栽培玉竹内生细菌多样性及其与品质成分的相关性研究

Diversity of endophytic bacteria in cultivated Polygonatum odoratum and its correlation with quality components

摘要

药用植物有效成分的积累不仅受遗传调控，更与其体内复杂的微生物密切相关。玉竹作为重要的中药材，其微生物组与品质形成的关系尚未明确。采用Illumina Miseq测序技术对玉竹根茎不同时期内生细菌群落进行序列测定，并使用PICRUSt2软件进行16S功能预测分析。测定其有效成分黄酮、皂苷和多糖的动态变化，筛选与玉竹关键次生代谢产物显著相关的内生细菌群落。通过OTUs序列分析发现，假单胞菌属（Pseudomonas）是苗期的优势菌属，无色杆菌属（Achromobacter）是花期、果期和枯萎期的优势菌属；PCoA分析结果表明，玉竹内生细菌群落存在阶段性差异；通过LEfSe分析确定假单胞菌属、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）等为玉竹不同生长时期的生物标识物；功能预测结果显示，代谢途径被确定为所有样品中的主要功能；相关性分析结果表明，不同时期存在差异的前15个关键OTUs与黄酮、皂苷、多糖含量呈显著相关。本研究首次系统地揭示了栽培玉竹内生细菌的演替规律及其与药效成分累积的密切关联，不仅为解析玉竹品质形成的微生物学机制提供了关键证据，也为后续开发靶向微生物菌剂以提升药材品质奠定了理论基础。

Abstract

The accumulation of bioactive compounds in medicinal plants is not only genetically regulated， but also closely linked to the complex microbes in their bodies. However， the relationship between the microbiome and quality formation in Polygonatum odoratum， an important Chinese medicinal herb， remains unclear. This study employed Illumina MiSeq sequencing technology to determine the sequence of the endophytic bacterial communities in the rhizomes at various periods. Functional prediction of 16S rRNA genes was performed using PICRUSt2 software. The dynamic changes in the active components， including flavonoids， saponins， and polysaccharides， were measured， and endophytic bacterial communities significantly associated with key secondary metabolites of P. odoratum were identified.OTU analysis revealed that Pseudomonas was the dominant genus at the seedling stage， while Achromobacter was dominant at the flowering， fruiting， and withering stages. PCoA results indicated stage-specific differences in the endophytic bacterial communities of P. odoratum. LEfSe analysis identified Pseudomonas， Alphaproteobacteria， and Pseudomonasaeruginosa as biomarkers at different growth stages. Functional prediction results showed that metabolic pathways were the predominant functions across all samples.Correlation analysis demonstrated that the first 15 key OTUs exhibiting temporal variation were significantly correlated with flavonoid， saponin， and polysaccharide contents. This study systematically reveals， for the first time， the succession patterns of endophytic bacteria in cultivated P.odoratum and their close association with the accumulation of pharmacologically active components. It not only provides key evidence for elucidating the microbial mechanisms underlying the quality formation of P. odoratum， but also lays a theoretical foundation for the subsequent development of targeted microbial inoculants to improve the quality of medicinal materials.

Graphical abstract

关键词

玉竹 / 内生细菌 / 群落多样性 / 高通量测序 / 次生代谢产物

Key words

Polygonatum odoratum （Mill.） Druce / endophytic bacteria / community diversity / high-throughput sequencing / secondary metabolite

0 引 言

中药玉竹为百合科（Liliaceae）黄精属（Polygonatum）植物玉竹〔Polygonatum odoratum （Mill.） Druce〕的干燥根茎^［1］。最早以葳蕤之名，载入《神农本草经》被列为上品。玉竹喜凉爽潮湿荫蔽的环境，较耐阴、耐寒，常生于山野阴湿处、林下及灌木丛中，在中国华东，华北，华南等地均有分布^［2］。玉竹主要化学成分为多糖类、甾体皂苷类、黄酮类、挥发油类和生物碱类等^［3］，具有抗炎抗菌^［4-5］、抗氧化^［6-7］、降糖降脂^［8-9］、免疫调节^［10-11］、抗肿瘤^［12］、抗疲劳^［13］和抗衰老^［14］等药理作用。传统研究多聚焦于玉竹化学成分与药效评价，而对其品质形成的微生物学机制尚未涉足。

近年来，关于植物内生菌的研究越来越多，植物内生菌是指在其生活史一定阶段或全部阶段生活于健康植物各种组织和器官内部不引起明显症状的微生物类群，是植物微生态系统的重要组成部分^［15］。其主要包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌3大类^［16］。在悠久的进化历程中，宿主植物与内生菌之间发展出了一种独特的相互依存、互惠共赢的关系^［17］。许多植物内生菌具有重要的生物学和生态学功能，如通过固定氮、分泌生长素、抵抗病虫害来促进植物生长，或作为潜在的生物防治资源和外源基因的载体^［18-19］。研究发现，高度多样化的内生群落影响寄主植物的代谢物组成。药用植物内生菌能合成与药效成分相似的活性物质，促进药用植物活性成分的积累。如，在银杏中内生菌群与类黄酮浓度和组成为显著相关，特别是葡萄球菌（Staphylococcus）与槲皮素呈正相关^［20］；在滇重楼中，木霉菌和人参生柱隔孢能显著提高皂苷类成分的含量^［21］。因此，微生物可能对药材品质的提升具有重要影响^［22］。

受可利用土地资源缩减、生态环境退化以及土壤连作障碍等因素影响，近年来，玉竹种植中病虫害加剧、有效成分含量下降、品质波动等问题日益突出，严重损害了其药用价值和经济价值。玉竹种植产业亟需新技术来应对这些难题。因此，本研究利用高通量测序技术分析栽培玉竹不同生长时期根茎内生细菌群落多样性，明确其优势细菌和共有细菌类群，探究玉竹内生细菌群落和有效成分含量的相关性，从微生物的角度探究玉竹内生菌对其药材品质的影响，以期为栽培玉竹的药用价值研究和玉竹资源的有效保护提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 药 材

本研究所用试验材料为三年生栽培玉竹，采自黑龙江中医药大学药用植物园，经黑龙江中医药大学药学院孙慧峰教授鉴定为玉竹。以三年生栽培玉竹苗期样品（MG）、花期样品（HG）、果期样品（GQ）和枯萎期样品（KG）为研究对象，于2022年4月、5月、7月和9月采用五点取样法分别挖取3株未被动物啃食、无病虫害、无机械损伤的玉竹完整带土植株。

1.2 样品前处理

采集不同生长时期玉竹的根茎，每个时期设置5个生物学重复。轻轻抖落根系外部松散土，用无菌刷除去大块土壤，保留1 mm左右的土壤附在根上，将样品装入无菌袋内并迅速带回实验室，置于无菌管中，加入磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=7.4），8 500 r/min离心60 s。用流动水冲洗根上多余的土壤，超声洗涤2次后，依次浸入75%乙醇（30 s）、2.5%次氯酸钠（3 min），无菌水冲洗5次，最后用无菌滤纸吸干水分，切成1 cm的小段，并均匀分成5份。获得无菌样品20份，放置-80 ℃冰箱中保存。为保证表面灭菌的彻底，将最后一次的清洗液取10 μL涂布在LB（Luria-Bertain）培养基上，28 ℃培养2~3 d，未见菌落表明灭菌彻底。

1.3 DNA提取和PCR扩增

按照MagAtrract PowerSoil Pro DNA Kit试剂盒使用说明书提取内生细菌DNA，细菌以特异性引物799F：5´-AACMGGATTAGATACCCKG-3´和1193R：5´-ACGTCATCCCCACCTTCC-3´进行PCR扩增，PCR产物使用浓度2%的琼脂糖进行电泳检测，产物回收纯化后，委托上海美吉生物公司完成测序。

1.4 生物信息分析

Illumina测序得到的样本有效数据首先使用FastQC检测序列质量，剔除低质量碱基，同时利用Trimmomatic去除接头、引物及低质量末端，再利用FLASH软件拼接成对末端（paired-end）序列，生成完整的扩增子序列。通过Usearch将所有样本序列按照序列间的距离进行聚类，基于序列之间97%的相似性将序列分割成不同的操作分类单元（operational taxonomic units，OUT），并进行各种OTU分析。利用QIIME软件生成不同分类水平上的物种丰度表，再分别对样品进行Alpha多样性指数评估和Beta多样性分析，并利用参数统计和非参数统计方法对组间差异进行分析。

1.5 皂苷、黄酮、多糖的提取和测定

将玉竹根茎置于60 ℃的烘箱中烘干至恒重，粉碎，过65目筛得到玉竹粗粉。精密称取上述粗粉1 g，置于具塞试管中，加入5 mL甲醇，超声提取30 min，静置冷却，过滤，重复提取2次，合并滤液后加甲醇至15 mL，12 000 r/min离心10 min，收集上清液，即得供试品溶液。总黄酮和皂苷的测定波长为515 nm，以质量浓度、吸光度分别为横纵坐标，绘制芦丁和没食子酸的标准曲线，线性回归方程分别为y=6.742 2x-0.009 5，R²=0.998 1和y=1.446 5x+0.003 4，R² =0.998 8。

精密称取玉竹粗粉1 g，置于250 mL圆底烧瓶中，加水100 mL，加热回流1 h后，使用脱脂滤棉过滤，重复提取1次。将两次得到的滤液合并，浓缩，转移至100 mL容量瓶中，加水至刻度线，摇匀，得到的溶液为供试品溶液。多糖的测定波长为490 nm，以质量浓度、吸光度分别为横纵坐标，绘制葡萄糖的标准曲线，线性回归方程为y =0.042 6x-0.043 3，R² = 0.998 6。

1.6 统计学分析

所有统计分析均使用IBM SPSS Statistics（v23.0）进行。基于Bray-Curtis距离算法进行主坐标分析，使用R语言（ggplot2包）进行可视化。使用GraphPad Prism（v8.0）绘制条形图。采用LEfSe软件（v1.0）筛选细菌群落标志物，P<0.01为差异有统计学意义，LDA评分>3.5，使用R语言软件进行可视化。最后，使用PICRUSt2（version 2.2.0）对细菌群落进行功能预测分析，使用美吉云平台进行可视化。采用随机森林模型预测用于识别关键OTUs，提取前15位重要OTUs做验证并进行Spearman相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同时期玉竹根茎内生细菌多样性分析

2.1.1 测序数据与多样性分析

对玉竹根茎内生细菌进行高通量测序，经过均一化处理后，获得901个OTUs。基于Shannon指数绘制根茎内生细菌的稀释曲线（图1），所有样品的OTUs数量随测序量的增加而逐渐增加，曲线趋于平坦，说明测序数据量合理。在MG、HG、GG和KG样品中共有OTUs 23个，占总OTUs数的2.55%，见图2（a）。4组样品共有菌属28种，见图2（b），包括假单胞菌属（Pseudomonas）（OTU535、OTU2416）和慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）（OTU2403）等。综上，玉竹不同生长时期内生细菌既存在相似性，也存在差异性。

对不同生长时期玉竹根茎细菌群落Alpha多样性指数进行比较（表1）。结果表明，不同生长时期玉竹根茎内生细菌群落多样性和丰富度均存在显著性差异（P<0.05）。其中，玉竹苗期Shannon指数和Simpson指数最高；果期Chao1指数和Ace指数最高；枯萎期各Alpha多样性指数均为最低。苗期根茎内生细菌多样性显著高于其他3个时期，果期根茎内生细菌丰富度显著高于其他3个时期，枯萎期根茎内生细菌多样性和丰富度均显著低于其他3个时期。

基于Bray-Curtis距离算法的PCoA分析表明，不同时期玉竹根茎内生细菌群落相似性差异较大（图3）。主坐标轴1和主坐标轴2分别解释了总方差的64.20%和14.77%。苗期细菌OTUs聚集在二、三象限，花期、果期和枯萎期细菌OTUs聚集在一、四象限。花期、果期和枯萎期距离较近并有部分重叠，说明花期、果期和枯萎期根茎内生细菌群落相似度较高。而苗期与其他3个时期距离较远，说明苗期内生细菌群落与其他3个时期具有显著差异性。

2.1.2 细菌群落结构分析

对玉竹不同生长时期根茎内生细菌群落丰度进行分析发现，在门水平，假单胞菌门（Pseudomonadota）广泛存在于玉竹根茎中，为玉竹不同生长时期根茎的优势菌门，平均丰度≥83.28%，见图4（a）。

在属水平，无色杆菌属（Achromobacter）、假单胞菌属、Planktosalinus、芽胞杆菌科（Bacillaceae）未分类细菌、短波单胞菌属（Brevundimonas）为丰度前5的优势属，见图4（b）。玉竹根茎苗期的第一大优势群落为假单胞菌属，平均丰度≥38.94%；Planktosalinus仅存在于苗期，且相对丰度与短波单胞菌属相近。相较于苗期，花期和果期中假单胞菌属相对丰度显著下降。无色杆菌属为玉竹根茎花期、果期和枯萎期的优势内生细菌群落，平均丰度分别为≥63.11%、71.01%和81.00%。

对4个时期玉竹根茎内生细菌进行LEfSe分析，寻找不同时期之间具有显著统计差异的细菌类群（图5）。通过LEfSe分析共获得27个差异类群（P<0.01，LDA>3.5）。其中，苗期的生物标识物为假单胞菌目（Pseudomonadales）、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、假单胞菌属、高效矿物风化固氮假单胞菌（Pseudomonas azotoformans）、α-变形菌（Alphaproteobacteria）、生丝微菌目（Hyphomicrobiales）等；花期的生物标识物为绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）；果期的生物标识物为嗜热油菌纲（Thermoleophilia）、Gaiellales、小单孢菌科（Micromonosporaceae）、小单孢菌属（Micromonosporales）、拟杆菌属（Bacteroides）、盖尔盘菌属（Gaiella）；枯萎期的生物标识物为产碱杆菌科（Alcaligenaceae）、无色杆菌属（Achromobacter）、伯克氏菌目（Burkholderiales）。LEfSe分析结果表明，玉竹内生细菌群落在不同生长时期存在显著差异的生物标识物。

2.1.3 功能预测

对玉竹内生细菌群落进行功能预测分析，结合基因的KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路信息预测整个群落的通路情况，探讨不同生长时期玉竹内生细菌群落的差异。基于KEGG水平1预测，见图6（a），内生细菌的主要功能是代谢、环境信息处理、细胞过程、遗传信息处理、人类疾病和生物系统，代谢途径被确定为所有样品中的主要功能。KEGG水平2预测进一步表明，在内生细菌群落中，仅有全局和总览图谱所占比例最高且占比>10%，显著高于其他代谢途径，见图6（b）。

2.2 玉竹关键代谢物的含量分析

本研究对不同生长时期玉竹根茎进行了皂苷、黄酮、多糖的含量检测。玉竹皂苷含量从苗期的10.55%增至花期的50.28%，果期为58.90%，达到峰值，枯萎期维持显著高积累状态。黄酮类物质在苗期含量为0.68%，经花期上升至0.9%后在果期降至0.51%，枯萎期无显著变化。苗期玉竹根茎的多糖含量为11.34%，花期的含量提高至15.18%，进入果期后多糖含量又显著下降至12.08%，最终在枯萎期又升至15.17%，见图7。结果表明，玉竹皂苷、黄酮、多糖含量存在阶段性波动。

2.3 微生物与关键代谢物的相关性分析

采用随机森林算法寻找不同时期的差异关键OTUs序列，选取排名前15的OTUs（图8），并采用非参数Spearman相关检验分析其与黄酮、皂苷、多糖含量的相关性。结果显示，OTU2416（假单胞菌属）、OTU155（mle1-7）的相对丰度与黄酮含量呈显著正相关；OTU452（Gaiella）、OTU258（Gaiellales未分类细菌）、OTU394（黄杆菌）、OTU554（假单胞菌属）、OTU533（无色杆菌属）的相对丰度与皂苷含量呈显著正相关；OTU2416（假单胞菌属）和OTU535（假单胞菌属）的相对丰度与皂苷含量呈显著负相关；OTU533（无色杆菌属）的相对丰度与多糖含量呈显著正相关，见图9。

关键OTUs序列相对丰度的分析发现，与皂苷或黄酮呈显著正相关的细菌OTUs在花期根茎中富集，见图10（a）。对玉竹内生细菌进行功能预测发现，与其他3个时期相比，苗期根茎携带更丰富的代谢功能基因，见图10（b），包括一般代谢功能（碳水化合物、氨基酸和脂质等）和特殊代谢功能（萜类化合物和其他次生代谢产物）。以上结果表明，关键内生细菌类群及其功能对玉竹代谢产物累积具有重要作用。

3 讨 论

在栽培玉竹4个生长时期的根茎样本中共检测出901条OTUs，4个时期共注释得到32门66纲153目274科510属7 715种内生细菌。假单胞菌门为玉竹不同时期根茎内生细菌共同的优势菌群，表明玉竹不同时期内生菌类群存在一定程度的重叠与相似性。在属水平，苗期的优势菌属是假单胞菌属，其多样的代谢途径和抗性机制有助于提高植物对病原体的抵抗力并调控某些次生代谢产物的合成，对植物生长起积极作用^［23-24］。而花期、果期和枯萎期的优势菌属是无色杆菌属，其可以通过合成吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）等物质增强植物生存能力^［25］。玉竹苗期细菌群落多样性最高，果期细菌群落丰富度最高，枯萎期细菌群落多样性和丰富度均显著低于其他时期。内生细菌的分布受到土壤条件、地理分布、气候、植物种类和植物-微生物相互作用等多种因素的影响^［26］。从苗期到果期，玉竹生长发育需要大量营养物质持续输入，此时根茎内生细菌的丰富度增加并在果期达到最大值，可能与温度升高、自身抗逆性增加相关^［27］。枯萎期温度降低，周围植物逐渐进入休眠期，植被凋落物和根系分泌物的季节差异可能会改变土壤细菌组成和多样性，进而对土壤功能微生物产生特定的影响^［28］。根系分泌物可以吸引并促进特定菌种的聚集，同时外部环境因素也对植物内生菌的构成产生影响^［29］。由此推测，植物内生菌在植物体内的动态演替可能受到植物生长发育阶段的影响。这与Yu等^［30］的研究结果一致，他们通过研究甜叶菊叶片在不同生长阶段的内生细菌群落变化，发现不同生长阶段甜叶菊叶片内生菌多样性存在显著差异。

玉竹主要活性成分随玉竹的生长发育不断累积。在生长周期内，玉竹体内皂苷含量呈现持续增长特征，黄酮类物质含量呈现先升高后降低的趋势。这与不同生长年限与采收期玉竹活性成分累积动态变化^［31］的研究结果一致，他们指出，前期玉竹主要进行地上部分的生长，中期由于生殖生长的影响，含量逐渐上升，后期新陈代谢活动减弱，主要活性成分含量趋于稳定。而多糖含量呈现出双峰波动，果期到枯萎期显著上升。对青藏高原4种多年生草本植物的研究表明^［32］，秋季低温诱导碳水化合物向地下贮藏器官分配，总非结构性碳水化合物（total nonstructural carbohydrates，TNC）含量显著增加。对玉竹内生细菌进行功能预测发现，玉竹内生细菌包含大量碳水化合物、氨基酸、膜运输及能量转移的基因信息，说明玉竹内生细菌可能参与的代谢过程中的各种营养物质合成，为植株生长发育提供必要的营养和激素等^［33］。这与研究西洋参（Panax quinquefolius L.）内生细菌功能的结果相似^［33］。与其他3个时期相比，苗期根茎携带了更丰富的代谢功能基因，但苗期皂苷、黄酮和多糖含量均低于花期，可能与苗期内生菌缺乏诱导植物次生代谢的信号分子相关，导致代谢通路虽多但实际合成能力不足。此时微生物携带的基础代谢基因丰富，但主要服务于自身定殖和宿主耐受性建立，而非次生代谢产物的合成。这与解飞翔等^［35］的研究结果一致，他们发现竹子内生真菌尖孢镰刀菌通过分泌吲哚乙酸促进根系生长，用于生物量积累而非次生代谢。花期内生细菌群落趋于成熟，与代谢产物呈显著正相关的关键细菌OTUs在花期根茎中富集，内生细菌可以通过降解植物细胞壁成分释放前体物质，促进次生代谢产物合成^［36］。

本研究以玉竹栽培品种为研究对象，采用高通量测序研究玉竹不同生长阶段根茎内生细菌群落多样性及组成，结合关键代谢物含量，通过相关性分析筛选出与玉竹关键次生代谢物显著相关的内生细菌群落。研究结果系统地揭示了栽培玉竹内生细菌的演替规律及其与药效成分累积的密切关联，不仅为解析玉竹品质形成的微生物学机制提供了关键证据，也为后续开发靶向微生物菌剂以提升药材品质奠定了理论基础。后续工作中，将筛选功能菌株与玉竹无菌苗进行共培养，验证菌株对玉竹关键次生代谢产物的调控作用。未来可深入研究靶向功能微生物调控机制，并开发功能微生物菌剂，为药用植物资源可持续利用和品质定向提升提供新策略。

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