生长促进作用的研究不断深入，众多学者聚焦于内生真菌产IAA能力的挖掘^［2⁃5］。研究发现，从杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）叶、侧柏〔Platycladus orientalis（L.） Franco〕、金线莲〔Anoectochilus roxburghii （Wall.） Lindl.〕茎中分离筛选得到具有产IAA活性的内生真菌菌株^［6-7］；从野生山药组织分离并筛选出的内生真菌具有产生长激素吲哚乙酸的功效，其对瑞昌山药无菌苗的鲜重、新生根数、根冠比和叶绿素含量均具有显著影响^［8］；此外，以小麦为研究对象的相关实验表明，其内生真菌的发酵菌丝及孢子混悬液对小麦幼苗表现出强大的促生长作用^［9-12］。这些研究成果充分揭示了植物内生真菌产IAA的潜力与价值，基于此开发微生物菌肥，在生态农业和绿色种植领域的应用前景十分广阔。

枳壳（Citrus aurantium L.）作为芸香科植物酸橙及其栽培种黄皮酸橙、代代花、朱栾、塘橙等的干燥未成熟果实，不仅是江西省声名远扬的道地中药材，更是中医药宝库中的重要成员^［13］。其富含黄酮类、生物碱类、挥发油类及香豆素类等多元有效成分，在中医临床应用中，凭借理气宽中、行滞消胀的显著功效，成为诸多经典方剂的关键中药饮片^［14］。近年来，围绕江西中医药产业高质量发展目标，众多学者从多个维度对枳壳展开深入研究，涵盖良种繁育体系优化、标准化种植工艺创新、产地特性解析以及有效组分与药效机制探索等领域^［15-18］。然而，在枳壳研究中，关于其内生真菌次生代谢产物对农作物促生作用的相关研究鲜见报道。因此，系统开展枳壳内生真菌资源的挖掘与研究非常必要。

本文以前期分离纯化的枳壳内生真菌菌株为研究对象，首先采用Salkowski显色法筛选产IAA活性物质的功能菌株，其次通过形态学观察结合ITS基因序列分析进行菌种鉴定，进而优化其产IAA的培养条件，并探究该菌株对小麦种子萌发及幼苗生长的促生效应。本研究旨在筛选枳壳产IAA内生真菌菌株并探究其促生活性，为丰富产IAA微生物资源库及开发新型微生物菌肥提供理论依据与菌株资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试培养基

固体马铃薯葡萄糖培养基（PDA），King液体培养基（1000 mL水，20 g蛋白胨，10 mL甘油，1.5 g K₂HPO₄，1.5 g硫酸镁）^［6］。

1.1.2 试验菌株和种子

35株枳壳内生真菌：九江市真菌资源保育及应用重点实验室提供。小麦（Triticum aestivum）种子（镇麦12号）购于九江市种子公司。

1.2 试验方法

1.2.1 产IAA内生真菌菌株的筛选

（1）枳壳内生真菌产吲哚乙酸（IAA）功能活性菌株的初筛。用分析纯的3-吲哚乙酸（3-IAA）配制梯度系列标准溶液，称取10 mg IAA标准样品，加少量无水乙醇溶解，加入100 mL蒸馏水稀释，得到100 μg/mL标准IAA溶液。采用逐级稀释法得到0、1.0、5.0、10.0、20.0、25.0 μg/mL浓度的标准溶液。采用Salkowski显色法，在530 nm波长下的光吸收值，构建标准曲线获得回归方程为y=0.038 2x-0.006 6（R²=0.9967）。

采用Salkowski显色法，将活化处理后的菌株接种至King液态培养基进行发酵培养后，分别吸取各菌株发酵液，离心，上清10 mL置于白色陶瓷比色板上，取上清液与FeCl₃显色剂等体积混合。以无菌水、50 μg/mL的IAA标准品为对照组，通过与标准品显色程度比对（显色强度与IAA浓度正相关），初步鉴定具备产IAA的菌株。

（2）枳壳内生真菌产IAA功能活性菌株的复筛。初步筛选出具有产IAA能力的菌株后，选取经活化的菌饼4块（直径为7 mm）接入容量150 mL锥形瓶中（50 mL King培养液），于25 ℃、150 r/min下振荡培养4 d，依照标准曲线检测流程定量分析发酵液中IAA的含量，筛选出高效产IAA枳壳内生真菌的菌株。

1.2.2 产IAA菌株鉴定

依据菌落形态特征、菌丝、产孢结构及孢子形态特征，对筛选出高效产IAA枳壳内生真菌菌株进行形态学初步鉴定。

分子生物学鉴定： ①菌株DNA提取：分子生物学鉴定将筛选出的菌株培养5 d后，用真菌基因组DNA提取试剂盒提取真菌DNA；②ITS区域扩增：使用特异性引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）与ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳验证后，采用核酸纯化试剂盒精制产物，最终委托上海生物工程有限公司完成双向测序；③系统发育分析：将获得的ITS序列提交至NCBIGenBank数据库，通过BLASTn工具进行同源序列检索，获取高相似度的模式菌株参考序列。运用ClustalW进行多序列比对后，基于MEGA11.0软件的邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。

1.2.3 菌株产IAA发酵条件的优化

分别考察发酵时间（2、3、4、5、6、7 d）、培养温度（23、24、25、26、27、28 ℃）、摇床转速（130、140、150、160、170、180 r/min）、接种量［3、4、5、6、7、8块菌块（直径为7 mm）］、装液量（40、50、60、70、80、90 mL）等因素对菌株产IAA含量的影响。上述每个因素水平在150 mL三角瓶中加入50 mL King液体培养基，接4块菌块，于25 ℃、150 r/min 条件下培养4 d，每个因素水平均设3次重复。发酵后按照（1）节的方法加相应的试剂测定发酵液中IAA含量，确定最优发酵时间、培养温度、摇床转速、接种量、装液量。

在单因素实验基础上，按正交试验L₉（3³）的3因素3水平对菌株产IAA的培养条件进行优化实验，选出产IAA含量较高的最优条件，每组设3个重复（见表1）。正交实验依据Galois理论从全面试验中挑选出部分具有代表性的水平组合进行实验，通过挑选部分有代表性的水平组合进行实验并对结果进行分析找出最优的水平组合。

1.2.4 菌株不同浓度发酵液对小麦种子萌发率影响

将已活化的内生真菌菌株按照正交实验的优化条件进行发酵培养，得发酵液并将其滤过，滤液视为100%浓度，并用无菌水稀释为20%、40%、60%和80%四个浓度备用。

将在自来水中浸泡7 h的小麦种子用1%的次氯酸钠溶液消毒10 min，随后用无菌水冲洗5次，再用无菌滤纸轻轻将种子表面的水分吸干，最后将种子均匀地摆放于铺有灭菌滤纸的培养皿（直径=9 cm）中，每皿含有100粒种子，每皿加入5 mL无菌水再加入5 mL不同浓度枳壳内生真菌发酵液，共设置4种发酵液浓度（20%、40%、60%、80%）以无菌水（CK1）和最适合小麦种子萌发的IAA浓度0.5 μg/mL（CK2）为对照，共计6个处理，每个处理5个重复。将种子置于人工气候箱（温度为25 ℃、湿度为75%）中培养，每天添加适量且相同的无菌水以保持滤纸的湿润状态，观察比较胚根胚芽的长势，测定种子的发芽率，发芽率=（发芽种子数/供试种子数）×100%。

1.2.5 盆栽实验

吸取15 mL不同浓度的发酵液（20%、40%、60%、80%、100%）分别拌入200 g无菌土中，对照组为无菌水（CK1）、最适合小麦种子萌发的IAA浓度为0.5 μg/mL（CK2）和灭活菌液（CK3），将处理过后的土壤放置在相同的圆形花盆中。每盆种10粒消毒后的小麦种子。本试验共设置5种发酵液浓度（20%、40%、60%、80%、100%）及3个对照组，共计8个处理，每个处理8个重复。将盆栽置于适宜环境下培养，每隔3 d添加相同量的无菌水以保持土壤的湿润状态。观察记录植株的形态特征，栽培40 d后，测定植株的株高、干重、根冠比以及叶绿素含量。

1.3 数据统计与分析

采用Excel2021、MEGA11.0和Orgin2014软件进行数据统计和分析

2 结果与分析

2.1 枳壳内生真菌产IAA菌株的筛选

运用Salkowski比色法从35株枳壳内生真菌菌株中定性筛选出两株具有分泌IAA能力的菌株（菌株编号为ZYY007和ZYZ004），以无菌水（CK）和浓度为100 μg/mL的IAA［CK（IAA）］为对照。ZYY007颜色比ZYZ004较深，表明ZYY007菌株IAA产生量高于ZYZ004菌株（图1）。定量测定结果显示ZYY007、ZYZ004菌株IAA分泌量（培养4 d）分别为50.390 μg/mL、13.811 μg/mL，两者间差异极显著（P<0.01），与定性观察结果一致，进一步确定ZYY007菌株分泌IAA能力较ZYZ004强。故选定ZY007菌株作为后续研究对象。

2.2 ZYY007菌株鉴定

通过形态学观察（图2）和5.8S、18S rDNA ITS序列分析（图3），鉴定ZYY007菌株为层出镰刀菌〔Fusarium proliferatum（Matsush.） Nirenberg ex Gerlach & Nirenberg〕。

2.3 单因素对ZYY007菌株产IAA能力的影响

2.3.1 培养时间对ZYY007菌株产IAA能力的影响

如图4所示，培养时间对ZYY007菌株产IAA能力具有显著影响。不同培养时间的ZYY007菌株产IAA含量呈现非线性变化趋势：培养2 d时IAA含量为32.241 μg/mL，随着培养时间延长至5 d时达到峰值40.661 μg/mL（较初始值提升26.1%），随后呈现下降趋势，7 d时回落至33.419 μg/mL。峰值出现在第5 d，该菌株可能在此培养节点达到最大生物量并完成主要代谢转化过程，后续培养可能因营养底物耗竭或抑制性代谢物积累导致合成效率降低。

2.3.2 培养瓶装液量对ZYY007菌株产IAA能力的影响

如图5所示，培养基装液量对ZYY007菌株产IAA能力的影响呈现显著负相关趋势。在6组装液量梯度实验中，ZYY007菌株产IAA的含量随装液量增加呈递减现象：装液量40 mL时含量达峰值28.707 μg/mL，装液量增至90 mL时含量下降至15.530 μg/mL（降幅达45.9%）。可能的原因是低装液量（40 mL）条件下培养瓶中的含氧量较高，这可能是促进IAA合成的关键因素，且40 mL装液量的条件下发酵体系的气液比表面积较大，有利于溶解氧的维持及挥发性代谢产物的扩散。随装液量增加，单位体积的氧传递速率下降，菌体呼吸代谢受限，可能导致次级代谢途径向能量代谢偏移。

2.3.3 培养温度对ZYY007菌株产IAA能力的影响

实验结果表明，培养温度对ZYY007菌株产IAA能力具有显著影响。在设计的6组培养温度梯度中，ZYY007菌株产IAA能力呈现单峰分布特征：23 ℃时含量为24.954 μg/mL，随温度升高至25 ℃时达到最高峰30.059 μg/mL（较初始值提升20.46%），随后温度继续升高ZYY007菌株产IAA含量下降，28 ℃时回落至26.391 μg/mL（图6），该菌株IAA合成存在明确的最适温度阈值。25 ℃条件下的产IAA含量显著高于其他温度组（P<0.05），推测该温度可能同时优化了菌丝体生长速率与IAA合成相关酶系的催化效率。当温度超过25 ℃后，含量持续下降的现象可能与热应激导致的酶构象改变或代谢途径分流相关。

2.3.4 转速对ZYY007菌株产IAA能力的影响

由图7可见，摇床转速对ZYY007菌株产IAA能力具有显著调控作用。在6组转速梯度（130~180 r/min）实验中，转速为130 r/min时含量为33.419 μg/mL，140 r/min时略增至34.335 μg/mL，随后转速提升至150~160 r/min时含量下降至30.059~30.714 μg/mL，170 r/min时出现峰值39.309 μg/mL（较初始值提升17.6%），180 r/min时为30.016 μg/mL。170 r/min的含量极值表明该转速可能通过优化溶氧传递效率与菌丝体分散度的动态平衡，促进前体物质吸收及次级代谢途径激活。150~160 r/min区间含量下降或与剪切力增强导致的菌丝断裂或细胞膜通透性改变有关，而180 r/min时含量骤降则提示高转速可能引发代谢应激反应。

2.3.5 接种量对ZYY007菌株产IAA能力的影响

如图8所示，接种量对ZYY007菌株产IAA含量呈现先升后降的趋势：接种3块菌块时含量为21.115 μg/mL，随接种量增至6块菌块时达到峰值31.368 μg/mL（较初始值提升48.56%），随后接种量继续增加至8块菌块时含量回落至29.492 μg/mL。6块菌块接种量的含量极值表明该条件下菌丝体间的群体感应与营养利用达到最优平衡，可能通过触发次级代谢调控网络促进IAA生物合成。

2.3.6 正交实验

根据单因素实验的所测结果，从中选取对菌株液体发酵产IAA量影响较大的3个因素（培养温度、培养时间、接种量）为试验因素，选取3因素3水平进行正交试验L₉（3³）（表1）。正交试验优化ZYY007发酵条件结果如表2。通过比较各组实验结果极差R可得到，转速对ZYY007菌株产IAA的影响最大，其次为培养温度，影响最小的是接种量。从K1、K2、K3值可知：ZYY007菌株产IAA最优培养条件组合为A3B1C2，即培养温度为24 ℃、培养转速为180 r/min、接种量为6块，该组合条件下IAA产量达到48.079 μg/mL。在优化发酵条件后，虽然筛选出的最佳条件下IAA产量（48.079 μg/mL）略低于初始筛选值（50.390 μg/mL），但这种微小差异可能是实验误差（如比色法测定时的干扰）、取样时间点的细微偏差或发酵过程中代谢波动导致的。此外，初始筛选与优化实验的培养批次间存在天然变异，也可能影响结果。总体来看，该差异在合理范围内，表明优化后的条件已接近菌株的最大产IAA潜力。通过3次验证实验，得到的IAA产量为45.853、45.330、47.686 μg/mL。在该组合的培养条件下，ZYY007菌株产IAA含量较稳定。

2.4 ZYY007菌株发酵液对种子萌发的影响

实验结果（图9）显示，IAA菌液对小麦种子萌发及胚器官发育呈现浓度依赖性调控。无菌水对照组发芽率为93.0%，IAA对照组达98.4%。实验组发芽率随浓度升高呈梯度下降：20%、40%浓度组分别为97.4%、96.8%，与IAA对照组无显著差异（P>0.05）；60%、80%浓度组分别降至76.0%、50.2%，形成典型抑制曲线。含IAA菌液对小麦胚器官发育呈现特异性调控作用。低浓度处理（20%）下，胚根与胚芽长度较无菌水对照均有一定程度增长，但仍低于IAA处理水平。随着浓度升高至40%，胚芽发育出现显著促进作用，其伸长程度超越所有对照组及低浓度处理组，但胚根生长却呈现反常抑制现象，长度较其他处理组缩短（仍高于80%浓度组）；中浓度处理（60%）时，胚根与胚芽同步达到最大伸长量，形成典型协同发育特征；高浓度处理（80%）条件下，胚根生长受显著抑制，形态发育特征与无菌水对照趋近，而胚芽仍维持微弱伸长态势。

2.5 ZYY007菌株发酵液对小麦植株生长的影响

2.5.1 ZYY007菌株发酵液对小麦植株株高的影响

如图10所示，ZYY007菌株发酵液对小麦植株株高的影响具有明显的差异，植株平均高度随菌液浓度变化呈现先上升后下降的趋势：20%、40%、60%浓度组分别达到14.96 cm、15.77 cm和16.25 cm，较无菌水对照组（12.89 cm）提高16.1%~26.1%，与常规最佳IAA对照组（13.04 cm）相比，仅分别提高5.8%和4.1%；当浓度升至80%和100%时，株高分别降至13.80 cm和13.58 cm。显然，ZYY007菌株发酵液浓度60%对小麦株高促进效果最为显著，较常规最佳IAA处理提高24.6%。而高浓度（≥80%）发酵液对植物的生长具有抑制作用，原因可能是渗透胁迫或毒性代谢物积累等作用对植物细胞造成伤害，从而影响植物生长。所有实验组处理均优于无菌水和灭活菌液对照，证实菌液中有效成分对小麦生长具有促进作用。

2.5.2 ZYY007菌株发酵液对小麦植株干重的影响

实验结果（图11）表明：ZYY007菌株发酵液对小麦植株干重具有明显影响（P<0.05），即：ZYY007菌株发酵液浓度与小麦植株干重呈现非线性剂量效应关系。植物的干重随浓度梯度变化呈现先增加后降低趋势（图11）：20%浓度组达到峰值0.104 g，较无菌水对照组（0.082 g）提高26.8%，较IAA最佳浓度对照组（0.085 g）提高22.4%。当浓度升至40%和60%时，干重分别下降至0.091 g和0.094 g，仍显著高于两个对照组（P<0.05）；高浓度组（80%、100%）干重分别为0.083 g和0.080 g，与无菌水对照组差异无统计学意义（P>0.05）。可见，ZYY007菌株发酵液浓度为20%对干物质积累促进效果最显著（P<0.05），其作用强度超过IAA处理。值得注意的是，高浓度处理（≥80%）未表现出生长促进效应，其中100%浓度组干重甚至略低于无菌水和灭活菌液对照组（下降2.4%和2.31%），可能存在浓度依赖的抑制效应。

2.5.3 ZYY007菌株发酵液对小麦根冠比的影响

从图12中可知，ZYY007菌株发酵液对小麦根冠比的影响为随菌液浓度升高呈现非线性变化：20%浓度组降低至0.81，较无菌水对照组降低24.3%；40%、60%浓度组分别回升至0.83和0.93；80%浓度组再次下降至0.87；100%浓度组恢复至1.06，而无菌水处理根冠比为1.07，灭活菌液根冠比为1.05，与无菌水和灭活菌液对照组无显著差异（P>0.05），IAA对照组为1.02。由此可见，ZYY007菌株发酵液浓度为20%对根冠比抑制作用最显著，其效果强于IAA处理（降低20.6%）；中高浓度处理（40%~80%）形成"U"型恢复曲线，40%浓度时，菌液可能轻微抑制根系生长（促进地上部生物量积累），但仍维持较低根冠比，60%~80%浓度时，渗透胁迫或次生代谢物积累可能诱导植物增强根系补偿性生长（提高水分/养分吸收能力），导致根冠比回升；其中60%浓度组的根冠比较20%浓度组提升14.8%；100%浓度处理中根冠比恢复至对照水平，提示高浓度菌液可能通过渗透补偿效应抵消生长调节作用。该现象可能反映ZYY007菌株发酵液中活性成分对植物内源激素的调控作用，低浓度处理（≤20%）通过抑制根系发育优先促进地上部生长，而高浓度处理（≥80%）因基质理化性质改变产生次生效应对冲生长调节作用。

2.5.4 ZYY007菌株发酵液对小麦植株叶绿素含量的影响

ZYY007菌株发酵液浓度对小麦植株的叶绿素含量也存在影响（图13）。无菌水对照组叶绿素含量为28.506 mg/L，灭活菌液对照组叶绿素含量为29.302 mg/L，IAA对照组为33.038 mg/L。实验组叶绿素含量随菌液浓度变化呈现双峰波动：20%浓度组提升至37.745 mg/L，较无菌水对照组增加32.4%；40%浓度组达到峰值44.537 mg/L，增幅达56.2%；60%浓度组回落至36.044 mg/l，仍高于IAA处理9.1%；80%浓度组二次升高至41.240 mg/L；100%浓度组恢复至28.947 mg/L，与无菌水对照组无显著差异（P>0.05）（图13）。由此可知：ZYY007菌株发酵液浓度为40%对叶绿素合成促进效果最显著（P<0.05），其含量较IAA处理提高34.8%，100%浓度处理的叶绿素水平回归基线，可能是由于高浓度条件下渗透胁迫或光抑制效应抵消了生长素的促进作用。

3 结论与讨论

植物内生真菌群落结构的多样性组成受其自身物种遗传特性及宿主类群丰富度的共同影响，并依赖于宿主体内不同组织微环境的特征。目前，关于枳壳内生真菌分离的报道较少。植物内生真菌（endophytic fungi）是指在其生命周期某个阶段或全程栖居于健康植物组织或器官内部，却不引发宿主出现明显病变的真菌类群^［19］，通过生物调控和生物施肥，内生真菌从根系进入植物体内并行使相关功能，因此内生真菌能更有效地促进植物生长^［20-21］。

内生真菌通过合成IAA介导植物-微生物互作的现象在多种植物系统中得到验证。现有研究表明，黑色附球菌（Epicoccum nigrum）、季也蒙假丝酵母（Mucoromycotina guilliermondii）和光黑壳属（Preussia sp.）等菌株在体外培养条件下表现出显著的IAA合成能力^［22-24］，这种特性在植物促生机制中具有关键作用。此外，从披碱草（Elymus dahuricus Turcz.）种子中分离的哈慈木霉（Trichoderma harzianum）、黄绿木霉（T. aureoviride）、洛克菲特青霉（Penicillium roqueforti）及互隔交链孢霉（Alternaria alternata）等菌株不仅具备IAA生产能力，更与宿主植物的生长加速呈现显著相关性^［25-27］。其作用机制可能涉及通过IAA信号通路增强植物光合系统效率，具体表现为叶片叶绿素含量提升和光合产物积累增加，这一现象与地黄〔Rehmannia glutinosa （Gaertn.）Libosch.ex Fisch.& C.A.Mey.〕内生真菌通过IAA途径促进宿主光合作用的报道高度一致^{［21，28］}。本研究通过采集枳壳样品，分离得到枳壳内生真菌菌株35种，采用Salkowski显色法初筛试验，获得2株具有产IAA能力的菌株。通过复筛，选取出一株能高效产IAA的枳壳内生真菌，经ITS序列及进化树鉴定，菌株（菌株编号：ZYY007）为层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）。

众多研究发现，可通过优化促生菌的发酵条件提高菌株产IAA含量。SZF7菌株分泌IAA的最佳培养条件为pH 5.0、温度37 ℃和培养时间24 h，且pH和温度对其IAA分泌量具有显著影响^［29］；筛选出一株IAA含量达到58.9 mg/L的栗褐芽胞杆菌（Bacillus badius） 363，发现其最适生长条件为pH 6.0、NaCl浓度为1%^［30］。本研究将ZYY007产IAA量作为重要考量指标，根据单因素试验和正交设计试验对其发酵条件进行优化，确定了菌株最优发酵条件为：接种量为6块菌块、液体发酵转速为180 r/min、液体发酵温度为24 ℃。从喀西茄（Solanum khasianum）筛选出G6菌株在添加色氨酸条件下产量最高（16.31 mg/L），G4在未添加色氨酸时产量最高（11.22 mg/L），G4的IAA合成受外源色氨酸影响最小，而J1受影响最大^［31］。本研究则从枳壳中筛选到一株IAA高产菌株，其产量达50.390 mg/L，较喀西茄内生真菌最高产量提高约2倍，显示出明显优势。另外，层出镰孢菌是一种植物病原菌，侵染水稻、小麦、玉米、芦笋、洋葱等植物和药用植物丹参（Salvia miltiorrhiza）、地黄（Rehmannia glutinosa）等，引起枯萎病和腐烂病；还能产伏马毒素，是谷物尤其是玉米或玉米产品的主要污染源，不仅影响宿主植物的生理代谢，还严重威胁人畜健康^［32-37］。

本实验通过小麦种子萌发实验以及盆栽实验探究内生真菌菌株ZYY007的促生作用。研究发现，含IAA菌液对小麦萌发呈浓度梯度抑制，高浓度显著降低发芽率，并差异化调控胚器官发育：低浓度（20%）促根/芽效果不及常规IAA；40%浓度显著促芽但抑根；60%浓度根芽协同生长达峰值；高浓度（80%）强烈抑制胚根（接近空白组水平），胚芽仍微弱伸长。通过盆栽实验发现该菌液在特定浓度下对小麦的生长促生效果显著，甚至超出常规生长素；但高浓度（≥80%）则呈现普遍抑制。可见深入研究枳壳产IAA内生真菌并探究其促生活性，可为丰富产IAA微生物资源库及开发新型微生物菌肥提供理论依据。

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基金资助

江西省药品监督管理局科研项目(2022JS06)

江西省药品监督管理局科研项目(2023JS32)

江西省大学生创新创业训练计划项目(S202411843058)