巨桉PIF基因家族的鉴定及表达模式分析

Identification and expression pattern analysis of the PIF gene family in Eucalyptus grandis

摘要

光敏色素作用因子（phytochrome interacting factors，PIFs）是bHLH家族中的关键转录因子。目前，PIF基因已在拟南芥、玉米、油菜等植物中得到了广泛的研究，已证实其在植物生长发育、光反应及逆境响应过程中具有重要作用。然而，巨桉（Eucalyptus grandis）中PIF基因家族成员的系统鉴定与分析尚未报道。对桃金娘科速生树种巨桉PIF家族基因的特征和进化进行了研究，从巨桉中鉴定出10个巨桉PIF基因（EgPIF1~EgPIF10），编码的氨基酸数量为405~660 aa，分子质量范围为44.6~70.0 kDa，等电点（pI）为5.41~8.73；染色体定位分析显示，EgPIF不均匀地分布在4条染色体上。多序列比对结果表明，EgPIF均存在bHLH保守结构域；启动子区域分析表明EgPIF基因含有光响应元件。分析了EgPIF基因在茉莉酸甲酯、氯化钠和水杨酸处理下的表达模式，结果显示，EgPIF1⁃3/5在不同的处理下一直表现出较高的表达水平，表明其在应对各种逆境中发挥重要作用。上述研究结果可为进一步探究EgPIF基因家族成员在巨桉的生长发育调控和信号转导通路中的功能奠定基础。

Abstract

Phytochrome-interacting factors （PIFs） are key transcription factors belonging to the bHLH family. Currently， PIF genes have been extensively studied in plants such as Arabidopsis thaliana， maize（Zea mays L.）， and rapeseed（Brassica napus L.）， and their crucial roles in plant growth and development， photoresponse， and stress adaptation have been well established. However， systematic identification and analysis of PIF gene family members in Eucalyptus grandis have not yet been reported. This study investigated the characteristics and evolution of the PIF gene family in E. grandis， a fast-growing species of Myrtaceae family. A total of 10 E. grandis PIF genes （EgPIF1-EgPIF10） were identified， encoding proteins ranging from 405 to 660 amino acids in length， with molecular weights between 44.6 and 70.0 kDa and isoelectric points （pI） ranging from 5.41 to 8.73. Chromosomal localization analysis revealed that EgPIFs are unevenly distributed across four chromosomes. Multiple sequence alignment indicated that all EgPIFs contain the conserved bHLH domain. Promoter region analysis demonstrated that EgPIF genes contain light-responsive cis-elements. Expression patterns of EgPIFs under methyl jasmonate （MeJA）， sodium chloride （NaCl）， and salicylic acid （SA） treatments were analyzed. The results showed that EgPIF1， EgPIF2， EgPIF3， and EgPIF5 consistently exhibited relatively high expression levels under different treatments， suggesting their important roles in responding to various stresses. These findings lay a foundation for further investigation into the functions of EgPIF gene family members in regulating growth and development and signal transduction pathways in E. grandis.

Graphical abstract

关键词

巨桉 / EgPIF基因家族 / 生物信息学 / 全基因组鉴定

Key words

Eucalyptus grandis / EgPIF gene family / bioinformatics / genome-wide identification

0 引 言

光合作用对植物的生长发育起重要作用。光作为重要的环境信号，以错综复杂的方式调控植物多项生理功能，包括信号转导和激素调节^［1］。大量研究表明，植物可以通过多样化的光受体捕捉并整合光信号，实时监测光合产物的时空分布动态，从而精准协调源-库关系与能量分配^［2］。在形态建成层面，植物分化出光形态发生和暗形态发生^［3］，二者均由植物内在遗传模块与外部环境信号的相互作用共同调控^［4］。转录因子是植物基因表达调控的核心，转录因子家族成员的系统鉴定是解析基因调控网络、阐明植物对内外源信号响应分子机制的关键，更是挖掘功能基因、解析性状调控规律的重要基础，对深入揭示植物生长发育与逆境适应的分子机制具有重要的理论与实践价值。

光敏色素相互作用因子（phytochrome interacting factors，PIF）是bHLH转录因子家族中的重要亚家族成员^［5］。作为植物生长发育调控中的关键因子，PIF不仅能显著影响植物生长发育进程，协调各类生理反应，而且在光感受器调控的光介导响应中扮演核心角色^［6］。此外，PIF还广泛参与其他基因家族的协同互作。其中，PIF与SPL（SQUAMOSA-promoter binding protein-like）基因家族的互作尤为重要：二者在抑制植物分蘖与分枝过程中协同发挥关键作用，共同调控植物的生长发育模式^［7］。

在PIF基因家族成员的功能机制研究中，已有证据表明，PIL1（PIF3⁃like 1）与PIF1、PIF3、PIF4、PIF5发生相互作用，进而抑制PIF直接靶基因的转录过程，形成PIF家族内部的调控网络^［8］。在远红光响应中，PIF3具有特殊的调控作用，其通过光敏色素-GAL4-DNA结合域融合蛋白与PIF3-GAL4-激活域融合蛋白的协同作用实现。当植株受到红光照射时，两类融合蛋白互作诱导含Gal4 DNA结合位点的启动子表达，从而启动下游光响应通路^［9］。此外，在昼夜循环周期中，PIF3的活性还受光感受器的快速且可逆的调节，以适应环境光信号的动态变化^［10］。同时，PIF3也是CBFs-PIF3-phyB通路中的关键调控组件，参与调控植物对低温胁迫的响应，提高植株的抗寒性^［11］。作为光信号和温度信号的核心调节因子，PIF4协同处理这两种信号，调控植物暗形态建成、光形态建成和热形态建成^［12］。已有研究表明，PIF4在保卫细胞（GCPIF4）中过表达可以显著降低植物蒸腾作用，进而逆转pif4突变体的高蒸腾表型^［13］。除此之外，PIF4还调节植物生长发育进程^［14］，并在植物适应逆境胁迫中发挥关键作用^［15］。在PIF基因家族成员中，PIF4和PIF5共同参与对光信号的精确控制，通过协同作用促进光诱导的形态发生过程^［16］；而PIF6则在种子发育阶段呈现高丰度表达特征^［17］。

巨桉（Eucalyptus grandis）隶属于桃金娘科桉属^［18］，其特点是生长迅速、产量高、有显著的药用价值和木材纤维价值，对经济景观具有重大贡献^［19］。对林木中关键转录因子家族进行全基因组鉴定，是挖掘物种特异调控基因，解析其生长发育与抗逆性分子调控机制的重要途径，更是实现林木定向遗传改良以及提升其产量与抗逆性能的重要基础。PIF基因家族在植物生长发育调控、激素信号转导和逆境胁迫响应等方面发挥核心作用，且该家族已在拟南芥、烟草、玉米等模式植物中完成鉴定。目前，巨桉EgPIF基因家族的基因组鉴定、表达模式分析及其作用机理仍未见报道。本研究基于巨桉基因组，对EgPIF基因家族进行生物信息学分析，包括EgPIF基因家族成员的鉴定、理化性质分析、染色体定位、保守基序分析、系统进化树、蛋白质结构预测和启动子顺式作用元件分析，同时，分析不同处理下EgPIFs基因的表达模式。本研究成果为深入解析EgPIFs在巨桉生长发育和逆境响应中的生物学功能奠定基础，也为巨桉分子育种提供潜在的基因靶点和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本试验所使用的植物材料是巨桉无性系GL1。

1.2 实验方法

1.2.1 EgPIF基因家族成员的鉴定

基于已报道的拟南芥PIF家族鉴定结果，从拟南芥数据库TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）下载拟南芥AtPIFs蛋白序列，从phytozome数据库（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）下载巨桉全基因组序列以及GFF3和FASTA文件。

本研究以拟南芥PIFs蛋白序列为参考，利用TBTools软件BLAST与巨桉基因组进行序列比对，使用基因结构可视化工具排除过长或过短的外显子，确定巨桉PIF基因家族的成员及其数量。

1.2.2 EgPIF基因家族成员的理化性质分析

使用ExPASy网站（https：//web.expasy.）提供的ProtParam工具分析了巨桉PIF家族成员的分子量大小、等电点和不稳定系数等理化性质。

1.2.3 EgPIF基因家族成员的系统发育树构建

选择了小立碗藓（Physcomitrella patens）、江南卷柏（Selaginella moellendorffii）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）与巨桉EgPIFs进行了序列比较和序列相似性分析。使用TBTools软件筛选这4个物种的同源蛋白质，用最大似然法（ML）构建系统发育树。通过iTOL（https：//itol.embl.de/）网站对所得到的进化树进行可视化展示。

1.2.4 EgPIF基因家族成员染色体位置和分布可视化

从巨桉基因组GFF3注释文件中提取基因染色体定位信息及染色体物理长度数据，使用Tbtools软件对EgPIFs基因在巨桉染色体上的分布进行定位分析并可视化展示。

1.2.5 EgPIF基因家族成员保守结构域序列及motif分析

通过批量检索从NCBI中获得了PIF基因的保守结构域。使用MEME网站分析EgPIFs蛋白序列的保守基序。使用TBTools软件进行可视化。

1.2.6 EgPIF基因家族成员共线性分析

使用Tbtools软件中的one step McscanX插件，对EgPIFs基因与拟南芥和青甘杨（Populus przewalskii Maxim.）之间进行共线性分析及可视化。

1.2.7 EgPIF基因家族成员顺式作用元件预测

使用Tbtools软件中的GXF序列提取EgPIF家族成员起始密码子（ATG）上游2 000 bp作为EgPIF基因家族成员的启动子序列，然后将序列提交到PlantCare网站（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测顺式作用调控元件，将预测结果导入Tbtools软件的Simple BioSequence Viewer工具进行可视化。

1.2.8 EgPIF基因家族成员表达模式分析

通过ePlant（https：//bar.utoronto.ca/eplant_eucalyptus/）网站获取巨桉PIF家族成员在各组织部位的表达情况，结合1月龄的根、茎、叶组织；3年树龄的器官（幼叶、成熟叶、花）和组织（侧枝、韧皮部）；6年树龄的组织（木质部、韧皮部）的转录组数据，对EgPIFs基因进行表达模式分析。

在激素和胁迫试验中，激素处理包括在叶片上喷洒100 μmol/L水杨酸和茉莉酸甲酯，胁迫处理为使用200 mmol/L氯化钠浇灌植株。随后，在处理后0、1、6、24和168 h对处理后的植物材料进行采样。使用TBTools软件对水杨酸、茉莉酸甲酯和盐胁迫处理0、1、6、24和168 h的植物材料进行差异表达分析，并利用TBTools热图功能对转录组数据进行对数归一化处理。

1.2.9 EgPIF基因家族成员蛋白结构预测

采用SOPMA工具预测二级结构中ɑ-螺旋与β-折叠的比例分布，并通过SWISS-MODEL在线网站（https：//swissmodel.expasy.org/）分析EgPIFs的保守基序，并预测其蛋白三级结构。

2 结果与分析

2.1 EgPIF基因家族成员鉴定及理化性质分析

在本研究中，以拟南芥8个PIF家族成员（即AtPIL1、ATPIF1和AtPIF3~8）蛋白序列作为源序列^［20-22］，通过BLAST鉴定，共获得98个巨桉候选序列。根据拟南芥PIF基因保守结构域和巨桉的基因结构，进一步鉴定了巨桉PIF基因，并根据筛选顺序将其命名为EgPIF1~10。

通过ExPaSy分析EgPIFs蛋白序列的氨基酸理化性质（表1）。结果表明，EgPIFs蛋白的氨基酸数量在405~660 aa；分子质量为44.6~70.0 kDa；等电点最小值为5.41（EgPIF6和EgPIF7），最大值为8.73（EgPIF8）。其中EgPIF5的氨基酸长度为405，蛋白质相对分子质量为44.6 kDa，是家族中结构最为精简的成员。EgPIF3、EgPIF8、EgPIF9、EgPIF10的等电点大于7.0，属于碱性氨基酸；EgPIF1、EgPIF2、EgPIF4、EgPIF5、EgPIF6、EgPIF7的等电点小于7.0，属于酸性氨基酸。蛋白不稳定系数在47.46（EgPIF6、EgPIF7）~67.85（EgPIF8），表明EgPIFs的稳定性较差。脂肪族氨基酸指数范围在53.85（EgPIF9）~63.32（EgPIF6、EgPIF7），具有较强的溶解性。EgPIFs的平均亲水系数为负数，表明蛋白质具有亲水特征。EgPIF1与EgPIF2的理化性质高度一致，EgPIF6与EgPIF7也呈现完全相同的理化特征，这种一致性可能与其在系统进化关系中的亲缘关联性相关，暗示其可能具有相似的生物学功能。

2.2 EgPIF基因家族成员系统发育树分析

为研究PIF的进化特征，对不同植物的PIF家族进行了遗传分析，其中包括小立碗藓、江南卷柏、拟南芥和巨桉，共同构建了PIF基因家族成员的多物种进化树（图1）。结果显示，PIF进化树分为4个分支（I~Ⅳ）。分支I包括EgPIF1~5和AtPIF5，表现出相近的系统发育和相似的生理特性。分支Ⅱ由EgPIF8~9、SmPIF1~3和PpPIF1~7组成，涵盖了江南卷柏和小立碗藓的整个PIF基因家族，表明了它们在进化过程中的亲缘关系和极端分化。分支Ⅲ包括EgPIF6~7/10和AtPIL1、AtPIF4，表明EgPIF6~7/10可能具有与AtPIL1和AtPIF4类似的功能。分支Ⅳ包括AtPIF1/3/6/7/8，表明与桉树PIF基因的亲缘关系较远，进化过程中的交集很小。

2.3 EgPIF基因家族成员的染色体定位分析

基因定位分析表明，巨桉PIF基因家族成员呈现不均匀的染色体分布模式，10个EgPIFs基因分布在4条染色体上（01、02、04、11）（图2）。EgPIF1/2/3/5在01号染色体上共享一个共同的染色体位置，显示出高的基因密度。EgPIF6/7位于02号染色体上的同一位置，具有基因含量较低的特点。整个PIF基因家族都位于各自染色体的下段。

2.4 EgPIF基因家族成员的保守基序和保守结构域分析

使用MEME在线网站对10个EgPIF基因进行保守基序分析，将获得的保守基序记为Motif 1~Motif 10（图3），发现Motif1与Motif3在所有EgPIF基因中均有分布，据此推测这两个基序是EgPIF基因家族的核心保守基序，EgPIF1、EgPIF2和EgPIF3包含全部10个Motif，保守元件完整性最高。

经TBTools验证，10个EgPIF蛋白均含有bHLH保守结构域。系统发育分析表明，分属两个不同分支的基因亚群（EgPIF1~3/5与EgPIF6~7）具有密切的进化关系，且二者在基序组成模式与外显子长度上表现出显著相似性，提示这两个亚群可能具有相似的生物学功能。此外，UTR分析显示，所有EgPIFs成员均含有3'UTR区，仅EgPIF3含有1个UTR，其余9个EgPIF基因均完整包含2个UTR区域，这一差异可能与EgPIF3的基因表达调控特性相关。

2.5 EgPIF基因家族成员的共线性分析

共线性分析可以揭示物种间的亲缘关系，存在于共线性区域的基因越多，物种间的亲缘关系就越近。在拟南芥、巨桉、青甘杨间的共线性关系中（图4），巨桉01号染色体和04号染色体上的基因与拟南芥中的4个基因形成4对同源基因；而巨桉01号染色体、02号染色体和04号染色体上的基因与青甘杨上的6个基因共形成了6对同源基因，即巨桉和青甘杨之间存在6对共线性关系，由此说明巨桉和青甘杨之间的共线性关系更为紧密，且这些存在同源关系的基因之间可能在PIF基因家族的进化中发挥相似的重要作用。位于巨桉11号染色体的EgPIF8和EgPIF4在拟南芥和青甘杨中均未查找到共线性基因，其可能存在物种特异性的功能分化。

2.6 EgPIF基因家族成员顺式作用元件分析

使用PlantCARE对10个EgPIF基因上游2 000 bp的启动子区域的顺式作用元件进行系统分析，结果显示（图5），大多数EgPIF基因启动子区域含有与光响应相关的顺式作用元件，构成了光响应模块的一部分。此外，EgPIF基因启动子区域包含脱落酸、生长素和水杨酸等激素响应作用元件，以及参与生长发育、生长组织表达和防御应激相关的顺式作用元件。

值得注意的是，EgPIF6/7具有相同的功能元件。EgPIF1~3和EgPIF5虽关系密切，但EgPIF3具有不同的顺式作用元件，表明顺式作用元件和进化关系之间存在潜在的相关性，EgPIF3的差异可能是由进化过程中基因结构的变化引起的。

2.7 EgPIF基因家族成员的组织差异表达

本研究深入探讨了巨桉PIF基因家族在不同发育阶段的组织表达特异性，使用ePlant网站选取了巨桉PIF基因家族成员不同组织、不同发育阶段的基因表达数据，见图6（a）、（b）、（c）。转录组分析显示，1月龄的巨桉中，EgPIF1~3/5和EgPIF6~7在叶片和茎中高表达；在3年树龄的巨桉中，EgPIF6~7在韧皮部的表达量最高，EgPIF9/10在成熟叶和侧枝中的表达量达到高峰；而在6年树龄的巨桉中，EgPIF4/6/7在木质部和韧皮部中的表达水平最高。相反，其余基因的表达水平较低。

这些结果表明，EgPIFs在不同组织中发挥着关键作用，EgPIF6/7在植物的不同部位表现出一致的表达，突显了它们在桉树组织生长和发育中的重要性作用。其他基因在不同的发育阶段发挥组织特有的作用。

2.8 EgPIF基因家族成员的逆境差异表达

为了更深入地研究巨桉PIF基因家族的表达动态，并了解其对各种激素的响应，本研究对植物进行了不同的处理，包括茉莉酸甲酯、氯化钠和水杨酸处理，见图6（d）、（e）、（f）。结果显示，EgPIF1~3/5在不同的处理下与其他基因相比一直表现出更高的表达水平，表明其主要在应对各种逆境中发挥作用。相反，EgPIF8/9/10在不同的处理下均呈现低表达模式，提示该家族基因的转录表达未受这些逆境相关信号分子或胁迫条件的显著诱导，其可能未参与植株对相应逆境的响应过程。

2.9 EgPIF基因家族成员的蛋白结构预测

为了研究EgPIFs的蛋白结构，通过SOPMA平台预测巨桉PIF基因家族成员的二级蛋白结构，结果表明，巨桉PIF家族的蛋白序列主要由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链等结构元素构成（表2）。α-螺旋和无规则卷曲占据二级结构的主要部分，约占总体的99%；其中，α-螺旋占比为12.42%~21.21%，无规则卷曲占比最大，为78.55%~86.21%。延伸链占比则较小，为0.23%~1.66%，无β-折叠。进一步使用SWISS-MODEL预测10个PIF蛋白的三维结构。结果表明，EgPIF蛋白成员在三维空间折叠上存在差异（图7）。EgPIF4的结构呈现出相对延伸的形态，而EgPIF8则更趋于紧凑；EgPIF1与EgPIF2的结构整体较为相似，这种结构上的多样性可能与它们在巨桉生长发育过程中，响应光信号、调控不同靶基因表达等特定功能的分化密切相关，为后续深入探究各EgPIF蛋白具体的生物学功能提供了结构层面的依据。

3 讨 论

本研究借助生物信息学方法，在巨桉中成功鉴定出10个PIF基因。系统发育树显示，EgPIF与AtPIFs亲缘关系较近，部分基因存在同源性。EgPIF1~5和AtPIF5为同源基因。已有研究表明，AtPIF5能够通过降低光受体PhyB的丰度，负向调控红光诱导的下胚轴的伸长^［16］，同时还可以抑制红光诱导的启动子的活性^［15］。因此，推测EgPIF1~5也具有类似的功能。此外，在胁迫条件下，EgPIF1~5维持了较高的表达水平，这暗示其可能在巨桉抗逆过程中发挥作用。对于EgPIF6~7/10，系统发育分析表明它们与AtPIL1、AtPIF4属于同一亚类，由此推测它们可能具有相似的功能。AtPIF4负向调节拟南芥的向光性，直接刺激生长素相关基因的表达，并至少通过两种不同的机制促进开花^［23］，同时还是温度调节的关键因子^［24］。AtPIL1在拟南芥的稳定性和光形态发生中具有重要作用^［8］。综合这些研究结果，本研究推测EgPIF6~7/10也具有这一功能。

综合分析，EgPIF1~5、EgPIF6~7/10可能具有较高的功能相似性，且存在相互作用的可能性。先前的研究表明，AtPIF4/5可调节与生长素生物合成和反应相关基因的表达，从而促进植物生长，它们受CSU6转录和生物活性的负调控，进而促进光抑制下胚轴的伸长，并诱导拟南芥的叶片衰老^［25］；同时AtPIF4/5至少通过两种方式促进开花：在长日照中诱导FT表达，在短日照中以一种未知的机制作用于FT外^［23］。本研究还发现，EgPIF6及EgPIF7在韧皮部与木质部中持续高表达，其可能参与巨桉次生生长与物质运输的调控。然而，上述基因在巨桉中的具体作用机制尚未明确，有待进一步解析。此外，本研究主要依赖于生物信息学分析与公共转录组数据，启动子顺式作用元件预测尚未经过实验验证，且缺乏基因功能缺失或过表达、蛋白质互作等分子实验证据。因此，相关功能推断仍需后续实证支持。未来的研究可通过基因编辑等手段对关键EgPIF成员进行功能验证，在表型、生理及分子水平系统揭示其在光形态建成、逆境响应与生长发育调控中的作用，从而为巨桉分子育种与遗传改良提供理论基础与基因资源。

4 结 论

本研究通过多维度生物信息学分析，在巨桉基因组中成功鉴定出10个巨桉PIF基因，并对其进行了系统性解析。基因结构、基序和结构域分析表明，该家族具有高度保守性。顺式作用元件分析显示，EgPIF基因启动子区域除含有与光响应相关的顺式作用元件外，还含有激素响应作用元件、参与生长发育、生长组织表达和防御应激相关的顺式作用元件，表明其参与广泛的生物学过程。转录组分析进一步揭示，EgPIF1~3、EgPIF5基因存在较高的功能相似性。综上，本研究通过系统性的生物信息学分析，为巨桉PIF基因家族的功能验证提供了明确的候选基因与理论依据。

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基金资助

广东省基础与应用基础研究基金(2024A1515011209)

广州市科技计划项目(202201011282)