叶绿体色素实验的安全改进

摘要

分析“叶绿体色素提取、分离及理化性质鉴定”实验的安全隐患因素有：易燃易爆危化品、易制毒危化品、强腐蚀性、有毒化学品。基于此，对实验进行相应的改进：指导学生检测乙醚中是否存在过氧化物；减少易燃易爆危化品和易制毒危化品的用量；降低强酸、强碱的浓度；改用低毒药品替代有毒、易制毒危化品，尽可能消除爆炸、化学腐蚀性灼伤、中毒、易制毒危化品流失等隐患，抓实抓细安全措施，防患于未然。

Graphical abstract

关键词

叶绿体色素 / 提取 / 分离 / 理化性质鉴定 / 安全隐患 / 火灾 / 腐蚀

“叶绿体色素提取、分离及理化性质鉴定”实验，是学生深入理解叶绿体色素性质的非常重要的实验，师生都对此实验进行了许多研究，但研究主要集中在对“叶绿体色素提取、分离”实验方法的改进上^［1-2］，而涉及“叶绿体色素理化性质的鉴定”实验方法的改进、药品的安全性研究却不多^［3］。近年来，实验室安全事故时有发生，教育部高度重视实验室安全管理，要求强化实验室风险管控和隐患排查^［4-5］。笔者所在学校采用的是李小方等^［6］主编的《植物生理学实验指导》（第5版，以下简称“教材”）。在“教材”第2版中，“叶绿体色素提取与分离”和“叶绿体色素理化性质”是两个独立的实验^［7］，在后续版本中将两者合并为综合性实验“叶绿体色素提取、分离及理化性质鉴定”实验，体现了实验设计的科学性，在很大程度上激发了学生的实验兴趣。但该实验使用的危化品较多，如易燃易爆、易制毒危化品的用量较大。

1 实验中的安全隐患

该实验含有的危化品为：乙醚、丙酮、甲醇、盐酸、氢氧化钾、四氯化碳。乙醚、丙酮、甲醇都是易燃易爆危化品，属甲类火灾危险品、一级易燃液，其闪点都小于28 ℃。乙醚、丙酮、盐酸都是易制毒危化品，受到公安部门的特别管制；浓盐酸有强酸性，氢氧化钾有强碱性，都有极强的腐蚀性和强刺激性；四氯化碳、甲醇、乙醚、丙酮均易挥发并损害中枢神经系统，有引起中毒的隐患。

2 实验改进

2.1 使用乙醚前应认真检测是否有过氧化物

乙醚是危险性极强的危化品，闪点非常低，极易挥发，它的爆炸极限在1.85%～36.50%之间，爆炸下限较低，易燃易爆性都超过了其他易燃品。乙醚久置易生成过氧化物，这些过氧化物除过氧化乙醚外，还含有过氧化氢、二羟基二乙基过氧化物和亚乙基过氧化物等^［8］，都含有-O-O-过氧键，爆炸性很强。特别是亚乙基过氧化物为不稳定的三元环结构，具有剧烈的爆炸性。因此，在使用乙醚前，要指导学生认真检测是否有过氧化物。其方法是：用淀粉-KI试纸检验，若试纸显蓝色，说明有过氧化物存在。如果检测到乙醚中有过氧化物，需要指导学生向其中加入5%的FeSO₄或Na₂SO₃等还原剂，以除去其中的过氧化物。

2.2 减少易挥发、易燃易爆品的用量

实验室火灾事故调查表明：因易燃试剂使用不当引起的火灾占20%，故很有必要减少易燃试剂的用量。乙醚沸点低（34.6 °C），极易挥发，20 ℃时乙醚蒸气压为58.9 kPa^［9］。在“黄色素与叶绿素的分离”实验中，可在乙醚萃取液中加入KOH-甲醇溶液进行皂化，需要“用力摇动分液漏斗”使皂化反应更充分，这时会产生大量乙醚蒸气，使分液漏斗中的气压上升。乙醚用量越大，产生的乙醚蒸气压越高，安全隐患越高。学生若不及时排出分液漏斗中乙醚蒸气，则蒸气压过高易冲开分液漏斗旋塞，使KOH-甲醇溶液飞溅，极易对学生造成伤害。乙醚用量越多，爆炸隐患越高。为此，笔者尝试改进实验，把该实验中所有药品用量均减半（叶绿体色素提取液5.0 mL，乙醚10.0 mL，KOH-甲醇溶液2.5 mL），仍然能得到相同的实验效果，既降低安全隐患，又减少药品对师生身体的危害和对环境的污染。

2.3 降低强酸强碱的浓度

在“教材”的铜代反应中，需要向色素提取液中加入浓盐酸，但浓盐酸是强酸（浓度为12 M，36%～38%），发烟液体，极易挥发，取用时会冒出刺鼻的白色酸雾，强烈刺激人的眼睛、呼吸道等，具有强腐蚀性。铜代反应的化学反应式（原理）如图1所示。

往叶绿素（绿）中滴加酸液，Mg²⁺被H⁺取代，生成去镁叶绿素（褐），再加入铜盐，加热，则去镁叶绿素中心的H⁺又被Cu²⁺取代，生成铜代叶绿素（绿）。为此，笔者尝试逐渐降低酸液的强度，从强酸到弱酸，努力减少危化品的危险。其实验结果如表1所示。

在去镁反应后的溶液中进行铜代反应，即分别向其中加入0.02 g醋酸铜并加热，发现溶液都变为绿色。其中，滴加0.1 M盐酸和50%醋酸的溶液中的铜代反应经1～3 min后就变为绿色，现象更快、更明显。但醋酸有强烈的刺激性及腐蚀性蒸气，当其超过25%浓度时，需要戴眼罩操作。综合考虑后，笔者决定选用0.1 M盐酸，不仅效果最佳，而且安全、节约易制毒危化品用量。

“教材”中的“黄色素与绿色素的分离”皂化反应，需要“加入5 mL 300 g/L氢氧化钾的甲醇溶液”。配制的KOH-CH₃OH溶液浓度为30%，浓度过高。氢氧化钾是强碱，腐蚀性很强；若配制30%浓度时，剧烈放热，呈沸腾状，则易于溅出；如果未待冷却就塞紧瓶塞并摇动瓶身，往往有爆炸的隐患。因此，笔者尝试降低KOH的甲醇溶液浓度（20%→10%→5%），充分反应后，都能出现明显的“上黄下绿”分层，说明叶绿素（双羧酸酯）在5%氢氧化钾溶液中就能水解，产生的叶绿酸与KOH反应生成叶绿酸盐（皂化叶绿素），而叶绿酸盐会溶解于下层水中，显绿色。说明：配制5% KOH的甲醇溶液时，放热缓和，比较安全。

甲醇是两个反应物的共同溶剂，既能溶解叶绿素酯类化合物，又能溶解KOH，且能使反应物融为均一的液体，增大反应物接触面，加快皂化反应速率。乙醇中-OH的极性也能使NaOH、KOH溶于乙醇中，因为甲醇有毒、KOH中等毒，所以笔者尝试用低毒、无毒药品代替这些毒性强的危化品进行实验，选用乙醇替代甲醇、NaOH替代KOH，其实验结果如表2所示。

综合考虑，选用5% NaOH-CH₃OH溶液为最佳，其碱性、腐蚀强度都大幅度降低（图2）。

2.4 寻找低毒、无毒药品

“教材”中使用四氯化碳作为纸层析液，易挥发，对肝、肾、肺等脏器有严重损害，有致癌隐患，同时严重污染地下水，已被严格限制生产，不易获得。查阅文献涉及的层析液有很多种：V_石油醚∶V_乙醚=4∶1^［10］、V_石油醚∶V_丙酮∶V_苯=20∶2∶1或V_石油醚∶V_丙酮∶V_苯=40∶1∶1和“93号汽油+几滴苯”^{［3，10-11］}。苯毒性极大，属于一类致癌物，丙酮、乙醚也都是易制毒危化品，汽油极易燃烧，闪点为-50 ºC，燃爆危险性太高，都不是令人满意的层析液。色素分离原理是叶绿体中的4种色素极性不同，导致它们在层析液中的溶解度也就不同。

笔者采取调整层析液的组成和配比的方法来进行4种色素的分离，从中寻找低毒试剂作为层析液，以期使实验安全、环保。乙酸乙酯和石油醚的危害性相对较低，且都不是易制毒危化品，笔者尝试用乙酸乙酯和石油醚混合液替代四氯化碳，因从极性看，乙酸乙酯>四氯化碳>石油醚，故决定配制6种不同配比的乙酸乙酯和石油醚进行实验，且选用高沸程（90～120 ℃）的石油醚，确保更安全。不同层析液对实验的影响如表3所示。

实验结果显示：在V_石油醚∶V_乙酸乙酯=10∶1和9∶1中，分离效果更好，4个明显的色素带从上到下为——橙黄色胡萝卜素、黄色叶黄素、蓝绿色叶绿素a、黄绿色叶绿素b。

3 结语

努力营造浓厚的实验室安全氛围，可以增强师生的实验安全防范意识和能力；利用化学原理和技术从源头减少环境污染，就是将“绿水青山就是金山银山”的理念融入实验教学中，自然有利于创建安全、对环境无显著毒副作用的绿色实验室。

参考文献

[1] 邓照楠，张旭梅，王朝君，等.“绿叶中色素的提取和分离”实验改进［J］.中学生物教学，2023（21）：66-68.

[2] 陈立东，寇小永，张明旭.“叶绿体中色素的提取和分离”实验改进综述［J］.中学生物教学，2023（15）：36-38.

[3] 杨雪峰.“叶绿体中色素的提取和分离”实验探索与改进［J］.中学生物教学，2018（17）：55-57.

[4] 周家艳，余洋，辛晓军.高校实验室安全风险评估研究进展［J］.实验教学与仪器，2021，38（10）：74-76.

[5] 周家艳.国内外高校实验室安全管理比较研究［J］.实验教学与仪器，2022，39（06）：72-74.

[6] 李小方，张志良.植物生理学实验指导［M］.第5版.北京：高等教育出版社，2016.

[7] 张志良.植物生理学实验指导［M］.第2版.北京：高等教育出版社，1990.

[8] 杭州大学化学系分析化学教研室.分析化学手册第1分册·基础知识与安全知识［M］.北京：化学工业出版社，1997.

[9] 姜涛，王鑫，张宏坤，等.无机化学［M］.哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社，2012.

[10] 陈建勋，王晓峰.植物生理学实验指导［M］.广州：华南理工大学出版社，2015.

[11] 人民教育出版社，课程教材研究所，生物课程教材研究开发中心.普通高中课程标准实验教科书生物学必修一·分子与细胞［M］.北京：人民教育出版社，2007.

基金资助

国家自然科学基金“干旱胁迫下茉莉酸调控甘薯块根分化建成的机制解析及其应用”(32272221)

江苏高校品牌专业建设工程资助项目