食品级底盘细胞的特性、改造策略与生物制造应用进展

Characteristics， engineering strategies， and biomanufacturing advances of food-grade chassis cells

摘要

面对人口激增、环境资源约束及营养健康和安全需求等多重挑战，食品工业亟待从传统生产向系统化、可持续的生物制造转型。食品合成生物学通过设计构建高效底盘细胞工厂，实现目标产物的精准合成，为未来食品开发提供新的路径。系统综述了食品合成生物学中常用底盘细胞的特性与改造策略，包括原核底盘细胞和真核底盘细胞，并重点阐述其在替代蛋白、功能性食品添加剂、营养强化剂及风味物质等领域的合成应用新进展。同时，还系统探讨了合成生物学在食品副产物高值转化、快速检测与溯源中的新兴应用。最后，针对当前食品级底盘细胞存在的代谢通络不清、底盘细胞性能不足等技术瓶颈，提出包括底盘细胞的理性设计、动态代谢调控、适应性进化、辅因子工程、蛋白质骨架技术、高通量筛选及人工多菌体系构建等系统策略，以期为食品合成生物学应用创新与产业化发展提供理论与实践参考。

Abstract

Facing multiple challenges such as population surges， environmental resource constraints， and demands for nutrition， health， and safety， food industry urgently needs to transition from traditional production to systematic and sustainable biomanufacturing. Food synthetic biology provides a innovative pathway for future food production by designing and constructing efficient chassis cell factories to achieve precise synthesis of target products. This article systematically reviews the characteristics and engineering strategies of commonly used chassis cells in food synthetic biology， including prokaryotic chassis cells and eukaryotic chassis cells， and highlights recent advances in the synthesis of alternative proteins， functional food additives， nutritional fortifiers， and flavor compounds. Furthermore， the emerging applications of synthetic biology in the high-value conversion of food by-products， rapid detection， and traceability are discussed. Finally， in response to current technical bottlenecks such as unclear metabolic networks and insufficient chassis cell performance， this article proposes systematic strategies including rational design of chassis cells， dynamic metabolic regulation， adaptive evolution， cofactor engineering， protein scaffolding， high-throughput screening， and artificial multi-strain systems. This review aims to provide theoretical and practical references for innovative development and industrial translation of food synthetic biology.

关键词

食品合成生物学 / 底盘细胞 / 细胞工厂 / 生物制造 / 功能性食品 / 代谢工程

Key words

food synthetic biology / chassis cells / cell factories / biomanufacturing / functional foods / metabolic engineering

0 引 言

食品工业是国民经济的支柱产业，2025年，中国食品工业总产值达约18.1万亿元，占GDP的12.9%。FAO预测，2050年全球人口将激增至97亿，食品总需求预计增长50%以上。面对人口激增、资源枯竭、环境承压以及健康营养需求等多重挑战，传统食品制造急需由“单一生产”向“系统构建”跨越。打造生物制造新增长引擎，培育生物制造产业是未来食品工业重要发展方向。食品合成生物学是在传统食品制造技术基础上，采用合成生物学技术，特别是食品微生物基因组设计与组装、食品组分合成途径设计与构建等，构建具有特定合成能力的新菌种，生产人类所需未来食品，核心是构建能高效合成目标产物的细胞工厂，关键技术包括高性能底盘细胞构建、食品配料或组分合成途径挖掘与设计、途径酶高效组装、代谢调控网络重构与优化、高产菌株高通量筛选等^［1］。目前，合成生物学食品级底盘细胞主要有原核底盘细胞与真核底盘细胞两类。原核底盘细胞主要包括大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）等，酵母底盘细胞分为常规酵母，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等和非常规酵母，如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）等两类。此外，还包括莱茵衣藻等真核微藻。食品级底盘细胞是安全高效和可持续食品制造的关键核心平台，在替代蛋白、功能性食品添加剂、食用色素、氨基酸、维生素、食品快检以及食品溯源等领域应用广泛^［1］。本文从食品合成生物学常见底盘细胞及其在替代蛋白质、功能性食品添加剂、食品营养强化剂、食品风味物质等合成领域新应用进行系统综述，以期为食品合成生物学高质量发展提供理论参考。

1 食品合成生物学常见底盘细胞

1.1 常见原核底盘细胞

大肠杆菌是第一个用于外源蛋白表达的原核底盘细胞，遗传背景清晰，易操作，成本低及抗污染能力强等优点，但缺失转录后加工、翻译后修饰等功能，存在易形成包涵体和产生内毒素等不足^［2］。基因组精简可提升产物合成稳定性，如用转座子介导的随机缺失对大肠杆菌MG1655进行基因组精简能显著增强耐受性^［3］。利用动态调控微调基因可实现细胞生长和产物合成精微平衡，改变密码子偏好性和适应性策略能显著增强菌株稳定性和产物合成稳健性。枯草芽胞杆菌具有强大的蛋白表达系统，动态代谢调控、酶组装、基因精确编辑可提升其代谢水平，在枯草芽胞杆菌中创建自主双调节系统可显著提升N-乙酰氨基葡萄糖生产效率，通过多靶点动态控制实现合成途径间代谢平衡^［4］。谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）无毒且遗传背景清晰，遗传元件（如启动子）挖掘、基于同源重组的单/双交换、位点特异性重组是其重要改造策略，利用同源重组技术删除基因组3个噬菌体片段获得精简菌株MB001，其转化效率和质粒拷贝数、生长情况和环境适应性均有显著改善^［5］。动态调控策略能平衡细胞代谢流并有利于产物合成，如通过耦合生长依赖型启动子及蛋白降解标签设计双功能遗传开关，实现细胞生长与γ-GABA代谢通量动态平衡^［6］。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）遗传背景清晰、代谢途径简洁且符合GRAS标准。精简基因能提升代谢产物量，通过缺失原噬菌体和基因组岛使乳酸乳球菌N8基因组减少6.9%，Nisin产量和转化效率显著提升^［7］。通过基因组规模代谢网络模型构建可精准预测代谢通量分布、优化代谢途径并进行代谢工程改造，通过CRISPR-Cas系统可多位点基因编辑，结合温度敏感质粒可快速筛选无外源DNA残留工程菌株或构建生物传感器检测产物合成。

1.2 常见真核底盘细胞

1.2.1 常规酵母底盘细胞

常规酵母是生理和遗传特性清楚且应用较早的酵母，如酿酒酵母和粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）。酿酒酵母表达系统是最重要的外源蛋白表达系统，对启动子、终止子等基因表达元件改造能增强细胞的遗传稳定性，增加基因拷贝数、优化密码子和动态调节代谢途径能显著增加目标产物产量。如通过基因敲除和融合不同短肽标签等消除限速步骤能使甜茶苷和莱鲍迪苷滴度分别达到1 368.6 mg/L和132.7 mg/L，为高糖饮食引发的健康问题提供糖替代品^［8］。辅因子改造能显著提升产量，对酿酒酵母系统设计3种辅助因子（FADH₂、S-adenosyl-L-methion和NADPH）的生物合成、区域化和循环，实现咖啡酸和阿魏酸高水平合成^［9］。粟酒裂殖酵母对维生素需求高，对氮源不敏感，对低水分活度（low water activity，Aw）、低pH、高温及SO₂具有较好耐受性，生长速率慢，但却是高发酵活力酵母。研究发现，粟酒裂殖酵母JM2-5不添加乙醇，30 ℃厌氧发酵9 d能合成乙酸乙酯（631.0 mg/L）、乳酸乙酯（86.0 mg/L）、己酸乙酯（25.0 mg/L）等风味物质，其胞内酯酶可通过酯化反应产生风味物质^［10］。

1.2.2 非常规酵母底盘细胞

非常规酵母是生理和遗传性还未完全清楚或认识较晚的酵母，能利用更丰富碳源、代谢产物多样化，不受克雷布特效应影响，目前仅少数基因改造非常规酵母成功用于食品生物合成。毕赤酵母（Komagataella phaffii）具有生长速度快、营养要求低、pH适应范围广、高密度发酵、异源蛋白表达高、胞外分泌能力强、可翻译后修饰和利用甲醇严格控制表达等优点，应用最广泛。通过人工改造获得序列更短、性能更强的启动子能实现其复杂代谢通路精准调控，目前有超过100种天然启动子和人工合成启动子，部分启动子（如P_ADH3 、P_G1 ）表现出较高启动子活性。终止子研究起步晚且进展较少，常用终止子是内源AOX1，基因终止子AOX1tt、酿酒酵母终止子ScCYC1tt被证明可应用于毕赤酵母表达系统，T_DH3tt、RPS2tt、RPP1Btt、RPS17Btt、IDP1tt、RPS25Att、RPS3tt、RPL2Att等新型终止子被证明效果较好^［11］。

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是GRAS级底盘细胞，有高效乙酰CoA代谢通路和TCA循环大通量。当前针对该底盘细胞的代谢工程改造遗传手段有限，编辑效率低、操作烦琐，缺乏高效整合位点、稳定高拷贝表达载体及可用启动子，但通过菌株筛选、代谢路径优化、产物抑制及发酵条件优化等可增强异源蛋白表达。对组成型强启动子UAS序列、核心启动子序列等元件进行优化组合可获得高活性启动子^［12］，诱导型启动子优选是重要策略，如P_POX2、P_POT1、P_LIP2、P_ALK1、P_EYK1 等^［11］。应用较多的碱性胞外蛋白酶基因启动子P_XPR2 属蛋白胨诱导型强启动子，另一个常用启动子是翻译延伸因子1-α基因启动子P_TEF，属组成型强启动子。此外还有系列内源性启动子，如P_TDH1、P_GPM1、P_FBAIN、P_POX2、P_POT1、P_LIP2、P_ICL1、P_YAT、P_GAP、P_ICL 和P_ACL2 等。人工杂合启动子如P_hp4d 是最常见组成型启动子，活性与P_XPR2 相近，组成型强杂合启动子P_UAS4B-TEF 也有应用。终止子常使用酿酒酵母终止子ScCYC1tt，其他内源终止子如XPRtt、Lip2tt应用也较为普遍^［11］。

乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）具有高密度发酵、生长快、异源蛋白分泌表达好、适度糖基化和杂蛋白少等优点，最常用的启动子是酿酒酵母组成型强启动子——磷酸甘油酸激酶基因启动子P_ScPGK 和诱导型强启动子——半乳糖透性酶基因启动子P_ScGAL1。P_KlPHO5、P_KlADH3、P_KlADH4、P_KlLAC4 及P_KlLAC4 突变体P_KlLAC4-PBI 等内源启动子也有应用^［11］。常用终止子是内源LAC4tt和酿酒酵母终止子如GPD1tt、ADH1tt和ADH2tt等^［11］。

多形汉逊酵母（Ogataea polymorpha）可高度发酵、异源蛋白分泌表达效率高、杂蛋白少和适度糖基化，但作为底盘细胞表达异源蛋白相对较少^［13］。最常见诱导型启动子是P_HpMOX，P_HpGAP 和P_HpPMA1 等组成型强启动子也有相应报道，毕赤酵母源P_PpAOX1 启动子也可用于其异源蛋白表达^［11］。终止子主要有内源MOXtt、AMOtt及酿酒酵母源ADH1tt^［11］。酿酒酵母终止子可在毕赤酵母、解脂耶氏酵母、乳酸克鲁维酵母和多形汉逊酵母等非常规酵母系统应用，说明具有高度可转移性。

热带假丝酵母（Candida tropicalis）具有较强的工业鲁棒性，可高密度培养，底物利用范围广，其部分内源性启动子被表征，特别是组成型强启动子P_GAP1 常被用于介导基因过表达，是最重要的木糖醇生产菌株。利用P_GAP1 介导磷酸戊糖途径相关基因ZWF和GND过表达来增强菌株NADPH供应，木糖醇产量提升20%以上^［14］。内源诱导型启动子（如P_GAL1 ）可调控基因转录与表达，以P_GAL1 介导的外源蛋白OsBG1表达时，半乳糖诱导后12 h和24 h后基因表达量分别提升7.9和1.5倍^［15］。季也蒙迈耶氏酵母的MgTEF1和棉假囊酵母菌的AgTEF1等外源启动子也能发挥作用。终止子主要有CYC1t、ENO1t、PGK1t、TEF1t和SYN7t等^［16］，合成终止子较天然终止子序列更短、效果更好，还可降低天然终止子重复使用导致的同源重组几率。

1.2.3 藻类

蓝藻和真核微藻是潜在食品合成生物学底盘细胞。蓝藻可用于乙醇、丁醇、脂肪酸等合成，真核微藻更适合细胞储存特性重要产物（如蛋白质、脂质、淀粉）合成，真核藻类应用更多，如莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）和微拟球藻（Nannochloropsis）。莱茵衣藻遗传背景清晰且基因编辑工具成熟，被誉为“光合酵母”，是理想底盘细胞^［17］。雨生红球藻是目前已知最强天然强抗氧化剂虾青素的高产藻株，含量可达细胞干重5%，通过优化光照、培养条件及提取工艺，可实现虾青素工业化生产^［18］。微拟球藻是工业产油微藻代表，可用于功能性油脂（如EPA）等生物合成^［19］。常见底盘细胞的优缺点如表1所示。

2 食品合成生物学应用研究新进展

2.1 替代蛋白质的生物合成

替代蛋白质指非传统动植物来源的蛋白质，如酵母蛋白、植物蛋白肉及细胞培养肉等。

2.1.1 酵母蛋白的生物合成

酵母蛋白氨基酸均衡，是理想的单细胞蛋白。对酵母蛋白理性设计或借助适应性实验室进化结合关键代谢通路改造可获得高产菌株，通过基因编辑、模块化基因元件组装和启动子优选等还可实现蛋白精准调控与代谢通路重构，优化代谢流和能量分配，实现代谢通路全局优化。还可基因改造蛋白质合成后修饰系统，或与功能多肽融合表达赋予酵母蛋白新功能，如在强化食品及特医食品中应用^［20］。

2.1.2 人造肉的生物合成

人造肉分为植物蛋白肉和细胞培养肉两类，前者已成功开发并商业化生产，后者还处于实验室阶段。人造肉需进行风味调和质构模拟才能获得“仿真”度高的肉制品。研究发现，通过增加拷贝数、改造合成分解途径和增强蛋白分泌，大豆血红蛋白在毕赤酵母中表达量可达3.5 g/L^［21］。采用优化蛋白表达方式、增加5-氨基乙酰丙酸合成和解除合成限速步骤等首次实现牛和猪血红蛋白在酿酒酵母中高效表达，表达量分别达到68.9 mg/L和85.9 mg/L^［22］。

2.2 功能性食品添加剂的生物合成

2.2.1 母乳寡糖的生物合成

母乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是一类以乳糖为核心，经岩藻糖等多种单糖修饰形成的寡糖，母乳含量最高、研究最广的HMOs是2'-FL，大肠杆菌是其生物合成的首选宿主。在大肠杆菌MG1655菌株基因组中整合幽门螺杆菌NCTC 11639的α1，2-岩藻糖基转移酶实现以甘油为碳源从头合成2'-FL^［23］；通过多策略构建以葡萄糖为唯一碳源合成2'-FL的工程菌株，2'-FL合成量达（2.53±0.07）g/L，引入外源非磷酸化转运系统提升胞内非磷酸化葡萄糖供给量，产量提升至（4.94±0.35）g/L^［24］。团队还设计转录因子筛选平台并将转录因子LacI诱导物由IPTG替换为乳糖，构建乳糖响应型基因回路实现合成模块间代谢流动态调控，摇瓶发酵产量达到（9.67±0.65）g/L。在底盘细胞，整合从头合成或回补合成途径可实现2'-FL生物合成，利用模块化工程组合异源合成途径搭建出从头合成途径，实现以廉价蔗糖和乳糖为底物合成2'-FL^［25］。

2.2.2 乳蛋白的生物合成

乳蛋白传统提取法制备成本高、工艺难度大，微生物发酵法存在表达量不高、糖基化修饰不足等问题，合成生物学可实现乳蛋白异源高效表达。研究发现，基于T₇表达系统在枯草芽胞杆菌中可实现αS1酪蛋白和乳铁蛋白异源高效表达^［26］。通过优化启动子、构建分泌信号肽和共表达二硫键异构酶A3使α-乳白蛋白在毕赤酵母中异源高效表达，产量可达6 mg/L，发酵条件优化后表达量达56.3 mg/L^［27］。以甲醇为诱导剂，通过优选毕赤酵母分子伴侣、构建促溶标签及杂合信号肽，乳蛋白异源表达量达5.38 g/L^［28］。

2.2.3 麦角硫因的生物合成

氧化剂是指能氧化其他物质而自身被还原的物质，麦角硫因（ergothioneine，EGT）是由真菌和部分细菌合成的稀有含硫氨基酸衍生物的水溶性抗氧化剂，人体仅能通过肉碱/有机阳离子转运蛋白摄取并转运，并发挥抗氧化活性，EGT可促进Nrf2与Keap1解离并激活下游抗氧化基因表达并调节NAD⁺水平增强抗氧化活性^［29］。采用构建融合表达标签并截短结构域系统改造L-Lys、L-Met和L-His 3个前体供应网络，解除反馈抑制和增强合成通量，大肠杆菌优化发酵条件后EGT产量达10 g/L^［30］。通过鉴定米曲霉内源EGT合成基因AoEgt1和AoEgt2，过表达内源和粗糙脉孢菌等异源EGT基因，以葡萄糖为碳源和补充Met前体，共表达结合0.4%Met补充产量达20.03 mg/g_干细胞，较野生型提升8倍^［31］。

2.2.4 低热量新型甜味剂的生物合成

低热量新型甜味剂是指利用先进生物技术或化学合成等方法开发的，能提供甜味但几乎不产生热量的糖替代品，如D-阿洛酮糖热量仅为蔗糖1/10，按来源属性可分为天然甜味剂和人工合成甜味剂，按结构分类可分为单糖、低聚糖、多元糖醇等。D-塔格糖是一种功能性稀有糖，热量低、具有降血糖、抗龋齿和改善肠道菌群功能的功效。以pET28a为载体，优化启动子并将最优突变体基因（LfaraA^D390V/V468L）和大肠杆菌源β-半乳糖苷酶基因（EclacZ）在大肠杆菌BL21（DE3）串联表达，建立双酶偶联全细胞体系，500 g/L乳糖转化获得115.21 g/L D-塔格糖，转化率为23.09%^［32］。构建一株共表达5种嗜热酶的大肠杆菌工程菌株，以麦芽糊精为原料全细胞催化合成塔格糖（3.38 g/L），转化率达到33.8%，产率达1.13 g/L/h^［33］。以酿酒酵母为底盘细胞，通过敲除半乳糖激酶基因GAL1，异源表达木糖还原酶和半乳糖脱氢酶，表达条件优化后塔格糖产量高达37.69 g/L^［34］。甜味蛋白是当前食品甜味剂重要方向，如Thaumatin等。消除负电荷残基、突变为不带电荷氨基酸或增加正电荷残基可提升甜度和稳定性，将负电荷Asp₂₁（D）突变为天冬酰胺（N）获得突变体D21N，甜度提升约1.65倍，Thaumatin突变体D21N和单链Monellin突变体Y65R是目前已知最甜的2种甜味蛋白^［35］。采用蛋白质语言模型设计可提升热稳定性和甜度，AmaiProteins公司通过Pro-Design AI-CPD、Pro-Planet精确发酵和Pro-Taste技术获得110 ℃处理10 min后热稳定性极好的甜味蛋白sweelin。毕赤酵母有诱导型和组成型启动子库，可高密度培养，复杂甜味蛋白折叠、二硫键形成和糖基化修饰较好且融合蛋白表达量高，可在Thaumatin、Brazzein和Monellin等应用，但甲醇诱导存在潜在安全隐患。非常规酵母有潜在应用前景，研究发现，Brazzein可作为表达蛋白并利用毕赤酵母系统进行生产，评估不同启动子和信号肽后确定最优组合，通过增加基因拷贝数并调控可溶蛋白质翻译、折叠与降解过程，产量分别提升至113.24 mg/L和166.54 mg/L，补料分批发酵产量可高达639.11 mg/L，是当前微生物生产Brazzein的最高水平^［36］；优选启动子也能显著提升蛋白表达量，如P_AOX1 和P_GAP 广泛用于Thaumatin、Brazzein和Monellin高效表达。构建信号肽也可显著提升目标蛋白表达水平，如来源于红原鸡的Lysozyme信号肽能显著增强Brazzein表达水平（345 mg/L）^［37］。发酵过程精准控制及参数优化能提升表达水平，如优化培养温度和pH后Thaumatin Ⅱ产量可达到62.79 mg/L，培养基中添加维生素，产量提升至68.60 mg/L^［38］。

2.2.5 食用天然色素的生物合成

天然色素是指从动植物、微生物及矿物等天然资源中，通过物理或化学方法提取、纯化获得的有机着色剂，根据结构不同可分为类黄酮类、类胡萝卜素类、卟啉类、酮类、醌类等。部分食用天然色素可以工程菌株为底盘细胞生物合成，如番茄红素、辣椒红、甜菜红、胭脂红酸和红曲红等。

（1）番茄红素异源生物合成。原核底盘细胞可通过2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径合成番茄红素，大肠杆菌可利用EMP途径产生3-磷酸-甘油醛和丙酮酸，在胞内代谢酶作用下得到3，3-二甲基烯丙基焦磷酸，并在法尼基焦磷酸（famesyl pyrophosphate，FPP）合酶基因ispA作用下合成香叶酰二磷酸（GPP）和FPP作为前体，通过表达外源基因crtE、crtB和crtI逐级催化合成番茄红素。乳酸菌有完整内源甲羟戊酸MVA途径，将穿梭质粒pNZ44与crtEIB通过无缝克隆构建重组质粒pGZQ01并转化到乳酸乳球菌NZ9000获得重组菌株GZQ01，敲除乳酸脱氢酶ldh基因使更多丙酮酸进入番茄红素前体乙酰CoA合成途径，过表达MVA途径基因mvaA后，产量提升154%，发酵条件优化后产量达到1.44 mg/L，是原始菌株的3倍。真核底盘细胞也用于番茄红素生物合成。以解脂耶氏酵母PO1h为底盘细胞，引入外源基因crtE、crtB和crtI和纤维素降解酶基因构建重组菌株Y-32，以纤维素或半纤维素为碳源，番茄红素摇瓶发酵产量为24.1 mg/L^［39］；将谷氨酸棒杆菌异源基因crtE、crtB、crtI表达至毕赤酵母G115，筛选不同物种番茄红素合成途径关键基因发现，红法夫酵母源基因（crtE、crtB、crtI）组合产量最佳（20.59 mg/g_干细胞），过表达NADH激酶pos5和增加NADPH供给产量达33.19 mg/g_干细胞，阻断合成FPP和角鲨烯旁支途径，对固醇调节元件基因Sre过表达，产量高达43.23 mg/g，高密度发酵产量达79.05 mg/g^［40］。

（2）辣椒红异源生物合成。辣椒红素原核异源生物合成较少。利用大肠杆菌BL21（DE3）为底盘细胞，通过pACCRT、pACLAC、pACHP等载体表达crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ基因生成玉米黄质素，表达绿藻IPP异构酶idi、辣椒红素合酶CCS及玉米黄质环氧化酶ZEP，成功合成辣椒红（0.5 mg/L），但无法规模化生产^［41］。目前，辣椒红真核异源表达未见成功报道。

（3）甜菜红异源生物合成。甜菜红生物合成关键是甜菜醛氨酸。甜菜醛氨酸经过氧化或糖基化能转化为甜菜红。以大肠杆菌BAK10（DE3）为底盘细胞，采用pHYN1载体共表达hpaBC和MjDODA基因，构建工程菌BTA6，甜菜醛氨酸产量很高，甜菜醛氨酸可与环多巴结合生成甜菜红^［42］。以酿酒酵母为底盘细胞表达酪氨酸羟化酶、L-多巴双加氧酶、葡萄糖基转移酶等酶基因，以葡萄糖为底物，甜菜红产量达（30.80±0.14） mg/L^［43］。

（4）胭脂红酸异源生物合成。原核与真核底盘细胞均可表达胭脂红酸。通过pDS00和pCDF载体表达Ⅱ型聚酮合成酶OKS、环化酶zhuI和芳香化酶zhuJ、单加氧酶dnrF、C-葡萄糖基转移酶GtCGT并构建大肠杆菌BAP1重组菌，分批补料发酵产量达（0.63±0.02） mg/L^［44］。将npgA基因整合到酿酒酵母ady2转座子位点，采用pY26载体表达OKS、zhuI、zhuJ、UGT2和aptC并将其整合到基因组多拷贝转座子位点Ty2，过表达OKS，构建基于葡萄糖底物的重组菌株，加入维生素后，胭脂红产量可达7.6 mg/L^［45］。目前未见在酿酒酵母构建完整胭脂红酸合成途径的研究报道。

（5）红曲红异源生物合成。目前未见原核细胞合成红曲红色素的报道，真核细胞有报道，红曲霉M9细胞壁结构对胞外红曲色素分泌的影响，敲除了UDP-吡喃半乳糖变位酶基因，胞内基于半乳糖呋喃的多糖含量显著降低，显著增强色素分泌量，6种胞外红曲色素分泌量较野生菌株分别提高1.33、1.59、0.8、2.45、2.89和4.03倍^［46］。红曲色素生物合成基因簇分析发现，MpDLDH基因编码二氢硫辛酰胺脱氢酶（丙酮酸脱氢酶复合体E3亚基）负责乙酰CoA合成，过表达该基因能显著提升色素产量和乙酰CoA水平^［47］。

2.3 食品营养强化剂的生物合成

2.3.1 功能蛋白（活性肽）的生物合成

人源胶原蛋白等结构性蛋白、凝乳酶等功能性蛋白、抗氧化肽和抗菌肽等活性多肽是重要食品营养分子。优化由P_AOX1 启动子驱动的转录过程并提升翻译效率，成功构建能高效表达Ⅲ型人源胶原蛋白的毕赤酵母工程菌，5升发酵罐产量达10.3 g/L^［48］。通过CRISPR-Cas9平台靶向整合不同拷贝数的凝乳酶原表达盒构建多种生产菌株，表达盒拷贝数为3时酶产量最高，最优菌株CP3i凝乳酶摇瓶发酵产量约1 200 SU/mL，分批式发酵酶产量约28 000 SU/mL^［49］。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对酿酒酵母工程化改造使其细胞表面展示一种融合酸性和碱性植酸酶的融合植酸酶，该酶通过α-凝集素-GPI系统锚定在两个无标记菌株上，即BY4743：：GAP-mGEB和BY4743：：GAP-aGEB，分别采用MFα和Aga2p信号肽，表达的植酸酶具有较宽pH适应性，在pH 2.0和pH 5.0~6.0处具有双重最适pH，Aga2p信号肽菌株表现出最高催化效率^［50］。采用基因工程异源融合表达策略构建了抗菌肽LL-37大肠杆菌原核异源表达系统，并基于启动子、融合蛋白、诱导条件及培养基组分多策略优化实现规模化生产，生产成本降至2.07元/mg^［51］。

2.3.2 氨基酸的生物合成

研究开发出一套针对枯草芽胞杆菌的合成生物学技术，突破一碳生物制造潜力底盘的技术瓶颈，首次实现以甲醇为唯一碳源生产L-精氨酸^［52］。将大肠杆菌源谷氨酸脱羧酶导入地衣芽胞杆菌DW2菌株成功构建人工γ-GABA合成途径。通过中心代谢途径优化、L-Glu合成通路强化和改善NADPH供给，工程菌G35/pHY-P_r5u12-gadB^E89Q/H465A5升生物反应器实现62.9 g/L产量^［53］。利用pK18mobsacB技术敲除谷氨酸棒杆菌K020的ldh、poxB、pyc等竞争基因，减少丙酮酸向乳酸和乙酸分流，优化磷酸烯醇式丙酮酸-磷酸转移酶系统，平衡葡萄糖吸收与代谢负荷，并调整接种量及阶段转换时机，5 L发酵罐L-Val产量达88.7 g/L^［54］。

2.3.3 维生素的生物合成

（1）维生素B₁₂。只有部分原核生物可从头合成，部分原核生物还可采取补救途径从胞外转运钴啉醇酰胺等钴啉化合物催化合成维生素B₁₂。研究发现，在粘着剑菌A中敲除及弱化西罗血红素合成途径基因可提高维生素B₁₂产量45.1%^［55］。在天然菌株根瘤菌中引入基于Cas12k的碱基编辑技术C12KGET对底盘细胞基因组序列进行改造并整合表达荚膜红细菌源cobA基因，产量提升25%^［56］。无细胞催化合成系统在维生素B₁₂合成方面前景广阔，将天然维生素B₁₂合成途径中24步催化反应细分为5个模块并逐个模块构建，通过组装36个酶的无细胞催化体系可实现以5-氨基乙酰丙酸和氢胆酸盐为底物合成维生素B₁₂^［57］。

（2）7-脱氢胆固醇的生物合成。酿酒酵母本身不存在7-HDC合成路径，但有天然甾醇合成途径，是合成7-HDC理想底盘细胞。脂滴会大量隔离7-HDC前体物质——角鲨烯并阻碍其进入下游代谢通路，研究团队在脂滴上重构角鲨烯下游代谢通路，7-HDC产量达684.1 mg/L，角鲨烯产量下降约97%，团队还通过弱化三酰甘油降解通路、降低NADH/NAD⁺比值，使7-HDC在3升生物反应器产量高达5.1 g/L^［58］。在具有强大麦角固醇合成能力的酿酒酵母中异源表达24-脱氢胆固醇还原酶，实现7-DHC生物合成量达到44.1 mg/L，麦角固醇滴度下降40.5%^［59］，团队通过敲除ERG6和ERG5基因完全阻断麦角固醇合成途径，产量提高4.2倍，强化甲羟戊酸途径和后角鲨烯途径并消除转录抑制因子，摇瓶发酵产量达738.5 mg/L，50 L发酵罐发酵24 h，产量达3.80 g/L。

2.3.4 功能脂肪酸的生物合成

改造底盘细胞代谢途径可实现脂肪酸定向合成，如敲除β-氧化途径并过表达硫酯酶可提升具有特殊功能的中链脂肪酸表达量。奇链脂肪酸（odd-chain fatty acids，OCFA）具有抗炎症、降血脂、降低血管疾病等作用，调控关键酶表达和优化代谢途径等能促进OCFA合成。研究发现，通过关键酶、代谢途径和细胞维度对酿酒酵母基因改造，中链脂肪酸产量提升250倍^［60］。重构解脂耶氏酵母脂肪酸和甘油三酯合成与降解途径能显著提升油酸生物合成量（56 g/L）^［61］。

2.4 食品风味物质的生物合成

借助合成基因回路与多模态调控策略，或基于底盘细胞工程可实现食品风味物质生物合成。在酿酒酵母中重建甲羟戊酸途径和苯丙烯酸代谢途径，辅以关键酶活性优化及产物定向进化可实现乙偶姻生物合成。通过代谢路径重构与整合位点优化，在强化内源莽草酸途径基础上以分支酸为中间体，仅通过4步反应即实现363.0 mg/L香兰素生产，进一步通过启动子优化实现代谢模块适配和香兰素糖基化修饰解除反馈抑制，多底物共转化实现1 745.5 mg/L葡萄糖香兰素产量^［62］。在构建的高产香茅醇菌株基础上，通过整合额外拷贝的甲羟戊酸途径基因及过氧化物酶体定位基因簇，产量提升1.5倍，过表达磷酸戊糖途径非氧化支路基因和促进NADPH供给、筛选内源性转运蛋白并整合转录调控因子PDR1后，产量提升至3.38 g/L，采用补料分批工艺实现10.556 g/L香茅醇产量，是目前酵母体系报道的最高水平^［63］。

2.5 在副产物高值转化、食品快检和溯源中的应用

合成生物学技术可实现乳清中乳糖等副产物高值转化、致病因子和有毒有害物质快测、食品生物安全与溯源分析。针对金黄色葡萄球菌等致病菌特异性基因序列设计相应的“标签”crRNA，若存在目标致病菌，等温扩增后激活Cas12a或Cas13a蛋白“附属切割”活性，切割报告分子产生荧光或试纸条显色，实现致病菌快检^［64］。细胞传感技术为食品快检提供新型检测方法，传感感应元件主要有转录因子、核糖开关等，报告元件主要有荧光素酶、荧光蛋白、荧光适配体、色素报告元件等。利用荧光标记适配体与淬灭基团DNA互补特异性杂交原理进行黄曲霉毒素B₁快速检测^［65］。转录因子感知特定信号可增（减）相关基因表达量并指示致病因子或毒素变化。核糖开关也可被设计为能感知潜在风险的相关分子，若存在致病菌DNA或有毒有害物质时，核糖开关可与风险源发生构象变化，激活报告元件并产生可测定信号^［66］。荧光报告元件可与绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白耦合，感应元件受到刺激或接收信号时，可使荧光淬灭或恢复从而实现定性/量检测，如针对母乳寡糖开发的糖苷酶耦合传感器能高通量筛选高产菌株，色氨酸生物传感器高灵敏检测色氨酸^［67］。合成生物学还可用于食品溯源，如将人工设计且具有唯一性和高稳定性的DNA序列（DNA Barcode）以安全方式添加到食品及原辅料中，消费者或监管机构可通过试剂盒（条）或简易PCR辨别食品真伪或追溯食品来源。

3 食品合成生物学发展策略

3.1 微生物底盘细胞的改造

野生菌株不宜直接作为底盘细胞，去除非必需基因和潜在风险基因能提高遗传稳定性和代谢效率，插入外源基因或调控内源通路能增强目标产物合成能力。基因精简是构建底盘细胞重要策略。Champie^［68］为研究基因组简化对大肠杆菌DGF-298（约36%基因组被删除）的影响，重建菌株特异性代谢模型iAC1061，并基于iModulon转录组分析研究了基因表达调控并进行适应性实验室进化，菌株代谢通路得到优化，代谢稳定性较好。将原有启动子替换成其他启动子能改变受控基因表达谱，启动子可以是自身或相近种属的启动子，也可是外源启动子。对启动子核心区间隔序列进行随机突变或饱和突变可获得具有310倍转录活性差异的启动子库^［69］。分析补氨条件下地衣芽胞杆菌CBBD302全基因组转录变化，分析氨诱导型启动子核苷酸序列对编码α-淀粉酶的amyL基因功能介导表达能力时发现，筛选的几个启动子均能介导amyL表达并能被氨显著诱导，以Pplp启动子介导的酶表达水平最高^［70］。串联双启动子组合策略近年受到重视，研究发现，P43启动子在对数期能有效转录，而σB型启动子在稳定期表现出活性，为构建高效双启动子，可将σB型启动子与P43偶联构建若干双启动子。其中，双启动子PykzA-P43与公认强启动子P43相比，分别使绿色荧光强度、红色荧光强度和α-淀粉酶活性提高了1.72倍、3.46倍和1.85倍^［71］。利用组学数据和生物信息学工具进行启动子序列识别与改造、强度预测与RBS序列优选并指导新启动子发现，高强度新组成型或诱导型启动子改造以及目标基因的高效表达等是当前启动子研究重点。目前，终止子优化研究相对较少。对地衣芽孢杆菌内源α-淀粉酶基因终止子T1进行功能表征发现，终止效率为87.81%，从终止密码子与终止子间隔距离、茎结构底部GC含量、环区长度及U-序列长度4个维度对终止强度进行组合优化并获得最优终止子T24，终止效率提升至97.97%^［72］，优于目前广泛使用的T7终止子。

3.2 代谢通路动态调控

动态调控是通过合理设计代谢通路基因实现精确调控细胞生长和目标物生产的代谢平衡，是重要调控策略。在枯草芽胞杆菌中创建可编程和双功能丙酮酸响应遗传回路用于动态激活和抑制中心代谢通路，依靠胞内丙酮酸浓度平衡生长和葡萄糖酸合成，使葡萄糖酸滴度从207 mg/L增加到802 mg/L。开关型回路能精确控制底盘细胞群体活动，生态开关能确保底盘细胞生物安全^［73］。研究者设计了一种可编程的双功能传感器，可同时响应温度与丙酮酸信号，将构建的基于温度传感器与丙酮酸生物传感器的分层级联调控电路用于异丁胺合成，发酵罐产量达46.24 g/L（提升3.31倍）^［74］。设计开发了一款快速光遗传反向调控回路OptoINVRT7用于调控酿酒酵母基因表达，该调控回路响应速度是同类OptoINVRT光遗传回路的6倍，团队将OptoINVRT7与诱导型GAL1启动子（P_GAL1-S ）联用实现高强度且受光照精准调控的基因表达，黑暗条件基因表达诱导达（132.9±22.6）倍，乳酸和异丁醇产量分别提升50%和15%以上^［75］。合适信号肽能指导新生肽正确折叠并引导跨膜分泌，通过吉布森组装技术利用两条含高比例简并核苷酸的重叠合成寡核苷酸链，实现天然信号肽XPR2-pre快速进化，以纳米荧光素酶为报告基因对447个信号肽突变体表征筛选出若干新型信号肽，其介导Nluc荧光素酶分泌性能优于XPR2-pre，上清液酶活性最高提升至原来的2.91倍^［76］。这些信息肽具有跨蛋白通用性，能实现β-半乳糖苷酶、α-淀粉酶及PET水解酶的分泌表达。利用人工智能算法、机器学习模型和多组学数据深度融合可实现从基因到代谢流再到产物谱的多尺度预测与反馈控制，使底盘细胞具备更高自适应性和可预测性。通过卷积神经网络机器学习方法解析了启动子序列与功能的构效关系，并成功预测了大肠杆菌σ70启动子转录起始速率、17nt启动子间隔区序列以及枯草芽胞杆菌3种不同σ因子特异性启动子序列^［77］。

3.3 适应性实验室进化

适应性实验室进化能模拟自然进化，可构建遗传多样性基因突变库，经过筛选可获得稳定遗传的底盘细胞。通过基因组重排与实验室适应性进化技术成功构建一株合成甲基营养型酿酒酵母，能以甲醇为唯一碳源实现稳健生长，该菌株可通过Adh2-Sfa1-rGly（ASrG）途径完成甲醇同化，同时介导甲酸与二氧化碳协同同化，引入电子转移材料C3N4量子点后，菌株甲醇依赖型生长能力显著增强^［78］；该研究创新性地发现了一条全新的C₁化合物利用途径并彰显酿酒酵母代谢网络的非凡适应性与自我进化能力。基因组规模多位点快速进化工具结合计算机辅助进化能增强适应性进化选择效果，如基于酿酒酵母底盘细胞开发的基因组重排进化技术（SCRaMbLE）可在单一细胞实现多个不同性状同时改造，显著提升底盘细胞生长速度和耐受性^［79］。

3.4 辅酶因子工程

辅酶因子NADH/NAD⁺和NADPH/NADP⁺比例影响产物生物合成和代谢流方向，主要策略有重构辅酶因子代谢途径、增强胞内辅酶因子代谢强度、平衡辅酶因子稳态及提高酶辅因子偏好性等。构建双通道EMP途径以平衡NADPH和NADH供应，通过改造磷酸戊糖途径引入来自不同菌的编码NADH依赖性天冬氨酸脱氢酶aspB基因，将NADPH消耗过程转化为消耗NADH，改造启动子和引入可利用NADP⁺作为辅因子的gap基因等策略以提高谷氨酸棒杆菌高丝氨酸产量和NADPH^［80］；当NADH/NAD⁺和NADPH/NADP⁺比例达到一定阈值后，可通过调节EMP路径和GapN通道通量维持辅因子平衡，保证高EMP速率促进产物合成。

3.5 蛋白质骨架技术

蛋白质骨架技术可通过改变酶与底物邻近距离使酶以最优催化空间锚定在蛋白质骨架并调控催化效率。人工设计CipA基因，该基因编码9个不同黏附模块与2个纤维素结合结构域（DCipA2B9C），将9种不同真菌纤维素酶分别与9种不同粘连结构域融合使酶能在DCipA2B9C上实现精准定位并发挥酶邻近效应^［81］，团队构建的骨架蛋白宿主（SH）可表达DCipA2B9C，与酶宿主（EH）共培养体系乙醇量达到14.29 g/L，比此前已构建的所有酵母纤维小体系统产量提升了4倍及以上。利用四肽重复亲和蛋白（TRAPs）作为酶催化骨架，构建纳米级多酶组装体系并对TRAPs进行编程来识别与酶融合的肽标签，该支架蛋白还可选择性隔离反应中辅因子并增加局部辅因子浓度，将多酶进行近距离排列触发底物通道效应实现辅因子高效利用和级联催化^［82］。

3.6 高通量筛选

引入荧光、质谱和基因组测序等多重检测技术可为底盘细胞构建提供高特异性、高灵敏度的高通量筛选，如荧光激活细胞分选技术、液滴微流控分选技术和生物传感器筛选策略等。酵母蛋白质水平与细胞RNA含量具有相关性，基于该原理建立了一种基于RNA荧光标记与流式细胞术的高通量筛选方法筛选高蛋白突变株B1，45 L生物反应器补料分批发酵并控制乙醇<1.5 g/L时，菌株蛋白质含量达70.3 g/100g_干细胞，是目前已报道最高水平^［23］。开发了一套基于液滴微流控分选技术高通量筛选系统并将其用于高产乳酸菌株筛选，采用荧光激活细胞分选技术以高灵敏度、高通量方式完成目标菌株分选，突变株乳酸产量达76 g/L（提升52%）^［83］。利用核糖开关构建赖氨酸生物传感器并开发出高通量筛选技术，能增强嵌合天冬氨酸激酶在大肠杆菌中的性能，大幅提升L-Thr产量^［84］；利用转录调控因子CcdR开发L-Cys生物传感器并将其与流式细胞分选技术耦联，构建的高通量筛选平台能显著提升L-Cys产量^［85］。

3.7 人工多菌体系设计与应用

纯培养单菌体系代谢网络和遗传背景清晰，但面对复杂目标产物生物合成时，存在胞内资源分布失衡，底物转化率低，稳健性不足，产物累积造成细胞过氧化和细胞应激等问题，人工多菌体系能通过有效分配细胞代谢负担增加产物合成。以植物发酵梭菌为初级碳源专一性菌株，大肠杆菌为次级碳源专一性菌株，通过构建初级碳源与次级碳源菌株协作模式，借助交叉互养正反馈机制、代谢分工策略以及死菌体分解代谢介导营养与能量传递实现高效共生，当该合成菌群以生物膜形式培养时展现出生物量积累增强的特性，形成高细胞密度群落结构且菌群中不同菌株沿垂直方向呈现物种梯度分布。合成菌群具有较好环境耐受性，生物量积累量较各菌株纯培养生物膜总和提升约250%^［86］。

常见底盘细胞改造策略及其应用如表2所示。

4 结语与展望

食品合成生物学的规模化和产业化中面临技术、安全及产业生态等多重挑战。随着智能化与大数据深度融合，可构建“设计-构建-测试-学习”全闭环智能平台，实现从基因组编辑到发酵调控的全流程预测与自适应优化，尤其在启动子设计、蛋白结构预测及代谢网络建模等方面，将显著提升底盘细胞改造效率。当前底盘细胞普遍存在代谢负担重、耐受性不足、产物分泌效率低等问题，未来可通过多组学分析揭示代谢调控网络，开展合成基因组学与最小基因组研究，构建精简高效的底盘细胞，并建设模块化元件库。安全性方面，需建立涵盖基因编辑稳定性、副产物及致敏性的风险评估框架，推动国内外法规协调，明确产品分类与审批路径，加强科普与伦理讨论。产业化需跨学科协同，加强产学研联动，推进中试验证与规模化示范，培育专业人才，构建开放创新平台。通过技术创新、系统设计、安全规范与生态协同，食品合成生物学有望为未来食品提供安全、营养、可持续的个性化方案，推动食品工业向绿色化、智能化和精准化转型升级。

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基金资助

湖南省自然科学基金区域联合基金(2026JJ80062)