应用共聚焦显微镜技术观察蛋白质液-液相分离

摘要

为使科研反哺教学，可在实验教学中引入激光扫描共聚焦显微镜，指导学生开展蛋白质液-液相分离成像与荧光融合蛋白亚细胞定位实验。通过此实践，学生不仅能深入掌握该仪器的原理、操作与结果分析，还能对相分离这一科研热点建立直观认知，从而为未来的科学研究奠定方法与技术基础。

Graphical abstract

关键词

共聚焦显微镜技术 / 蛋白质液-液相分离 / 激光扫描技术

液-液相分离是细胞内一种关键的生物分子聚集现象，已成为生化与细胞生物学的新兴研究热点。它通过特定分子的细胞内聚集，形成稳定的结构“秩序”。这种相分离机制促进了细胞内分子的动态、可逆聚集与解聚，对调控生物学反应、隔离非相关分子具有关键作用，对细胞结构和功能的调控至关重要。因此，深入研究蛋白质液-液相分离有助于更透彻地理解细胞内部结构与功能，以及疾病的发病和发展机理^［1］。随着技术的不断革新，激光扫描共聚焦显微镜（以下简称CLSM）在观测这一过程中展现出独特优势^［2］。CLSM作为一种先进的细胞生物医学分析仪器，在荧光显微镜成像基础上融入了激光扫描装置，采用紫外光或可见光激光荧光探针，并结合了计算机图像处理技术。在检测蛋白质液-液相分离时，CLSM具备高清晰度成像、实时动态监测、荧光标记及多通道成像等显著优点^［3］。

贵州大学教育部西南药用生物资源工程研究中心的蔡司CLSM（LSM900）在过去几年的开放共享中，得到了各大学院师生的积极送样支持。在样品拍摄过程中，笔者虽然观察到许多功能蛋白质分子存在液-液相分离现象，但遗憾的是，这一现象并未得到导师和学生的充分重视，导致课题研究遭遇瓶颈，且未能及时追踪到新现象。鉴于贵州大学生命科学类相关专业的实验条件、科研方向及学生的基础知识状况，笔者特别设计了采用CLSM观察蛋白质液-液相分离现象的实验教学项目。该项目以番茄黄斑驳相关病毒（TYMaV）-GFP融合蛋白为研究对象。近几年发现，该病毒主要是通过其衣壳蛋白形成液-液相分离，从而加速病毒的复制并增强致病能力^［4］。主要实验流程如下：①载体构建。克隆目标蛋白基因，构建与绿色荧光蛋白（如GFP）融合的重组表达质粒。②农杆菌转化。采用冻融法将重组质粒转入农杆菌感受态细胞。③植物转化与表达。通过农杆菌介导的瞬时转化法侵染本氏烟草叶片，暗培养2 d后于光照下继续培养1～2 d，诱导蛋白表达。④CLSM成像。取叶片下表皮制作临时装片，使用CLSM观察GFP荧光信号，记录蛋白定位与可能的凝聚体。⑤FRAP验证。对观察到的凝聚体进行荧光漂白后恢复实验，通过分析荧光恢复曲线验证其是否具备LLPS典型的动态特性^［5-7］。该实验将基因克隆、载体构建、细菌培养、烟草叶瞬时表达技术和CLSM技术进行了有机串联，实验过程涵盖了细胞样本处理和CLSM检测技术的综合运用。该实验项目不仅将CLSM技术的理论教学与实际操作能力培养有机结合，还让全校生命科学领域的学生了解到最新的研究热点和前沿科学进展。此外，该项目还为本科生考研深造及研究生实验开展打下了坚实基础，有助于推动学校研究型本科生培养，以及科研与教学工作的相互促进。

1 实验试剂、材料与仪器

试剂与材料：带GFP标签的质粒、GV3101-P19农杆菌、RNA提取试剂盒、烟草嫩苗等。

仪器：CLSM（核心检测设备，Zeiss LSM 900）、超净台、摇床等。

2 实验方法

2.1 样本制备

参考文献^［5-6］采用PCR扩增方法克隆获得包含TYMaV衣壳蛋白全长的核苷酸编码序列的基因产物，并构建相关质粒。经双酶切验证及测序确认序列正确后，将重组质粒采用冻融法转入GV3101农杆菌感受态细胞中进行转化；转化后的农杆菌在LB液体培养基中过夜振荡培养，直至菌液浓度OD₆₀₀达到0.8的最佳值。之后，以5 000 r/min的速度离心5 min收集菌体。随后，采用农杆菌介导法侵染本式烟草叶片，同时设置带有GFP标签的空载菌液侵染叶片作为对照组，在黑暗条件下培养2~3 d后，使用CLSM观察荧光信号并拍照记录。

2.2 上镜观察

（1） 仪器的开机与调试。

实验使用CLSM Zeiss LSM 900仪器。其操作流程如下：首先开启稳压电源，随后依次启动System、Components、Laser module、显微镜电源、电动载物台电源、X-CITE和电脑。接着，运行ZEN软件，仪器将自动进入自检状态。将样品倒置于显微镜上，并调整焦距，确保目标区域位于视野中央。采用单通道检测，激发光波长为488 nm，发射波长范围为500~550 nm，通过T-PMT检测器采集明场信号和GFP发出的绿色荧光信号。

（2） 样本的检测与图像的采集。

在Locate界面，选择快捷键定位并观察需拍摄样品区域，将其移至视野中央。进入Acquisition界面，新建光路设置（Smart setup），并选用Best signal拍照模式。在Live模式下，调整激光强度、针孔大小和电压值等参数；同时在Acquisition mode下，设置扫描速度、扫描次数、扫描方向和像素大小等。完成参数设置后，先进行2D图像采集。

基于2D图像，进一步采用时间序列模式和光漂白扫描方法（FRAP模式）进行成像。蛋白质液-液相分离在镜下成像的特征包括：生物分子凝聚体在胞内沿骨架移动，小凝聚体融合成大凝聚体或大凝聚体分离成小凝聚体，以及凝聚体经荧光漂白后恢复。为更好地观测细胞实时动态，在进行时间序列模式设置时可降低分辨率、增加扫描速度。在FRAP实验中，先采集标准图像，选择漂白区域，增大激光强度并设定漂白次数以实现荧光快速淬灭，结合时间序列扫描方式完成荧光漂白恢复实验^［8］。

3 实验结果与讨论

该实验教学强调理论与实践的结合，在操作过程中不仅详细讲解相关理论知识、操作步骤与技巧，还会针对观察到的实验现象提出思考问题，以促进学生深入理解并将所学理论应用于实践。基于此，该实验将从实验结果分析和仪器使用注意事项两个维度进行全面阐述。

3.1 TYMaV-CP-GFP融合蛋白表达和定位分析

烟草叶瞬时转化实验通过农杆菌将外源基因导入烟草叶片进行表达，对生物学研究具有重要意义，可用于蛋白质亚细胞定位、转录活性鉴定、蛋白互作及纯化等。为研究TYMaV病毒浸染机制，借助实验观察病毒衣壳蛋白CP的表达特性。结果显示，单纯GFP荧光蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核均有分布。而TYMaV-CP-GFP蛋白主要分布于细胞膜和细胞质，且在细胞质中可见不断运动的荧光凝聚体，结果见图1（图1中A、B、C是单纯的GFP荧光标签蛋白图，A是荧光分布图，B是明场，C是A和B的叠加场。D、E、F是目的基因的表达定位图，TYMaV-CP蛋白没有荧光，GFP有荧光，将TYMaV-CP和GFP蛋白融合在一起表达，就可指示目的蛋白的表达定位）。

进一步通过荧光光漂白恢复实验，对凝聚体进行3次激光漂白直至荧光强度降至50%以下，并记录荧光恢复情况。结果显示，停止漂白后70 s内，绿色荧光信号逐渐恢复，强度达到原始水平的75%以上，结果如图2和图3所示。这表明TYMaV-CP-GFP蛋白形成的凝聚体具有液态属性。

3.2 CLSM成像操作规范

CLSM是科研中心的重要精密仪器，使用时须严格遵守操作规程。特别关注控温控湿控尘。保持温度在20 ℃左右，湿度在40%~60%范围内，避免过低导致静电问题，过高则可能损坏激光器。CLSM Zeiss LSM 900作为全自动化设备，若频繁长时间运行，则易损坏电子配件，因此使用时Gain值初始应设置为550左右，并缓慢调整，避免大幅波动以防损坏高压板。建议：优先使用目镜聚焦视野，减少“Live”模式时间，以延长仪器使用寿命。使用后，按顺序关机，但保持激光器光源开启，以确保与主机信号连接稳定，进一步延长使用寿命^［9-11］。

4 结语

本实验聚焦于CLSM的使用与技术掌握，以植物病毒致病蛋白为研究对象，整合烟草叶瞬转技术、细菌培养和载体构建等技术，实现知识点的广泛覆盖与有机衔接。通过教师演示与学生实践相结合的教学形式，学生掌握了常用荧光检测方法，并深化了对CLSM技术的理解。

此次实验成功融合了教学与科研，课堂氛围积极，学生提问踊跃，师生互动成效显著。实验不仅锻炼了学生的动手能力，还初步培养了其科研分析能力。在实验尾声，学生围绕实验结果讨论并设计后续实验方案，旨在明确凝聚体在病毒浸染植物中的作用，多数学生能够积极发言并提出合理的设计，彰显了实验教学的良好成效。

该实验将当前科研热点融入本科教学，使学生在掌握基础知识的同时，也能紧跟最新科技动态，成为课外专业学习的有效补充和拓展。通过开放实验课，能够锻炼学生的实践操作能力，提升其专业实验技能、综合分析能力及解决问题的探索能力；有助于学生树立团队合作意识，培养创新精神，增强自主学习能力。此外，该实验还促进了资源共享，提高了实验室及大型仪器的使用效率。

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基金资助

贵州大学2025年实验室开放项目(SYSKF-2025-074)