0 引 言
胡蜂属于膜翅目(Hymenoptera)胡蜂亚科(Vespidae)昆虫。胡蜂种群数量大,个体常聚集一起营社会性生活。目前,部分胡蜂已成功养殖,其幼虫和蜂蛹可为人类提供丰富的蛋白
[1-2]。除用于食材外,胡蜂蜂毒在中医中具祛风、解毒、缓解胀痛作用,对治疗风湿关节炎、杀菌和干扰神经退化具有一定的疗效
[3-6]。但是,目前人们对胡蜂蜂毒的经济价值和药用价值并未完全了解。
胡蜂腹部末端具尾针,受到威胁时可以排出毒素用于攻击入侵者。对大部分生物来说,被胡蜂蛰刺后呈现强烈的过敏反应,因而胡蜂蜂毒被当成有害物质。然而,在云南省民族地区,胡蜂蜂毒作为中医药材在临床上用于治疗风湿等疾病
[3,5]。因而,了解胡蜂蜂毒的成分和药理作用是当前研究的热点。随着胡蜂人工养殖业不断发展,市场上蜂毒数量持续增长,但胡蜂蜂毒在生产中的应用却十分有限。目前并不清楚胡蜂蜂毒成分和含量的差异,这在一定程度上阻碍了胡蜂蜂毒的开发与应用。
已有的研究表明,胡蜂蜂毒属于复杂的混合物
[7-8]。从成分来看,胡蜂蜂毒主要由蛋白、多肽、生物胺、多糖等物质构成,这些物质在过敏反应中具有不同的功能
[9]。磷脂酶A1(phospholipase A1,PLA1)、透明质酸酶(hyaluronidase A,HAase)和蜂毒过敏原抗原5(venom allergen 5,Ag5)具有重要的生理功能
[8,10]。磷脂酶A1可以引起红细胞或其他细胞的细胞膜破裂,导致细胞坏死和溶血。透明质酸酶通过降低体内透明质酸的活性,提高组织中液体渗透能力,让人体组织形成肿胀糜烂等生理现象。5-羟色胺和组胺等胺类物质既可以引起兴奋,让受害者记忆蜂毒的疼痛感并远离胡蜂巢室,又可能作为一种过敏源引起风团和肿胀
[11]。这些物质不仅能独立引起过敏反应,其还可能同其他成分存在交叉协同作用
[11]。由此可见,磷脂酶A1、透明质酸酶和生物胺类物质是胡蜂蜂毒中的重要成分,在过敏和疼痛反应中起重要的作用。为了解胡蜂蜂毒对动物的影响,有必要厘清不同胡蜂蜂毒中该类物质的含量差异。
同胡蜂蜂毒相比,蜜蜂蜂毒成分研究历史更长久,其主要成分已被解析。研究结果表明,蜜蜂蜂毒同胡蜂蜂毒存在差异,蜜蜂蜂毒主要有小分子蜂毒肽(melittin)、蜂毒明肽(Apamin),同时含有磷脂酶A2等其他物质
[12-15]。其中,蜜蜂蜂毒肽为蜜蜂蜂毒主要成分,超过干物质总量的50%
[11,13]。磷脂酶A2具有溶解细胞结构的作用,引起动物的疼痛感。由此可见,胡蜂蜂毒同蜜蜂蜂毒具有不同的成分。然而,目前没有研究比较胡蜂蜂毒和蜜蜂蜂毒的成分差异。为进一步开拓胡蜂蜂毒的应用价值,揭示胡蜂优质种质资源,结合现代分析测试技术,比较胡蜂蜂毒和蜜蜂蜂毒成分和含量差异,为提高胡蜂蜂毒在生产中的应用奠定基础。
本研究以3种人工养殖胡蜂和西方蜜蜂为对象,测定胡蜂和蜜蜂形态大小和毒囊大小,比较胡蜂和蜜蜂的个体大小及毒囊大小差异。通过液相色谱方法解析蜂毒主要蛋白成分,比较氨基酸、5-羟色胺含量,磷脂酶A和透明质酸酶活性,以期揭示胡蜂蜂毒成分差异和特征。从蜂毒成分和含量的角度,为人工饲养胡蜂的物种筛选提供参考。
1 材料与方法
1.1 物种选择和蜂毒采集
研究对象为西方蜜蜂(Apis mellifera Linnaeus)和中国人工养殖的黄脚胡蜂(Vespa velutina var. auraria Lepeletier)、基胡蜂(Vespa basalis Smith)和金环胡蜂(Vespa mandarina Smith)。为降低环境对蜂毒成分的可能影响,实验所用蜂毒均来源于养蜂场刚采集的蜂毒,未久置于自然环境。取毒时,将采毒板置放于蜂巢下方并接通电源,蜜蜂和胡蜂通过针刺带电的玻璃板,在玻璃板上释放蜂毒。因而,所取得的蜂毒来源于采集点内多个群蜂若干职蜂释放的蜂毒。将带蜂毒的玻璃板立即放置于-20 ℃的冰室,待液态蜂毒冷凝结晶为固体粉末,取下保存于-20 ℃冰箱待用。
1.2 胡蜂个体大小以及毒囊大小
各采集至少18只上述4种产毒蜂职蜂保存于75%的酒精中,在解剖镜下测定昆虫翅间距(intertegular distance,ITD),用于量化昆虫个体大小。用昆虫针轻挑成虫腹部背板,显露昆虫尾针、毒囊和后肠器官,于超景深体视镜(日产VHX-5000)下拍摄毒囊照片。由于毒囊为橄榄球状器官,不能直接测定其体积,研究选择毒囊的长和宽用于量化毒囊大小。实验共测定90只产毒蜂的个体大小和毒囊大小(西方蜜蜂:21只;黄脚胡蜂:18只;基胡蜂:21只;金环胡蜂:30只)。
1.3 蜂毒多肽和蛋白鉴定
采用液相色谱串联质谱法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MSMS)鉴定蜂毒中的多肽和蛋白。先用SDT裂解液(4%SDS,100 mmol/L Tris/HCl pH7.6, 0.1 mol/L DTT)提取蜂毒中蛋白质。将5 mg样品加入200 µL SDT裂解液,超声5 min后再沸水水浴5 min,14 000 r/min离心15 min,获得上清蛋白。再加入40 µL Trypsin buffer,37 ℃孵育16~18 h进行肽段酶解。色谱分离时,液相所用A液为0.1%甲酸水溶液,B液为0.1%甲酸乙腈水溶液。液相色谱柱(0.15 mm×150 mm,RP-C18,Column Technology Inc.)以95%的A液进行平衡,样品自动进样到捕集柱(Zorbax 300SB-C18 peptide traps, Agilent Technologies Inc.)后经液相色谱柱分离。分离后的酶解产物用质谱仪(Q Exactive HF-X,Thermo Fisher)质谱分析60 min,全扫描后采集10个碎片图谱。运用MaxQuant软件将质谱数据分别比对到UniProtKB数据库中(
https://www.uniprot.org/)胡蜂和蜜蜂的蛋白数据库(截止2025年06月20日),获得蛋白质鉴定及定量分析结果。蜂毒成分检测、数据比对委托浙江省杭州研趣信息技术有限公司完成。
1.4 5-羟色胺含量测定
采用液相色谱质谱仪(UPLC-MS/M平台)定量检测蜂毒中5-羟色胺的含量。取不同物种的蜂毒样品各1 mg,加入0.7 mL甲醇,充分涡旋混匀,低温超声30 min,于4 ℃下12 000 r/min离心5 min。上清液转移至离心管中,继续用0.7 mL甲醇按上述方法提取2次,合并全部上清液,经0.22 µm有机滤膜过滤。液体转三重四级杆液质联用仪(Sciex TripleQuad 4500,US)检测5-羟色胺含量。其中,根据仪器标准操作流程设置赛默飞Thermo ScientificTM的Hypersil GOLDTM C18 column色谱柱测试条件。配制不同浓度的标准品溶液,按上述操作步骤获取各个标准品的质谱峰强度,基于标准品浓度和质谱峰面积绘制标准曲线。每种产毒蜂设置3个重复并获取质谱峰面积,由标准曲线计算样品中5-羟色胺含量。
1.5 氨基酸含量测定
按国标GB/T5009.124-2016
[16]测定蜂毒中氨基酸含量。用浓盐酸(6 mol/L)在110 ℃氮气条件下水解并消化蜂毒22 h至所有蛋白分解成氨基酸,后用氨基酸分析仪(百康Biochrom30+)测定18种常见氨基酸(天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸和脯氨酸)含量。本研究用单位质量中氨基酸含量(mg/g)来量化蜂毒中氨基酸差异。每种蜂毒设置3次重复,用均值量化不同氨基酸含量,并比较不同蜂毒中氨基酸含量差异。
1.6 磷脂酶A和透明质酸酶活性测定
采用昆虫磷脂酶A(PLA)ELISA检测试剂盒(上海纪宁实业有限公司,货号:JN94288)和昆虫透明质酸酶(HAase)ELISA检测试剂盒(上海纪宁实业有限公司,货号:JN214811)检测蜂毒样品中的磷脂酶A和透明质酸酶活性。将标准品(50 µL)和样品(10 µL样本+40 µL样本稀释液)加入检测孔,在37 ℃水浴中检测抗-HRP(辣根过氧化物酶)标记60 min后,20×洗涤缓冲液,重复洗板5次,底物A、B各50 µL中避光孵育15 min,最后在终止液50 µL中反应15 min,所得物在450 nm波长下测定各孔的吸光度值(OD值)。依据标准品的酶活性值(U/mL)和吸光度值建立标准曲线,据此线性关系,由样品吸光度值推测样品酶活性值。每个样品测试3个重复,用均值量化不同蜂毒的磷脂酶A和透明质酸酶活性差异。
1.7 4种产毒蜂蜂毒成分含量的雷达图分析
基于上述测定值,用雷达图综合评价上述黄脚胡蜂、基胡蜂、金环胡蜂和西方蜜蜂蜂毒性状。由于不同成分具有不同量化刻度,为在同一个雷达图中展示多个成分,首先对各个成分按一定比例降低量化值。本研究中,分别对各成分测定值除以某固定值,以便降低量化值,并在同一雷达图内展示不同成分的差异。其中,对氨基酸含量除以32,5-羟色胺含量除以10
5,磷脂酶A含量除以10,透明质酸酶含量除以100。处理后的数值用
R的ggradar包绘制雷达图
[17]。
1.8 数据分析与处理
方差分析(analysis of variance,ANOVA)分别检验4种产毒蜂个体大小、毒囊长和毒囊宽差异,产毒蜂的个体大小、毒囊长和毒囊宽为因变量,产毒蜂(类型变量)为自变量。计算产毒蜂个体大小同毒囊长、毒囊宽的Pearson相关系数,以及毒囊长和毒囊宽的Pearson相关系数,量化它们之间的相关性。
R2值越大,表明变量间的相关性越高,反之亦然。因不同蜂毒中5-羟色胺含量、18种氨基酸含量、磷脂酶A和透明质酸酶活性仅设置3个重复,因而采用非参数秩和检验(Kruskal-Wallis rank sum test)比较这些成分在不同蜂毒中的含量差异。所有分析检验在R软件(4.5.2)中进行
[18]。
2 结果与分析
2.1 4种产毒蜂的个体大小和毒囊形状差异
方差分析表明,不同产毒蜂个体大小存在显著差异(
表1)。蜜蜂个体最小(2.89±0.15 mm),基胡蜂(3.25±0.44 mm)、黄脚胡蜂(3.65±0.19 mm)和金环胡蜂(6.18±0.36 mm)的个体依次增大,金环胡蜂个体最大。西方蜜蜂和胡蜂的毒囊多为橄榄球状,即两端缩小而中部膨大。正常情况下,毒囊为乳白色,如
图1(a)。由于受保存时间的影响,部分样品毒囊色泽发生变化,解剖镜下呈浅黄色,如
图1(b)、(c)、(d)。方差分析表明,不同物种毒囊的长和宽存在显著差异(
表1)。蜜蜂的毒囊最小(长:1461.47±0.18 mm;宽:0.87±0.16 mm),黄脚胡蜂的毒囊(长:2.23±0.73 mm;宽:1.25±0.41 mm)、基胡蜂的毒囊(长:3.34±0.49 mm;宽:1.98±0.37 mm)和金环胡蜂的毒囊(长:4.83±1.77 mm;宽:2.97±0.77 mm)依次增大,金环胡蜂毒囊最大。产毒蜂毒囊的长和宽显著性正相关(
R2=0.854),产毒蜂毒囊个体大小同毒囊长(
R2=0.412)和宽(
R2=0.487)显著性正相关。
2.2 蜂毒蛋白质和多肽成分鉴定
LC-MSMS方法识别出蜜蜂蜂毒中628种多肽和522组蛋白,胡蜂蜂毒中773种多肽和77组蛋白(
表2)。同uniprotkb数据库比对可知,西方蜜蜂蜂毒中主要含多种蜂毒肽,比如蜂毒二肽基肽-4(venom dipeptidyl peptidase 4, DPP-4)、蜜蜂蜂毒抗原变体2(icarapin variant 2)、血淋巴蛋白(hemolymph protein)和蜂毒明肽(apamin)等物质。同时还有磷脂酶A2、蜂毒酸性磷酸酶Acph-1(venom acid phosphatase Acph-1)、透明质酸酶、王浆主蛋白5和王浆主蛋白9等物质。对于胡蜂而言,主要的成分包含多种胡蜂蜂毒肽、磷脂酶A1、蜂毒过敏源5、透明质酸酶A和胡蜂化学趋向性肽X等物质。同时,3种胡蜂的蜂毒成分又存在差异。金环胡蜂蜂毒中存在大量的辅酶Ⅰ-泛醌氧化还原酶,而黄脚胡蜂和基胡蜂蜂毒中具有较多的胡蜂趋化性肽X(Vespid chemotactic peptide X)。黄脚胡蜂和基胡蜂的蜂毒中存在胡蜂趋化肽T(vespid chemotactic peptide T)和细胞色素氧化酶亚型2抗体(cytochrome c oxidase subunit 2),但在金环胡蜂蜂毒中未检测到这两种成分。此外,黄脚胡蜂蜂毒中含有胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin-2)。除此之外,4种蜂毒中还鉴定出其他成分和特有成分。
2.3 蜂毒氨基酸含量
4种产毒蜂的蜂毒中均检测到18种常见氨基酸,但其含量存在差异(
表3)。胡蜂蜂毒的天冬氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸平均含量显著高于蜜蜂蜂毒相应含量,而蜜蜂蜂毒的苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸平均含量显著高于胡蜂蜂毒相应含量。胱氨酸、异亮氨酸和赖氨酸的含量在四种蜂毒中不存在显著差异。对18种常见氨基酸求和可知,单位质量的基胡蜂蜂毒氨基酸总量高于金环胡蜂、黄脚胡蜂和蜜蜂,黄脚胡蜂蜂毒中氨基酸总量最低。
2.4 5-羟色胺含量
4种产毒蜂的蜂毒均具有5-羟色胺,但不同蜂毒中5-羟色胺含量存在显著差异(
图2:
χ2= 10.385,df=3,
P=0.016)。胡蜂蜂毒中的5-羟色胺平均含量超过10
5 µg/g,显著高于蜜蜂蜂毒中5-羟色胺的含量,后者平均值仅约50 µg/g。就胡蜂而言,3种胡蜂蜂毒中5-羟色胺含量同样存在显著差异(
χ2=7.200,df=2,
P=0.027)。黄脚胡蜂5-羟色胺平均含量显著高于金环胡蜂和基胡蜂的5-羟色胺平均含量。
2.5 磷脂酶A和透明质酸酶活性
4种产毒蜂蜂毒中磷脂酶A的活性存在显著性差异(
χ2=10.385,df=3,
P=0.016)。胡蜂蜂毒中磷脂酶A1活性低于蜜蜂蜂毒的磷脂酶A2活性,见
图3(a)。就胡蜂来说,3种产毒蜂蜂毒中的磷脂酶A1活性同样存在显著性差异(
χ2=7.200,df=2,
P=0.027)。金环胡蜂蜂毒中的磷脂酶A活性最低,黄脚胡蜂和基胡蜂依次增加,蜜蜂蜂毒的磷脂酶A活性最高。
4种产毒蜂蜂毒中透明质酸酶的活性存在显著性差异(
χ2=9.974,df=3,
P=0.019),胡蜂蜂毒中透明质酸酶活性低于蜜蜂蜂毒的透明质酸酶活性,见
图3(b)。就胡蜂来说,3种产毒胡蜂蜂毒中的透明质酸酶活性同样存在显著性差异(
χ2=6.489,df=2,
P=0.039)。金环胡蜂蜂毒中透明质酸酶活性最低,黄脚胡蜂和基胡蜂依次增加,蜜蜂蜂毒的透明质酸酶活性最高。
2.6 蜂毒不同成分含量雷达图分析
雷达图总结出4种产毒蜂蜂毒成分含量差异(
图4)。具体而言,4种蜂毒中的氨基酸总量(绿色)差异并不明显。但是,5-羟色胺含量(红色)在4种蜂毒中差异尤为明显。与前面数据一致,蜜蜂的5-羟色胺含量较低,而胡蜂的5-羟色胺含量较高。同时,4种蜂毒的磷脂酶A(绿色)和透明质酸酶(橙色)含量同样存在差异。
3 讨 论
研究发现,产毒蜂毒囊大小同个体大小相关。产毒蜂个体越大,其毒囊越大。3种胡蜂的个体比西方蜜蜂的个体大,它们的毒囊均大于蜜蜂毒囊,表明胡蜂能够释放更多毒素,因而在叮刺动物过程中,胡蜂一次排出比西方蜜蜂更多的毒液。同时,3种胡蜂的毒囊大小也存在差异,个体最大的金环胡蜂毒囊最大,表明该物种具有释放大量毒液的能力。
由于参考数据库的原因,本研究仅能比对约30种胡蜂蜂毒成分(
表2),存在较大漏检。比如,分别对金环胡蜂蜂毒进行多肽和蛋白质成分色谱鉴定,发现金环胡蜂蜂毒中含有超过100多种成分
[9,19]。研究者发现约1 000种化学成分,其中存在小分子胡蜂蜂毒肽M(Mastoparan-M)
[4],而本研究比对结果并未注释该成分。由此可见,由于胡蜂蜂毒蛋白数据库不完整,本研究并未完全厘清胡蜂蜂毒组分。相比而言,西方蜜蜂蜂毒研究历史更长,蜂毒蛋白的参考数据库更加完整和丰富,能够比对出更多成分。因而建立更加完善的胡蜂蜂毒成分数据库,有利于充分揭示胡蜂蜂毒成分。
即使比对数据库不完整,本研究仍然发现胡蜂蜂毒和西方蜜蜂蜂毒成分组成存在差异。已有的研究表明,蜜蜂蜂毒中蜂毒肽含量约占50%
[20,13,11],本研究测定结果与已有研究结果一致,同样发现西方蜜蜂蜂毒中含有大量的蜂毒肽,而在胡蜂蜂毒中未检测到这些物质
[21]。除此之外,西方蜜蜂蜂毒中包含大量磷脂酶A2,而胡蜂蜂毒中则为磷脂酶A1。虽然两者同为磷脂酶,但分子结构不同。蜜蜂蜂毒和胡蜂蜂毒成分含量的差异,可能表明它们引起过敏的机理存在差异。为探究胡蜂蜂毒的生理功能,有必要进一步研究蜂毒成分的空间结构特征及引起的生理功能差异。胡蜂蜂毒特有成分,表明胡蜂具有更广阔的开发和应用空间,值得深入研究。
4种蜂毒的氨基酸含量存在差异。胡蜂蜂毒部分氨基酸含量高于蜜蜂蜂毒,但另一些氨基酸含量低于蜜蜂蜂毒。总体来看,4种蜂毒单位质量的氨基酸含量差异不大。雷达图进一步表明,4种产毒蜂氨基酸总量相似。
除成分差异外,4种蜂毒重要成分的活性同样存在差异。比如,蜜蜂蜂毒中磷脂酶A和透明质酸酶的活性高于胡蜂蜂毒的活性。由于蜜蜂蜂毒含磷脂酶A2,而胡蜂蜂毒为磷脂酶A1,两种酶的分子结构并不一致,因而它们的活性可能存在差异。由于磷脂酶A促使红细胞及其他细胞膜破裂
[11],因而推测蜜蜂蜂毒比胡蜂蜂毒更容易引起细胞溶血或坏死。同理,透明质酸酶分子结构在蜜蜂蜂毒和胡蜂蜂毒中同样存在差异,因而存在活性差异。
蜂毒中的5-羟色胺和组胺等小分子多肽能引起动物强烈致痛感。由于胡蜂中5-羟色胺的含量远远高于蜜蜂中5-羟色胺含量,因而被3种胡蜂螯刺后,会有比蜜蜂更强的疼痛感。同时,5-羟色胺也是一种过敏原,引起细胞内的过敏反应,因而被胡蜂螯刺后,会有比蜜蜂更严重的过敏症状,比如在皮肤上形成更大的风团等。因此,在利用胡蜂时也需要考虑其可能存在的风险。
由于人们对蜜蜂蜂毒具有深入了解和认识,在中医和民族医学中受到重视,临床上也多运用蜜蜂蜂毒治疗疾病。然而,由于人们对胡蜂蜂毒的成分和功能认识的局限,目前中国仅有少部分人(如云南景颇族)运用胡蜂蜂毒开展治疗。本研究表明,胡蜂蜂毒和蜜蜂蜂毒的成分、含量和活性存在显著性差异,有必要开展更多的研究,以评估胡蜂蜂毒在医药、保健以及其他行业中的应用潜力和开发价值。
云南省中青年学术和技术带头人后备人才项目(202405AC350077)
云南省基础研究计划项目(202401AS070015)
云南省基础研究计划项目(202301AT070432)