素养导向的实验创新实践

摘要

对马鞍山市第二十二中学校园里采集的一些常见昆虫种类进行DNA提取、PCR扩增和测序，获得线粒体COI基因的DNA条形码序列数据，并基于基因序列数据构建系统进化树，采取形态学和DNA条形码证据相结合的方法共鉴定出7种校园昆虫。将教材实验内容具体化，在解决实际问题的同时，能形成相对完整、拓展创新的实验专题。

Graphical abstract

关键词

DNA条形码 / COI基因 / 昆虫鉴别 / 形态学 / 系统进化树

DNA提取、PCR扩增及电泳鉴定，是分子生物学的基本技术，也是人教版高中生物学选择性必修3中的有关基因工程章节的重要探究实践活动。3个紧密联系且成熟的实验技术，是DNA条形码技术中的关键要素。相对于其他基因序列而言，COI基因的结构相对保守且稳定，种间变异较大，可以作为不同物种乃至种内不同群体的有效分子标记。目前，COI基因的DNA条形码序列已成为现代昆虫学中用于近缘种鉴定、系统发育分析、种类鉴定的常用的候选分子标记^［1］，并在昆虫以及其他动物的分子标记鉴定方面得到了广泛应用。昆虫容易采集且易于提取DNA，是生物学的良好研究材料。笔者采取形态学与DNA条形码相结合的方法，组织学生对校园里的一些常见昆虫种类进行鉴定，并通过构建系统进化树，探讨各物种之间亲缘关系的远近，为它们的精准鉴定提供必要的科学依据；同时，提升学生的动手能力和应用能力。

1 材料与方法

1.1 昆虫的采集与形态学鉴定

2024.04—2024.05，学生在校园内用捕虫网等工具捕获昆虫，将其放入含有乙酸乙酯的自制毒瓶中，带回实验室。将采集的昆虫样品放入无水乙醇中固定，置于-20 ℃冰箱保存，备用。参考《中国动物志》《中国昆虫生态大图鉴》等文献，学习相关知识，对采集的样品中形体较完整的昆虫物种进行初步的形态学鉴定。

1.2 分子鉴定

（1） 基因组DNA提取及检测。

将昆虫从无水乙醇中取出并置于滤纸上晾干，选取昆虫的相应部位组织适量（例如：蝴蝶选用胸部肌肉，甲虫选用整个头部），经充分研磨后，将粉末置于1.5 mL离心管中，利用动物DNA提取试剂盒提取基因组DNA。采用紫外分光光度计对提取各样品的总DNA进行检测，即可计算出DNA样品的浓度，再利用OD260/OD280的比值检测DNA的纯度。

（2） PCR扩增与测序。

用于扩增COI基因的通用引物序列为：LCO1490：5'- GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'和HCO2198：5'- TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'^［2］，该引物可特异性地扩增线粒体COI基因片段。昆虫COI基因全长约1 500 bp，常用于分析的长度在650 bp左右。

PCR反应总体积为50 μL，反应体系包括：DNA模板2 μL，10 μmol/L引物各1.5 μL，2×Taq PCR Master Mix预混液25 μL，加ddH₂O补充至50 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min，按下列参数进行35个循环：94 ℃变性60 s，47 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s；72 ℃总延伸600 s^［2］。取5 μL PCR扩增产物和7 μL DNA Marker，将两者加入混有5 μL核酸荧光染料的1%琼脂糖凝胶中，120 V电泳25 min，再将其置于紫外分析仪中观察并拍照留存。最后，将PCR产物送至生物公司测序。

（3） DNA序列比对与系统进化树的构建。

利用DNAstar软件中的MegAlign软件对测序所得的序列进行校对和拼接，去除引物区和低质量端序列，再将拼接好的序列保存为FASTA格式。在NCBI官网上，利用BLAST功能搜索比对实验获得的COI基因序列，并将数据库中相似度最高的序列下载。从GenBank数据库中下载8种昆虫和1种蜘蛛的COI基因序列（表1），基于所获得的测序序列，使用MEGA 11软件，并基于K2P进化模型以邻接法（NJ）构建系统进化树。说明：需要经历1 000次重复抽样自举检验，以评估系统树各分支的置信度。

2 结果与分析

2.1 DNA提取的结果

利用试剂盒提取昆虫的基因组DNA，经紫外分光光度计检测样品的DNA浓度，发现均大于135 ng/μL，且OD260/OD280比值多数在1.6~1.8之间，这说明提取的DNA效果较好，有利于后续PCR的扩增实验。

2.2 形态学鉴定结果

兴趣小组成员共采集校园常见昆虫23只，每个样品可重复捕获，包括蝴蝶、甲虫、蚁类等。鞘翅目昆虫占比最高，达到69.5%，其中有2种昆虫样品的形态学鉴定未获得准确结果，仅初步鉴定为瓢虫属和弓背蚁物种。鉴定出的昆虫种类见表2与图1。

2.3 PCR扩增的结果

针对形态学鉴定的样品，进行PCR扩增及电泳鉴定实验。电泳的结果见图2，电泳条带均比较清晰，无明显非特异性条带，PCR扩增的COI基因条带约700 bp。

2.4 分子鉴定结果

7种不同形态昆虫的COI基因序列均成功获得，与GenBank中下载的同源序列比对并处理后的总长度为601 bp，A+T含量在61.7%~69.9%之间，平均含量为66.6%。选取蛛形纲蜘蛛目的灌水新园蛛（Neoscona adianta）作为外类群，构建NJ系统进化树。在NCBI中进行BLAST比对，与已有的同物种数据相似度均大于99%。

基于COI基因构建的系统进化树（图3）。从进化树上可以看出，鳞翅目的菜粉蝶和斜纹夜蛾的亲缘关系较近，七星瓢虫和异色瓢虫亲缘关系较近，鞘翅目鳃金龟科的大黑腮金龟与瓢虫科亲缘关系较近，膜翅目的日本弓背蚁与鞘翅目的昆虫亲缘关系相对较近。

以往研究表明，DNA条形码可以将未知分类的物种准确地分类到各个种属当中，该实验结果同样支持这个观点，即7种昆虫与数据库中的物种均单独聚类，且形态学未准确鉴定的瓢虫与异色瓢虫聚在一起，另有形态学未准确鉴定的弓背蚁与日本弓背蚁聚类。

3 结语

3.1 形态与分子鉴定

实验采取传统形态学和分子鉴定相结合的方式，实现了两种方法的相互检验和相互补充。例如，形态初步鉴定为瓢虫科的物种由于体型偏小，背部星形及数目不明显，因此不能准确判断它们的具体种类，而通过DNA条形码分子鉴定为异色瓢虫。

若样本保存完整，一般可通过传统形态学鉴定，但是需要鉴别者具备丰富的分类知识。目前，GenBank等数据库已经涵盖较多的常见物种，而分子鉴定需要具备分子生物学、生物信息学等技能^［3］，所以带领学生完成常见物种的分子鉴定是切实可行的。

3.2 落实核心素养

实验采用线粒体COI基因的通用引物，优化DNA提取和PCR过程，成功扩增出7种不同昆虫的COI条形码序列。DNA提取、PCR扩增及电泳鉴定，是分子生物学的基本技术，也是高中教材中的重点探究实践活动。例如，DNA条形码技术很好地整合了相关的几项技术及基因测序分析等技术，改变了以往中学实验中存在的“为提取而提取、为扩增而扩增”的技术割裂问题。另外，学生亲手采集校园昆虫样本，立足生活情境，自然会关注昆虫多样性保护等热点知识。再者，为了得到理想的电泳结果并便于PCR产物测序，学生对样品进行多次试验，通过实践操作，提升了分子生物学基本技术的操作能力。同时，他们还学习了从GenBank数据库中下载序列，利用网站中BLAST工具搜索序列比对相似度等知识点，又学到了基本的生物信息学分析方法，有助于激发起其对生物学的学习兴趣。

如前所述，DNA条形码技术是连接高中生物学与现代前沿科学技术的桥梁。该实验专题让学生真实体会到科学研究的一般过程，从而锤炼了他们的科学思维能力，并培育了他们的科学创新精神。

参考文献

[1] 陈梦义，何万存，郝德君.DNA条形码在昆虫学中的研究概况［J］.温带林业研究，2020，3（03）：15-20.

[2] 吴冬霞.线蛱蝶亚科部分种类线粒体Cytb及COI基因分子系统学研究［D］.芜湖：安徽师范大学，2007.

[3] 何锴，王文智，李权，等.DNA条形码技术在小型兽类鉴定中的探索：以甘肃莲花山为例［J］.生物多样性，2013，21（02）：197-205.

基金资助

2024年度马鞍山市教育科学研究规划课题“基于创新能力培养的高中生物学项目式学习实践研究”(MJG24018)

2024年度安徽省教科研项目“基于‘C-POTE’模型的初中生物学综合实践活动研究”(JKT24129)