延龄草皂苷类成分及其药理活性、资源保育的研究进展

Research progress on saponins from Trillium tschonoskii and their pharmacological activities and resource conservation

摘要

延龄草是土家族四大名药之一，具有活血祛瘀、镇静安神、治疗跌打损伤等功效，现代药理研究表明其在改善阿尔茨海默症等中枢神经退化性疾病方面具有一定疗效。由于早年的大量采挖及现代保育工作尚未完善，延龄草资源稀缺，已被列为国家三级珍稀濒危保护植物。本文归纳了延龄草皂苷类成分及其结构分类、药理活性以及资源保育方面的研究进展，剖析了目前延龄草资源发展中亟待解决的问题，旨在为延龄草资源的可持续利用和产业发展提供基础和依据。

Abstract

Trillium tschonoskii is one of the four famous medicines of Tujia nationality， which has the effects of promoting blood circulation and removing blood stasis， calming nerves and treating traumatic injuries. Modern pharmacological studies show that it has certain curative effect in improving central nervous degenerative diseases such as Alzheimer’s disease. Due to the massive excavation in the early years and the imperfect modern conservation work， the resource of T. tschonoskii is scarce and has been listed as the national third level rare and endangered plant. In this paper， the research progresses of saponins and their structural classification， pharmacological activity and resource conservation in T. tschonoskii are summarized， and the problems to be solved in the development of T.tschonoskii resources are analyzed， in order to provide the basis and basis for the sustainable utilization and industrial development of T. tschonoskii resources.

Graphical abstract

关键词

延龄草 / 皂苷类成分 / 药理活性 / 资源保育

Key words

Trillium tschonoskii / saponin / pharmacological activity / resource conservation

0 引 言

延龄草（Trillium tschonoskii Maxim.）为百合科（Liliaceae）延龄草属（Trillium）多年生草本植物，药材名为“头顶一颗珠”，以根及根茎入药，是土家族四大名药（文王一支笔、江边一碗水、七叶一枝花、头顶一颗珠）之一，其味甘、微辛，性温，有小毒，具有镇静止痛、活血祛瘀、治疗跌打损伤等功效^［1］，在《土家族药物概论》《草药性书》中均有记载^［2，3］。皂苷类成分是延龄草中的主要药效成分之一，是改善阿尔茨海默症、发挥抗衰老、抗肿瘤、抗炎及对中枢神经影响等作用的主要活性成分，现代医学广泛用于治疗脑震荡后遗症、神经衰弱、高血压、偏头痛等症^［4，5］。

延龄草在我国主要分布于湖北神农架、恩施自治州、郧阳、四川中、南部、甘肃东南部、云南北部等地，在不丹、锡金、印度、日本也有分布。延龄草为神农架“四个一”中最名贵的药材，由于过度采挖，导致野生资源产量急剧下降。延龄草种子在自然状态下很难发芽，并且胚根需要在恒定温度的黑暗环境中才能出现，种子秋播后需到第三年春季才出苗，随后还需培育3年，即到播种后的第六年才能采收入药，因此，其生育周期一般是6年。延龄草种群濒危的主要原因有：延龄草作为草本植物，在其所处的群落中是伴生种，属于非优势种群，且延龄草种群密度较小；延龄草生境一般为林下、山谷阴湿处、山坡等地，作为阴生植物，延龄草光合作用能力低，在裸露的环境下还有光合午休的现象，对气温、湿度及土壤pH值、重金属含量等环境因素的要求较高，随着这类适宜生境的减少，延龄草种群也逐渐缩小；延龄草根系不发达，根毛极为稀少，且对水分及营养物质的吸收能力较弱，抗逆能力较差；延龄草的遗传多样性低且结实率低^［6~10］。这些原因造成延龄草资源紧缺，被列为国家三级珍稀濒危植物，在中国物种红色名录中被列为近危级^［11］。本文通过对延龄草皂苷类成分、药理活性及其资源保育研究现状进行归纳整理，探讨目前存在的问题，旨在为延龄草资源的可持续利用及产业发展提供相关科学依据和参考。

1 皂苷类成分

皂苷具有抗菌、解热、镇静、抗癌等药理活性，是延龄草的主要有效成分^［2］，同时也是中药材西洋参^［12］、远志^［13］、桔梗^［14］等的主要有效成分。延龄草中的皂苷类成分主要包括甾体皂苷和苯并胆甾烷型甾体皂苷两大类化合物^［15］，还包括少量的其他类皂苷化合物。延龄草总皂苷一般通过乙醇、甲醇等有机溶剂进行提取^{［16，17］}，也有研究通过水提取得到延龄草皂苷^［18］，目前从延龄草中分离鉴定得到的皂苷类成分已达70种。以下为已分离出的延龄草皂苷的化学结构式（图1~6）及取代基结构图（图7）。

1.1 甾体皂苷

甾体皂苷是一类由螺甾烷类化合物衍生的寡糖苷，延龄草中的皂苷以甾体皂苷类为主，根据母核结构及取代基不同分为延龄草皂苷、偏诺皂苷、薯蓣皂苷、克里托皂苷4类。

1.1.1 延龄草皂苷

延龄草皂苷一般在其母核C⁃1位成苷，这是区别于其他皂苷的结构特征，根据取代基位置不同可分为以下4类。该类型皂苷的母核结构见图1，已从延龄草中分离鉴定出的延龄草皂苷类成分见表1^［19~25］。

1.1.2 偏诺皂苷

延龄草中的偏诺皂苷母核上C⁃17位有羟基（-OH）取代，且通常C⁃3位羟基取代呈苷，取代基的糖主要为葡萄糖和鼠李糖，偏诺皂苷是延龄草中甾体皂苷的主要类型，有啰甾皂苷（Ⅰ）和呋甾皂苷（Ⅱ、Ⅲ）两种存在形式，延龄草中的主要有效成分重楼皂苷Ⅵ、Ⅶ也属于偏诺皂苷类型。该类型皂苷的母核结构见图2，已从延龄草中分离鉴定出的偏诺皂苷类成分见表2^{［15，19，25~29］}。

1.1.3 薯蓣皂苷

薯蓣皂苷在延龄草中有少量分布，根据F环是否开裂可将其分为2类。该类型皂苷的母核结构见图3，已从延龄草中分离鉴定出的薯蓣皂苷类成分见表3^{［20，21，25，27，28］}。

1.1.4 克里托皂苷

克里托皂苷的特殊骨架特征是延龄草属植物化学分类的标志^［13］，其母核E环、F环均为裂环，且C⁃16及C⁃22同时氧化成酮基，C⁃26的羟基（-OH）多与1分子葡萄糖结合成苷。该类型皂苷的母核结构见图4，已从延龄草中分离鉴定出的克里托皂苷类成分见表4^{［29，30］}。

1.2 苯并胆甾烷型甾体皂苷

延龄草中还含有少量的苯并胆甾烷型甾体皂苷巴比妥苷B（parispseudoside B）、乙硫苷A（aethioside A）、巴比妥苷A（parispseudoside A），该皂苷的特点是E环为苯环，F环开裂，该化合物常C⁃3位被取代成苷，C⁃26位的羟基与一分子葡萄糖结合成苷。该类型皂苷的母核结构见图5，已从延龄草中分离鉴定出的苯并胆甾烷型甾体皂苷类成分见表5^［31］。

1.3 其他皂苷

除甾体皂苷、苯并胆甾烷型甾体皂苷等化合物外，延龄草中还包括胡萝卜苷、trillfurostanoside E和trillfurostanoside F等其他类型的皂苷。该类型皂苷的母核结构见图6，已从延龄草中分离鉴定出的其他类皂苷成分见表6^{［29，32］}。取代基结构图见图7。

2 药理活性

延龄草有活血祛瘀、镇静止痛、治疗跌打损伤等功效，现代药理学研究表明其皂苷类成分在调节中枢神经系统、抗肿瘤、抗炎、保护心肌、收缩子宫平滑肌、治疗脊髓损伤等方面具有良好的生物活性。

2.1 调节中枢神经系统

2.1.1 改善阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（alzheimer disease，AD）是老年痴呆中最常见的一种类型，是一种中枢神经系统原发性退行性疾病^［33］。有实验通过对小鼠分别注射60、30、10 mL/kg的延龄草水煎液及30 mL/kg的生理盐水，观察延龄草对小鼠中枢神经系统的影响，结果表明延龄草水煎液对中枢神经系统有明显抑制作用，对神经衰弱的防治有一定作用^［34］。有研究表明延龄草皂苷DTCA（脱氧三烯苷CA，deoxytrillenoside CA）及ETCA（表白花延龄草烯醇苷CA，epitrillenoside CA）在体外的AD模型中可清除AD相关病理蛋白，有效抑制Aβ纤维的形成及其神经毒性；DTCA与ETCA可在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）体内诱导自噬的发生，改善AD模型行为能力；给药剂量为0.5、1.0、2.0 mg/kg的ETCA可通过激活自噬清除Aβ和Tau，改善早发性痴呆症双转基因小鼠的学习认知能力^［35］。还有研究发现，延龄草水煎液的中、高剂量组（分别相当于人的等效剂量0.25、0.5 g·kg^-1·d^-1）灌胃给药后可改善大鼠空间记忆障碍及学习认知能力，其机制可能是通过提高AD大鼠脑海马的蛋白磷酸酶2A（PP2A）活性，降低Tau蛋白磷酸化水平，增加大鼠脑海马区尼氏小体的数量^［36］，或上调AD大鼠脑海马PKC和Akt活性，抑制下游GSK⁃3β的活性，增加大鼠突触蛋白的表达^［37］，或通过抑制脑海马区PME表达，改善海马神经元形态和数量^［38］，进而达到改善大鼠学习认知障碍的目的。研究发现延龄草醇提物低、中剂量组（0.5、1.0 g/kg）可有效改善东莨菪碱诱导的AD大鼠空间学习记忆障碍，其机制可能是通过抑制大鼠脑海马乙酰胆碱酯酶活性并提高乙酰胆碱转移酶活性，调节胆碱能系统，提高突触蛋白水平，促进神经元及突触发育并增加树突棘密度^［39］。

2.1.2 抗衰老

衰老表现为结构的退行性病变和机能的衰退，延龄草有一定的抗衰老作用。研究表明，灌胃给药剂量为50、100 mg/kg的延龄草总皂苷可通过上调Rheb和下调mTOR，改善D⁃半乳糖诱导的衰老大鼠学习记忆能力，对D⁃半乳糖引起的衰老大鼠的海马组织具有保护作用，从而挽救功能失调的自噬，发挥抗衰老作用^［40］。有研究采用水提醇沉法制成含生药30%的延龄草注射液，每天按7.2、3.6、1.8 g/kg对小鼠衰老模型进行腹腔给药，研究结果为各剂量组的延龄草注射液均可改善小鼠的学习记忆能力，提高体内SOD和GSH⁃Px活性及恢复皮肤中羟脯氨酸的含量并发挥抗衰老作用，增强机体免疫力^［41］。延龄草总皂苷提取物的低、中、高剂量组（50、100、120 mg/kg）均可改善D⁃半乳糖所致衰老大鼠的学习记忆能力，减轻神经细胞的受损程度，与模型组相比，延龄草处理组的大鼠神经细胞明显增加，且海马组织中的Pink1、Parkin阳性表达的颗粒明显增加，推测其改善衰老大鼠学习记忆能力的机制可能与提高Pink1、Parkin蛋白的表达、激活线粒体自噬有关^［42］。将含生药量为12.41 mg/g的延龄草总皂苷提取物对大鼠进行灌胃给药，每只大鼠用药量为100 mg/kg，可改善衰老大鼠的认知能力，其机制可能与提高海马组织内BDNF和TrkB表达、增强抗氧化能力有关^［43］。此外，还有研究表明，灌胃给药剂量为50、100和200 mg·kg^-1·d^-1的延龄草总皂苷可剂量依赖性地改善衰老大鼠的认知能力，其机制可能与抑制海马内miR⁃155⁃3p表达、调控Rheb/mTOR/p70S6k信号通路有关^［44］。

2.1.3 抗脑缺血

延龄草皂苷对脑缺血大鼠起保护作用，能减轻脑缺血对大鼠神经元的损伤^{［45，46］}。对延龄草中分离的四种偏诺皂苷penogenin⁃3⁃O⁃α⁃L⁃rhamnopyranosyl⁃（1→2）⁃O⁃β⁃D⁃glucopyranoside、penogenin⁃3⁃O⁃α⁃L⁃rhamnopyranosyl⁃（1→4）⁃［O⁃α⁃L⁃rhamnopy⁃ranosyl⁃（1→2）］⁃O⁃β⁃D⁃glucopyranoside、PS Ⅶ、pennogenin进行药理活性研究，pennogenin组给药剂量为37、54 mg/kg（中、高剂量组），其余皂苷组为60、90 mg/kg，四种皂苷均对大鼠局灶性脑缺血/再灌注（I/R）损伤具有明显保护作用，其机制可能与抗炎及抗氧化应激有关^［47］。通过对大鼠进行CatWalk自动步态分析作为评估方法，研究延龄草总皂苷对大鼠脑局灶性缺血的影响，经过治疗，各剂量组（120、60、30 mg/kg）不同程度地改善了大鼠的步态障碍，减轻大脑中动脉栓塞（MCAO）大鼠的脑组织损伤程度，促进MCAO大鼠的病灶周围少突胶质细胞生成，延龄草总皂苷处理后激活了MCAO大鼠的PI3K/Akt/GSK⁃3/CRMP⁃2通路，表明延龄草是缺血性卒中后神经修复治疗的潜在药物^［48］。研究表明，给药剂量为65 mg/kg的延龄草甾体皂苷可减轻脑缺血动物神经功能缺损症状，促进肢体运动功能恢复，减小脑缺血大鼠梗死体积，减轻顶叶皮层和纹状体损伤程度，增强基底动脉及右侧前动脉血管梗死信号，增加缺血梗死灶周围纹状体及顶叶皮层血流^［49］。

2.2 抗肿瘤

重楼皂苷Ⅶ（PS Ⅶ）是延龄草的主要有效成分，可浓度依赖性地抑制人肺癌细胞A549的细胞活力及细胞迁移和侵袭能力^［50］，对宫颈癌细胞^［51］、人乳腺癌细胞^［52］、骨肉瘤细胞^［53］也有抑制作用。PS Ⅶ在浓度1.0~6.0 μmol/L时可剂量依赖性地抑制非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的增殖^［54］；浓度为1.0~8.0 μmol/L的PS Ⅶ可诱导NSCLC细胞自噬及半胱氨酸蛋白酶依赖性凋亡，与自噬抑制剂3⁃MA联用可增强体内抗肿瘤活性^［55］。剂量为1和2 μmol/L的PS Ⅶ能诱导白血病细胞（HEL）的细胞凋亡和细胞周期阻滞，有着优异的抗白血病活性^［56］，表明它是白血病患者潜在的替代化疗药物。从延龄草中分离的滇重楼茎叶总皂苷Ⅲ（Polyphylloside Ⅲ）、PS Ⅶ以及重楼皂苷Ⅵ（PS Ⅵ）在10和20 mg/kg剂量时能有效抑制小鼠结肠癌肿瘤细胞的生长，降低小鼠血便和脱肛的发生率，表明延龄草在结肠癌的临床预防和治疗中具有潜力^［57］。此外，延龄草中的其他皂苷也同样对肿瘤生长有抑制作用。将延龄草根茎粉碎后用乙醇提取，将洗脱后分离出的saponin Tg，pennogenin⁃3⁃O⁃β⁃chacotrioside，pennogenin⁃3⁃O⁃α⁃L⁃rhamnopyranosyl⁃（1→2）⁃β⁃D⁃glucopyranoside及pennogenin⁃3⁃O⁃β⁃D⁃glucopyranoside四种甾体皂苷（100 μmol/L）对人肝癌细胞HepG2进行处理，四种皂苷均表现出显著的细胞毒活性，并且皂苷saponin Tg及pennogenin⁃3⁃O⁃β⁃D⁃glucopyranoside处理24 h后可显著诱导HepG2细胞的凋亡，推测其母核1号位上的取代基苷元结构变化对细胞毒活性的影响至关重要^［26］。有研究表明，延龄草皂苷trilliumoside D对人肝癌细胞Huh7表现出明显的细胞毒性，IC₅₀值为（7.5±0.7） μmol/L；而trilliumoside C表现出的细胞毒性较弱，IC₅₀ 值为（20.7±2.5） μmol/L；trilliumoside B及trilliumoside D对人急性淋巴母细胞白血病细胞MOLT⁃4表现出显著的细胞毒性，IC₅₀值分别为（4.6±0.5）和（1.0±0.1） μmol/L^［24］。

在癌症化疗过程中，克服多重耐药性（multidrugresistance， MDR）是主要攻克的难题之一。研究表明，延龄草的有效成分PS Ⅶ可剂量依赖性地抑制MCF⁃7/ADR（耐阿霉素的人乳腺癌细胞）^［58］、K562/ADR（抗阿霉素的人白血病细胞）^［59］细胞的活力并触发细胞凋亡，调节细胞的耐药性。有研究发现，1.5~150 μmol/L浓度的延龄草皂苷可剂量依赖性地逆转肝细胞癌（HCC）细胞中的MDR并显著增强化学增敏作用，阻止肿瘤的形成和发展，抑制HepG2和R⁃HepG2（阿霉素耐药的HepG2）细胞存活和集落形成^［60］。PS Ⅶ（剂量浓度≤1.98 μmol/L）可下调耐药基因的表达，增加阿霉素在细胞内的积累，促进细胞凋亡，增强HepG2/ADR细胞对阿霉素的敏感性^［61］。

2.3 抗炎

延龄草皂苷对多种炎症有明显改善作用。2.5、5.0、10.0 mg/kg剂量的PS Ⅶ可改善大鼠体重、爪肿胀、踝关节直径，降低脾脏和胸腺指数，抑制促炎性细胞因子TNF⁃α、IL⁃6和IL⁃1β的产生，改善组织病理学变化并调节佐剂诱导的关节炎（AIA）大鼠凋亡蛋白的表达^［62］。从延龄草根茎的水溶性成分中分离出的18⁃去螺甾醇皂苷1⁃O⁃β⁃D⁃apiofuranosyl⁃（1→3）⁃α⁃L⁃rhamnopyranosyl⁃（1→2）⁃［β⁃D⁃xylopyranosyl⁃（1→3）］⁃α⁃L⁃arabinopyranosid及延龄草皂苷trillenoside A在给药剂量为10、20 mg/ml时均对脂多糖（LPS）刺激的小鼠腹腔巨噬细胞中COX⁃2产生显著的抑制作用^［23］。有研究表明，延龄草皂苷trilliumoside H及trilliumoside I在浓度为1.0 μmol/L时有显著的抗炎作用，抑制率分别为（56.3±1.5）%和（56.2±2.2）%^［24］。从延龄草根及根茎中分离出的甾体皂苷FT^［32］能降低LPS诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，从而减少NO的产生，并且FT可以在基因和蛋白水平下调COX⁃2的表达，浓度为10、20和40 μmol/L的FT对TNF⁃α、IL⁃6和IL⁃1β的表达呈剂量依赖性，从而达到抗炎效果。在类风湿性关节炎（RA）的药物疗效研究中，佐剂性关节炎（AA）模型较为常用，且有研究发现，低、中、高（50、100、200 mg/kg）剂量组的延龄草皂苷均对AA模型大鼠有改善作用，治疗组大鼠体质量、足肿胀度、关节炎性的评分显著升高，且模型大鼠踝关节滑膜细胞增生、滑膜组织充血及软骨细胞破坏等病理改变均减轻，炎性细胞浸润减少^［63］。此外，延龄草总皂苷对急性胰腺炎（AP）有明显改善作用，可改善胰腺的炎性浸润和坏死，显著减轻了肺泡壁的增厚及炎性浸润，且高剂量（100 μmol/L）延龄草皂苷作用更为明显^［64］。

2.4 保护心肌

延龄草皂苷能抑制心肌细胞凋亡，缓解心肌病变的发生，对心肌细胞起保护作用。研究表明，延龄草皂苷PS Ⅵ高、中剂量组（29.14、14.57 mg/kg）、penogenin⁃3⁃O⁃α⁃L⁃rhamnopyranosyl⁃（1→4）⁃［α⁃L⁃rhamnopyranosyl⁃（1→2）］⁃β⁃D⁃glucopyranoside高、中剂量组（17.14、8.86 mg/kg）及PS Ⅶ高、中剂量组（26.86、14.28 mg/kg）的给药剂量均对急性心肌缺血大鼠的心肌细胞具有一定保护作用^［65］。含生药量为14.72 mg/g的延龄草总皂苷，在用药量为50、100和200 mg/kg时均对心肌缺血的大鼠心肌组织损伤有保护作用，其机制可能与通过调控PINK1⁃Parkin信号通路及NIX/FUNDC1受体介导途径来增强线粒体自噬水平有关^［66］。将延龄草85%乙醇洗脱物分为高、中剂量组（87.6、43.8 mg/kg）对心肌缺血模型大鼠进行灌胃，结果显示两种给药量均可显著对抗结扎冠脉导致的大鼠ST段、T波的异常升高，并且降低心肌梗塞的范围，对心肌缺血造成的损伤有保护作用^［67］。有研究表明，浓度为1 mg/mL的延龄草总皂苷提取液每天3mL给大鼠灌胃一次，可显著增强糖尿病大鼠心肌内抗氧化酶活性及减轻脂质过氧化，抑制心肌细胞凋亡，减少胶原纤维沉积，达到预防或延缓心肌病变的发生^［68］。延龄草皂苷pennogenin⁃3⁃O⁃α⁃L⁃rhamnopyranosyl⁃（1→4）⁃［α⁃L⁃rhamnopyranosyl（1→2）］⁃β⁃D⁃glucopyranoside高、中剂量组（17.14、8.86 mg/kg）和PS Ⅶ高、中剂量组（26.86、14.28 mg/kg）可使急性心肌缺血模型大鼠血清中肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）的活性显著降低，ST段、T波明显降低，能明显减少心肌梗塞范围^［69］。

2.5 收缩子宫平滑肌

引起子宫异常出血（AUB）的原因很多，且失血过多会造成贫血，延龄草皂苷对子宫平滑肌有收缩作用，能增强收缩频率达到止血的目的。研究表明，延龄草中分离的偏诺皂苷pennogenin⁃3⁃O⁃α⁃L⁃arabinofuranosyl⁃（1→4）⁃［O⁃α⁃L⁃rhamnopyranosyl⁃（1→2）］⁃β⁃D⁃glucopyranoside对大鼠子宫具有收缩活性，在给药剂量为5~160 μg/mL时会剂量依赖性地增加大鼠子宫肌层条的阶段性收缩频率和强度，这可能为其在中药治疗AUB中的应用提供了参考^［70］。有研究表明，延龄草提取液经柱层析后得到的偏诺皂苷馏分在浓度增加到1×10^-5、3×10^-5、1×10^-4 g/mL时，能显著增强离体大鼠子宫平滑肌的收缩频率、收缩强度和收缩活力^［71］。

2.6 治疗脊髓损伤

脊髓损伤往往导致损伤部位以下的肢体瘫痪、水肿、大小便失禁或肌肉坏死等症状，部分患者甚至可能出现脊髓炎，最终导致呼吸系统病变而死亡。研究发现给药剂量为200 mg/kg的延龄草苷可对脊髓损伤的大鼠有保护作用，脊髓损伤过程中活性氧（ROS）诱发的氧化应激反应是其重要的损伤机制之一，而用延龄草苷处理后的大鼠脊髓内出现明显的抗氧化应激反应，有助于改善大鼠的运动功能并减少组织损伤，其抑制氧化应激反应的机制可能与激活Nrf2/ARE信号通路有关^［72］。研究表明延龄草苷浓度为12.50 μmol/L时能够显著提高PC12的细胞活力，降低细胞凋亡比例，其机制可能与提高抗凋亡蛋白Bcl⁃2的表达有关^［73］。经MTT法和LDH活性测定观察延龄草苷对肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株（PC12）细胞的影响，结果为5、10、20 μmol/L的延龄草苷均可提高H₂O₂诱导的PC12的细胞活力，抑制PC12细胞凋亡，降低炎症因子的产生，对H₂O₂诱导的PC12细胞损伤起保护作用^［74］。

3 资源保育

延龄草有很高的药用价值，但目前药材资源稀缺，以下对延龄草的保育技术进行分析，以期为后续延龄草的人工种植、种质资源创新及资源开发等工作提供参考。

3.1 组织培养研究

植物组织培养是一种可靠的植物保育方式，即将植物种子、根、茎、叶等外植体灭菌处理后接种到含有不同激素配方的培养基中，植物组织根据激素的不同在培养瓶中进行繁殖、生根或愈伤分化等生长过程。延龄草的植物组织培养研究有助于缓解其资源紧缺的问题。将延龄草的根及根茎、根尖、茎、叶片为外植体材料，进行愈伤组织诱导，发现以根茎为外植体，培养基为1/2MS+1.2 mg/L BA+0.6 mg/L IAA时诱导的愈伤组织最多，且愈伤组织较大、紧密、呈浅黄色，活性较高^［75］。有研究发现延龄草根茎为愈伤诱导的最适材料，培养基为1/2MS+1.2 mg/L BA+0.5 mg/L IAA，诱导率高达83.3%，后续的芽分化中最适培养基为1/2MS+1.2 mg/L BA+0.6 mg/L IAA，分化率37.5%^［76］。不少研究也表明延龄草根茎为最适外植体，且在培养基中添加100 mg/L氨苄青霉素和1.0 g/L活性炭可降低根茎组培污染率及褐变率^{［77，78］}。将延龄草根尖、块茎诱导成愈伤组织，且成功将愈伤组织分化成苗，进而得到正常生长、发育的再生植株^［79］。在延龄草体细胞胚诱导的研究中发现，培养基配方为MS+1.0 mg/L 6⁃BA+0.5 mg/L NAA适合诱导延龄草的胚性愈伤组织分化和胚状体的发生，但未成熟的种子诱导增殖慢，且诱导出的胚状体多处于发育早期阶段，继续培养不能进一步发育成熟^［80］。

3.2 人工栽培技术研究

对延龄草的人工栽培技术进行研究，发现延龄草属于阴生植物，喜阴凉、耐寒，最适生长温度在12~25 ℃之间，气温高于28 ℃则生长受到抑制，延龄草在自然光照下植株矮小，在进行人工栽培时，应选择阴凉处肥沃疏松的土壤，并且要遮荫栽培，荫蔽度在85%左右，栽培地应在湿润多雾、温度较低的高海拔地区，土壤须肥沃疏松、富含有机质，且是砂质土壤^［81］。延龄草的有性繁殖，将采摘好的延龄草浆果洗净去除果皮、果肉，晾干的种子与细腻湿润的河砂按1∶5比例混拌均匀，于室内、室外储藏，在秋季11月份播种或来年3月、4月化冻后播种，育种地选择排水良好的壤土或沙壤土，将种子筛去河砂后播种，延龄草种子有休眠期，播种后2~4年才能出苗，在此期间应保持种植田间的温湿度，及时除杂草，保持通风条件良好。出苗后的第二年结合松土及追肥，秋季倒苗后可进行移栽，若当年不移栽，须加盖一层1~2 cm厚的腐熟肥或优质腐殖土，待来年春季出苗后再进行移栽。延龄草的无性繁殖材料为其根茎^［82］，在倒苗后和发芽前进行切块繁殖，挖取延龄草根茎，用刀将带芽眼的根茎切块，切下动作利索迅速，避免切口处出现裂纹，造成伤口感染，让创面沾上地灰进行消毒，作为繁殖体；带全芽横切及斜切的延龄草根茎长势旺，出苗早，单株出苗及叶片数多，植株大；用整个根茎作为繁殖材料的繁殖系数可达1∶8，且切块繁殖的延龄草1年生植株的叶片也比种子繁殖的3年生植株大，切块繁殖的第3年即可开花结实。在对延龄草地下根茎的无性繁殖研究中发现，与种子繁殖相比，延龄草从出苗到入药收获时间缩短了12个月，单株根茎平均干重比种子繁殖的重0.3 g，增重系数为6%^［83］。采用延龄草种子进行有性繁殖的生产方法繁殖速度慢，且由于野生资源短缺，延龄草种子难以获得，很难进行大规模生产，将延龄草多年生的粗根茎进行切块繁殖，是扩大生产、增加其药材产量的有效途径。

4 总结与展望

延龄草作为民间常用的传统药材，具有镇静安神止痛、活血祛瘀、治疗跌打损伤等功效，现代被用于抗肿瘤及抗炎、抗衰老等药物的开发。皂苷类成分是延龄草的主要有效成分，其他有效成分如多糖、鞣质等的研究较少。延龄草的主要有效成分重楼皂苷Ⅶ有抗肿瘤及抗炎等活性，能保护心肌细胞且对耐药性癌细胞表现出抑制作用，有待作为癌症、心肌炎等疾病的单体药物进行研发。外国学者对于延龄草单体化合物的研究相对较多，在分析其化学结构的同时也对其进行药理活性分析，分离出的有效成分有待作为单体药物进行更深入的研究。国内对延龄草的药理活性研究多集中在其总皂苷方面，对单体化合物进行研究的报道较少，且单体化合物发挥药效作用的机制与其化学结构之间的关系有待阐明。延龄草皂苷对中枢神经系统有一定的影响，可改善AD模型及衰老模型大鼠的学习记忆能力，还能减轻脑缺血对大鼠神经元的损伤，在内科疾病的治疗中，以延龄草为君药，辅以川芎、白芍，用以治疗脑震荡后遗症^［84］；治疗神经衰弱，则以延龄草辅以养心安神的酸枣仁，加鸡蛋补益气血，对用脑过度所致的心神劳伤有很好的疗效，因此可将延龄草作为阿尔茨海默病、缺血性脑卒中及偏头痛等中枢神经类疾病的研发药物，进一步开发其药用价值。有关延龄草凝血止血、镇静催眠、调节免疫系统等的研究也有报道，但其发挥药效的主要成分是否为皂苷类成分还有待进一步深入研究。延龄草传统功效与其抗癌、抗炎等药理活性关联性不大，后续可增加其临床应用与药理活性相结合的关联性研究。

目前对延龄草的研究主要集中在其化学成分及药理活性成分方面，但在植物保育方面的研究较少。延龄草种子繁殖速度慢，且萌发率低，采用延龄草根茎进行无性繁殖速度较有性繁殖快，适合用于大规模生产。目前延龄草离体培养仍存在难以建立稳定的无菌体系、愈伤组织诱导率低、易褐化及诱导分化困难等问题，解决延龄草根茎自带内生菌及微生物引起的污染问题，确定适合的培养基配比以提高愈伤诱导率及分化率。因此建立稳定的延龄草组织培养无菌体系进行快速繁育，是解决延龄草药材资源紧缺的有效途径。

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基金资助

国家自然科学基金(82160723)

广西自然科学基金(2020GXNSFBA159018)

广西自然科学基金(2021GXNSFAA196054)

珍稀濒危药用资源保护与可持续利用关键技术研发(桂科AD22080012)