过表达山豆根StLDC基因对烟草生物碱含量的影响

Effect of overexpression of StLDC gene from Sophora tonkinensis on alkaloid content in tobacco

摘要

赖氨酸脱羧酶（lysine decarboxylase，LDC）基因是喹诺里西啶类生物碱生物合成途径的首个关键酶基因。为探究山豆根StLDC基因的生物学功能，在获得其全长序列的基础上，构建了StLDC的过表达载体pBWA（V）HS-StLDC，并通过农杆菌介导法转化K326烟草。对获得的转基因阳性植株进行分子与代谢分析显示，qRT-PCR证实StLDC在烟草中成功过表达；高效液相色谱-电喷雾串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）检测表明，转基因植株中苦参碱与氧化苦参碱含量极显著升高，其中苦参碱含量最高为野生型的29.11倍，氧化苦参碱含量最高为野生型的69.43倍。综上认为，StLDC基因能够显著提高烟草中苦参碱和氧化苦参碱含量，为培育生产高生物碱含量的山豆根提供了重要的基因资源。

Abstract

Lysine decarboxylase （LDC） is the first key enzyme gene in the biosynthetic pathway of quinolizidine alkaloids. Based on the obtained full-length sequence of StLDC gene from Sophora tonkinensis， an overexpression vector， pBWA（V）HS-StLDC， was constructed. This vector was subsequently introduced into K326 tobacco via Agrobacterium-mediated transformation to elucidate the biological function of StLDC. Molecular and metabolic analyses of the obtained transgenic plants revealed that qRT-PCR confirmed the successful overexpression of StLDC in tobacco. High performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass/mass spectrometry （HPLC-ESI-MS/MS） detection indicated that the contents of matrine and oxymatrine in transgenic plants were significantly higher than those in wild-type （WT） plants， with the highest matrine content reaching 29.11 times and the highest oxymatrine content reaching 69.43 times that of the WT. These results indicate that the StLDC gene can significantly increase the contents of matrine and oxymatrine in tobacco， providing important genetic resources for the cultivation of plants with high alkaloid content， especially S. tonkinensis.

Graphical abstract

关键词

山豆根 / 赖氨酸脱羧酶基因 / 生物碱 / 功能验证

Key words

Sophora tonkinensis Gagnep. / lysine decarboxylase gene / alkaloids / functional verification

0 引 言

山豆根是广西著名的道地药材和常用中药，又称广豆根，为豆科（Fabaceae）植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）的干燥根和根茎，味苦，寒，具有清热解毒和消肿利咽的功效^［1］。其药效物质基础主要为喹诺里西啶类生物碱（苦参碱、氧化苦参碱等）及异戊烯基黄酮类成分^［2］。现代药理研究表明，山豆根具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等生物活性^［3］，且其活性成分苦参碱对多发性硬化症、阿尔茨海默症等神经系统疾病具有潜在的治疗作用^［4］。随着市场需求持续增长，野生山豆根资源因过度采挖而日趋枯竭，人工栽培又面临有效成分含量不稳定、质量可控性差等问题，导致优质药材供应日趋紧张。基于此，采用合成生物学策略，在模式植物或微生物底盘中对苦参碱等关键药效成分进行异源重构与高效合成，有望缓解资源压力并保障药材的可持续供应。

喹诺里西啶类生物碱是一类源自L-赖氨酸的次生代谢产物，其生物合成途径已初步阐明。该途径起始于赖氨酸脱羧酶（lysine decarboxylase，LDC）催化的第一步关键反应：LDC将L-赖氨酸脱羧，生成中间体尸胺；随后，尸胺在铜胺氧化酶（copper amine oxidase，CAO）的作用下，氧化为5-氨基戊醛，并经过一系列自发或酶促的环化、修饰步骤，最终形成苦参碱、氧化苦参碱等产物^［5-6］。LDC被公认为该合成途径的起始限速酶。多项研究表明，LDC基因在不同物种的生物碱合成中具有重要功能，如花榈木OhpLDC^［7］、蛇足石杉HsLDC⁃L1^［8］、桑树MaLDC^［9］、黑胡椒PnLDC^［10］等基因均被证实参与生物碱的生物合成。此外，过表达CgLDC能够正向调控石杉碱甲生物合成基因的表达^［11］；苦豆子SaLDC基因的表达量与氧化苦参碱的积累量呈正相关^［12］，这些都强有力地提示了LDC基因在调控生物碱合成中的核心作用。

课题组前期构建了干旱胁迫下山豆根转录组数据库，并从中筛选出7个编码LDC酶的Unigenes，其中Unigene（c87510.graph_c0）的表达在干旱胁迫下显著上调，且其表达模式与同期检测到的苦参碱和氧化苦参碱含量呈正相关^［13］。为进一步解析该基因在山豆根生物碱合成中的功能，课题组以c87510.graph_c0序列为基础，通过RT-PCR克隆获得其全长编码序列，命名为StLDC，并对其编码蛋白进行了系统的生物信息学分析^［14］。本研究在此基础上，成功构建了StLDC的过表达载体pBWA（V）HS-StLDC，将其遗传转化至模式植物烟草K326中，进一步研究StLDC基因在喹诺里西啶类生物碱生物合成中的功能及其对苦参碱和氧化苦参碱含量的影响。通过分析过表达StLDC基因的烟草植株中苦参碱和氧化苦参碱的含量变化，验证StLDC基因在促进生物碱合成与积累中的功能，为通过基因工程手段改良药用植物提供新的基因资源。

通过解决上述关键问题，本研究旨在为山豆根中喹诺里西啶类生物碱的生物合成机制提供新的见解，并为相关药用植物的遗传改良和活性成分的高效生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料山豆根和烟草K326（Nicotiana tabacum L.cv.K326）由广西药用植物园广西药用资源保护与遗传改良重点实验室提供。

1.2 主要仪器与试剂

① 主要仪器：基因扩增仪（A48141，Eppendorf）、通用电泳仪电源（JY300C，Thermo Fisher）、离心机（Thermo Sorvall ST16R，Thermo Fisher）、超微量紫外可见分光光度计（Q6000，Nano drop）、超净工作台（BCM-1300-A，苏州安泰）、高效液相色谱仪（LC-30AD，日本岛津）、Qtrap6500质谱仪（SCIEX-Qtrap6500，美国AB）等。

② 主要试剂：大肠杆菌DH5α菌株、根癌农杆菌GV3101感受态细胞、2×BioRun Magic PCR Mix、2×Biorun Pfu PCR Mix、BioRun Seamless Cloning Kit、MS培养基、Magic Ruler DNA marker、2×Taq PCR Mix等均购买于武汉伯远生物科技有限公司；标准品苦参碱（货号BWC9032-2016，纯度≥98%）、氧化苦参碱（货号110780，纯度≥98%）购自北方伟业计量集团有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 pBWA（V）HS⁃StLDC表达载体的构建

用带有BsaI和Eco31I酶切位点的StLDC基因引物（正向引物：CAGTGGTCTCACAACATGCCTACACTAGTAACTGA；反向引物：CAGTGGTCTCATACATGGTTTAGGTGTTGCAAAAC）扩增山豆根总cDNA，PCR产物经电泳检测与目标基因片段大小符合后进行胶回收，并与BsaI和Eco31I双酶切后的过表达载体pBWA（V）HS连接，然后转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞。使用引物（正向引物：GACTTTGCAACATGCCTACACT，反向引物：GAGTCAAACGTTGTAACGTTGA）对单菌落进行PCR验证，将阳性克隆进行测序，将测序正确的载体质粒转入农杆菌GV3101中。

1.3.2 转基因烟草的获取

采用农杆菌介导叶盘法将pBWA（V）HS-StLDC过表达载体转化至烟草叶片。挑取农杆菌于侵染液中，制备OD₆₀₀=0.2的农杆菌重悬液，将预培养2~3 d的烟草叶片接种于农杆菌悬浮液中侵染10~15 min，将侵染后的烟草叶片在滤纸上晾干，接种于共培养基上，暗培养48~72 h。将共培养后的叶片转入诱导培养基上诱导愈伤组织，培养约10 d。挑选能够持续增殖、颜色浅绿、质地致密的愈伤组织转移到对应该抗性的筛选培养基上，培养时间15~30 d，温度：（23±2） ℃；将经过筛选后的愈伤组织转入分化培养基上，每个培养皿4~5个愈伤组织，23 ℃ 光照培养15~30 d；分化过程中，愈伤组织如有幼苗形成，将其接种至根诱导培养基上生长。

1.3.3 转基因烟草的分子鉴定

提取再生烟草叶片的基因组DNA，以pBWA（V）HS-StLDC载体质粒为阳性对照，野生型（WT）烟草叶片DNA为阴性对照，进行PCR鉴定。从每个独立转化株系中采收成熟的转基因种子，播种于含潮霉素的固体培养基上继续筛选至T₂代。阴性对照：以未插入目的片段的空载体转基因烟草为阴性对照。

1.3.4 转基因烟草StLDC表达量测定

利用Trizol法提取烟草总RNA，并使用DNase I处理以去除可能的基因组DNA污染。以Actin为内参基因（正向引物：CGGAATCCACGAGACTACATAC；反向引物：GGGAAGCCAAGATAGAGC），使用引物（正向引物：ACTGGAACTTGATGATTGGCTTGTC；反向引物：AGGTAGGTAGCGATAGCAGAAGTG）进行qRT-PCR检测转基因烟草株系及K326野生型烟草（WT）幼苗StLDC基因的表达水平。采用2^–ΔΔCT方法计算StLDC基因的相对表达量。所有样品各重复3次。

1.3.5 转基因烟草苦参碱和氧化苦参碱含量测定

取生长至8~10片真叶期的转基因及野生型烟草植株的全株，利用高效液相色谱-电喷雾串联质谱（high performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass/mass spectrometry，HPLC-ESI-MS/MS）方法对目的基因StLDC表达水平较高的烟草植株的苦参碱和氧化苦参碱含量进行定量分析，用岛津LC-30AD高效液相色谱仪串联AB公司Qtrap6500质谱仪，测定烟草苦参碱和氧化苦参碱含量。准确称取0.1 g样品，加入10 mL样品提取液（三氯甲烷∶甲醇∶浓氨试液=40∶10∶1，V/V/V），静置30 min，超声提取30 min；12 000 g离心5 min，取上清5 mL；真空离心浓缩至干，加入0.6 mL甲醇（色谱纯）复溶；过0.22 μm滤膜，放入-20 ℃冰箱备用。

液相条件：poroshell 120 SB-C18反相色谱柱（2.1 mm×150 mm，2.7 μm），流动相A为甲醇，流动相B为甲酸水溶液。梯度洗脱程序见表1，流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL，柱温：30 ℃。

电喷雾电离质谱（ESI-MS/MS）的分析条件（表2）：ESI正离子模式分别监测；扫描类型：MRM；气帘气：35 psi；喷雾电压：+5 500 V；雾化气压力：50 psi；辅助气压力：55psi；雾化温度：500 ℃。所有样品各重复3次。

1.4 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2019和SPSS19.0软件对数据进行分析处理，数据均为平均值±标准误差。

2 结果与分析

2.1 过表达载体pBWA（V）HS-StLDC的构建与鉴定

通过PCR扩增、酶切连接成功构建了重组表达载体pBWA（V）HS-StLDC。菌液PCR验证结果显示（图1），阳性克隆可扩增出与预期大小相符的特异性条带。测序结果进一步证实了StLDC基因的正确插入和阅读框的完整性。

2.2 转StLDC烟草苗的筛选和鉴定

利用烟草成熟的遗传转化体系获得转基因烟草植株，PCR鉴定结果如图2所示，转基因植株扩增出一条约1 400 bp的特征条带，与阳性对照一致；野生型烟草（阴性对照）未扩增出该特征条带，初步证明外源基因StLDC已成功整合到烟草基因组中。PCR鉴定共获得10株阳性植株。

qRT-PCR检测结果显示，10株转基因烟草植株中StLDC基因均成功表达。由于野生型（WT）烟草中StLDC的本底表达量极低（Ct值>30），基于2^–ΔΔCT法计算的相对表达量在不同转基因株系间差异较大。统计分析表明，所有过表达株系（OE-1~OE-10）中StLDC基因的表达水平均较WT有极显著升高（P<0.01），其中OE-7株系的表达量上调最为显著（图3）。这一结果证实了过表达载体在烟草中的成功整合。

2.3 转基因烟草苦参碱和氧化苦参碱含量测定

选取目的基因表达量最高的5个StLDC过表达株系OE-3、OE-5、OE-7、OE-8和OE-9，以及野生型烟草（WT）进行苦参碱和氧化苦参碱含量测定，结果如表3所示。

StLDC转基因烟草OE-3、OE-5、OE-7、OE-8、OE-9的苦参碱含量分别是野生型植株（WT）的7.26倍、1.41倍、29.11倍、2.26倍、1.81倍；氧化苦参碱含量分别是野生型植株（WT）的13.63倍、1.67倍、69.43倍、2.20倍、2.51倍；此结果说明过表达StLDC基因可以提高植物苦参碱和氧化苦参碱含量。

3 讨 论

3.1 LDC在喹诺里西啶类生物碱生物合成途径中的重要生物学功能

山豆根是中国喀斯特山区代表性药用植物，其抗肿瘤、抗肝损伤、增强免疫力等药理活性已获研究证实^［15］。其中，喹诺里西啶类生物碱作为其关键活性成分，在代谢工程领域备受关注。LDC是喹诺里西啶类生物碱生物合成途径中的起始酶与关键限速步骤^［16-18］。本研究构建了pBWA（V）HS-O-StLDC过表达载体，将山豆根来源的StLDC基因导入烟草中实现异源表达，并通过分子与代谢分析证实，StLDC的过表达显著促进了烟草中苦参碱与氧化苦参碱的积累（如OE-7株系中苦参碱含量提升至野生型的29.11倍）。这一结果与已有研究类似：在苦豆子中，SaLDC的表达与喹诺里西啶类生物碱积累呈正相关^［19］；在狭叶羽扇豆中，检测到的所有喹诺里西啶类生物碱均能通过前体L-赖氨酸合成^［20］，沉默LaLDC显著抑制其生物碱合成^［21］；在通常不产生尸胺的拟南芥中异源表达LaLDC，也能观察到尸胺及其衍生物的产生^［22］。本研究进一步证实了LDC在喹诺里西啶类生物碱生物合成中具有不可替代的核心地位。

3.2 外源遗传转化在药效物质生物合成中的重要作用

外源遗传转化技术为突破传统植物提取法的局限性（如低含量、长周期和气候敏感性）提供了根本解决方案^［23］。该技术通过将完整的生物合成途径导入工程微生物（如大肠杆菌、酵母）或模式植物体系，能够构建稳定、可控的替代生产平台，这在青蒿素^［24］、紫杉醇^［25］和糖苷^［26］的可持续生产中已得到证实。同时，该技术为关键生物合成元件的发掘与功能验证提供了直接工具。例如，从绞股蓝中鉴定的糖基转移酶GpUGT74A1，通过在大肠杆菌中异源表达验证了其催化功能，为稀有人参皂苷合成提供了新元件^［27］。类似地，通过在大豆毛状根中表达LsSAT2基因，明确了其对含硫代谢的调控作用^［28］，这些研究丰富了合成生物学所需的遗传工具库。此外，外源遗传转化还可通过导入抗逆基因，增强生产体系抵御环境波动的能力，从而保障其在非生物胁迫下的稳定性。例如，在模式植物中表达耐盐基因CrPDC1^［29］、耐镉基因BvHSP18.2^［30］或抗旱基因SaPEPC2^［31］，均可显著提高宿主对非生物胁迫的耐受性，为在逆境条件下保障生物合成稳定性或培育抗逆药用资源奠定了基础。本研究通过外源遗传转化技术，在烟草中构建了源自山豆根的喹诺里西啶类生物碱生物合成途径，结果表明，烟草内源性酶系统能够有效支持从尸胺至苦参碱的下游转化过程。这与Bagni等^［32］在光烟草中检测到LDC及其产物尸胺的研究结果相一致，共同证实了模式植物底盘在承接并延伸外源代谢途径方面具有显著潜力。

3.3 研究局限与未来展望

本研究通过异源表达验证了StLDC基因在植物体内合成喹诺里西啶类生物碱的功能，但对其酶学性质的解析尚需在更受控的体外系统中完成。在原核或酵母系统中进行StLDC蛋白的体外表达与酶动力学分析，是直接验证其催化活性、测定关键酶学参数的有力证据，这将使基因功能的解析更为严谨和深入^［33-34］。因此，后续工作的首要方向是完成该蛋白的体外生化表征。未来研究可进一步采用合成生物学策略，在微生物中构建并优化该生物碱合成途径。通过融合共表达网络分析^［35-36］与人工智能辅助的代谢工程^［24］，有望实现从基因到产品的全链条精准设计与高效生产。

4 结 论

本研究通过将StLDC过表达载体转化至K326烟草中，成功筛选出阳性植株。结果显示，StLDC的过表达显著促进了烟草中苦参碱及氧化苦参碱的生物合成与积累。本研究不仅深入阐述了StLDC在生物碱合成途径中的关键调控作用，还为提升山豆根生物碱的高效生产提供了新的遗传资源。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82560744)

广西自然科学基金项目(2023GXNSFAA026487)