“探究抗生素对细菌的选择作用”实验优化及拓展

摘要

基于抗生素的滥用会导致致病菌产生耐药性这一问题，在高中生物学“探究抗生素对细菌的选择作用”实践活动基础上，对比传统中药材和抗生素对大肠杆菌的抑制效果，进一步探究中药和抗生素对大肠杆菌耐药性变化的影响，证实合理使用抗生素的必要性并为探索中药抗菌指明了方向。

Graphical abstract

关键词

中药 / 抗生素 / 大肠杆菌 / 耐药性 / 实验拓展

“探究抗生素对细菌的选择作用”实验，是新人教版高中生物学必修2第6章第3节新增的探究实践活动，为“适应是自然选择的结果”这一核心概念提供了有力的实证支持。本实验所涉及的实验操作是必修课程中的全新内容，同时与选择性必修3课程中的“生物技术与工程”相吻合，因此引导学生开展并拓展本实验，有助于提升学生的科学探究能力和科学思维，落实学科核心素养。

随着抗生素的广泛应用，越来越多的病原菌产生了耐药性，且耐药性较为严重^［1］。若对细菌的耐药性处理不好，导致其发展成超级菌，则会给感染病人带来巨大挑战，对社会造成的损失将难以估量^［2］。中草药对细菌具有一定的抑制效果，因其低毒性、无残留以及耐药性发生率低等独特优势，广泛应用于临床治疗各种感染性疾病^［2］。有学生提出中药可作为抗生素替代品缓解耐药性问题的假说，并进一步查阅文献了解到黄芩和夏枯草对大肠杆菌的抑制效果较好^［2］。本实验选取黄芩、夏枯草以及四环素为实验材料，用含有药物的滤纸圆片贴在由涂布平板法接种的固体培养基上，若细菌生长受到抑制则形成透明圈。在探究中，学生采用了更为精确便捷的打孔法测定药物的抑菌圈直径，根据培养基上出现的抑菌圈的直径变化来比较中药和抗生素对大肠杆菌的抑菌效果，经连续三代培养并观察抑菌圈的直径变化来反映中药和抗生素对大肠杆菌耐药性变化的影响。

1 材料与器材

属于中药材的黄芩、夏枯草，以及盐酸四环素、大肠埃希氏菌ATCC25922（E. coli）、LB琼脂培养基、LB液体培养基、无菌水、移液器及移液器枪头、滤纸圆片、培养皿、接种环、涂布棒、酒精灯、质量分数为70%的酒精、烧杯、记号笔、直尺、镊子、EP管、打孔器、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、干热灭菌箱、震荡培养箱。

2 实验操作与过程

2.1 制备菌液、抗生素和中药浓缩液

将实验室冻存的甘油菌种置于固体培养基上，经划线活化后再放置于培养箱中恒温（37 ℃）培养18～24 h；挑选单菌落接种至100 mL液体培养基中，将其放置于恒温摇床上振荡培养16 h；最后，将得到的菌液放入冰箱保存备用^［3］。

用无菌水配制四环素溶液（50 ug/mL、150 ug/mL、250 ug/mL、350 ug/mL）保存备用；取黄芩和夏枯草各50 g并用无菌水浸泡1 h，再文火煎煮3次（I阶段90 min、Ⅱ阶段40 min、Ⅲ阶段30 min），合并3次药水后浓缩至100 mL，获得0.5 g/mL中药制剂^［4］；另取浓缩液10 mL浓缩至5 mL获取浓度为1.0 g/mL中药制剂，避光冷藏备用。

2.2 优选实验方法，精确分析抑菌圈变化

在探究过程中，学生发现传统涂布平板法存在菌体分布不均、重复性差、效果不稳定等问题，且滤纸圆片间的微小差异、扩散系数等因素会造成抑菌圈不规整、直径测量误差大。针对以上问题，查阅文献后决定采用打孔法替代滤纸片法，并以预加菌液法替代涂布平板法^［4］。改进方法操作简便，获得的抑菌圈质量高，大大降低了测量误差，可保证平板中菌落的均匀性，提高了实验的可重复性。为了提高实验的可信度，避免一个平板中抑菌圈相互交叉影响，本实验所用的每种药品均采用多个平板重复试验。

2.3 实验流程

首先，将实验所需的仪器和培养基进行高压蒸汽灭菌处理，确保处于无菌状态；接着，利用倒平板法将菌种接种在培养基上，并在预留的孔中滴加适量的抗生素和中药，恒温连续培养24 ｈ。在实验过程中，小组成员认真测量并记录每一代的抑菌圈直径，将数据整理归纳后进行结果分析。实验设计流程见图1。

3 实验结果与分析

3.1 不同菌液浓度下获得的抑菌圈

实验结果如图2所示，从图中可以看出，最右侧未稀释的平板中菌生长速度过快，抑菌圈不明显。稀释200倍和500倍菌液浓度过稀，形成的抑菌圈不规则，测量误差大。当菌液稀释100倍时，平板菌落致密，抑菌圈界限明显，本实验均采用该稀释倍数。

3.2 四环素、黄芩、夏枯草适宜浓度的选择

四环素适宜浓度的选择如图3所示，从图中可以看出，在一定范围内，抑菌圈的直径随药物浓度增加而升高，当四环素浓度为250 μg/mL时，获得的抑菌圈大小在18～22 mm范围内，是理想抑菌圈。结合参考文献，用传统煎煮法获得的黄芩组、夏枯草组均在浓度为1 g/mL时获得理想的抑菌圈^［5］。因此，本实验采用的四环素、黄芩、夏枯草浓度分别为250 μg/mL、1 g/mL、1 g/mL，接下来将在3种药物的适宜浓度下比较抑菌效果。

3.3 不同药物抑菌效果对比

由表1可知，四环素组和黄芩组的抑菌圈直径分别为19.3 mm和19.2 mm，夏枯草组的抑菌圈直径明显小于前两组。由以上数据得出黄芩的抑菌效果与四环素相当，夏枯草略弱，因此黄芩被选为适宜的四环素替代品。后续实验将只比较适宜浓度下黄芩和四环素对大肠杆菌的选择作用。

3.4 四环素和黄芩对大肠杆菌的选择作用对比

由图4可知，在适宜浓度下，四环素组的抑菌圈逐代缩小，大肠杆菌对其抗性逐代增强。黄芩组的抑菌圈变化幅度小，大肠杆菌对黄芩的抗性变化不明显。四环素每一代与上一代抑菌圈缩小幅度超过20%，而黄芩组第二代与第一代抑菌圈仅缩小4.5%（表2），第三代与第二代基本无变化，表明大肠杆菌对黄芩的抗性无明显增强，可有效缓解抗生素带来的耐药性问题。进一步分析大肠杆菌对黄芩几乎不产生抗药性的原因可能是其不是单一成分^［6］，不能起到定向选择作用，从而不产生抗药性。查阅资料可知黄芩的主要抑菌成分为黄酮类化合物，包含黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷等，具体抑菌成分及含量需要进一步探究。

4 结语

本实验以四环素、黄芩、夏枯草为实验材料，探究并比较了不同药物对大肠杆菌的选择作用。四环素组验证了细菌耐药性是抗生素不断选择的结果，学生深刻意识到在日常生活中合理使用抗生素的必要性和重要性。黄芩对大肠杆菌抑制效果好且选择作用较弱，不失为替代四环素的较佳选择。在中药材中寻找新型抗菌药物已成为解决细菌耐药性的有效途径之一。但鉴于中药成分复杂，具体抑菌机制还在探索中^［7］，以及用药合理量及副作用仍不明了，建议慎重使用。学生在探究实验结束后，对以下几方面的进一步探索表现出浓厚兴趣：提纯中药有效成分以明确关键抑菌物质；中药使用时常常多方并用，探究不同中药叠加对细菌的抑制效果；中西医结合治疗被广泛应用，探究中药和抗生素联合使用的协同效应。

参考文献

[1] 司晨芳.浅谈抗生素滥用滋生“超级细菌”［J］.养生保健指南，2017（32）：293.

[2] 杨立顺，李东霞，耿婕.我国抗生素滥用研究现状与热点：基于科学知识图谱的可视化分析［J］.甘肃科技，2021，37（04）：34-37.

[3] 朱玲，张梦雨，房兴堂.“探究抗生素对细菌的选择作用”实验的再探究［J］.生物学教学，2025，50（01）：64-68.

[4] 黄衍强，黄宏思，张莲，等.6种中草药抗耐药性大肠杆菌的抑菌效果［J］.右江民族医学院学报，2009，31（03）：368-369.

[5] 程红梅，娄志义.“探究抗生素对细菌的选择作用”实验改进［J］.中学生物教学，2022（06）：54-56.

[6] 王娜.中药黄芪、黄芩有效成分的体外抑菌作用研究［D］.秦皇岛：燕山大学，2009.

[7] 程成，张薇，朱波，等.中药抗常见耐药菌的作用及其机制研究进展［J］.南京中医药大学学报，2019，35（02）：229-233.