遵义朝天椒提取液抑菌实验教学探究

摘要

基于人教版高中生物学“抗生素对细菌的选择作用”内容，模拟教材实验并增设植物提取液与抗生素联合抑菌的跨学科探究。经连续4代传代筛选，金黄色葡萄球菌对青霉素耐药性显著增强，F₄代抑菌圈直径≤6 mm，几近无抑菌效果。采用无水乙醇超声提取法制备遵义朝天椒不同部位提取液，经滤纸片法测试，发现叶片抑菌显著，果皮次之，种子无效；叶、皮与青霉素联用可增强效果，种子无协同作用，显示叶、皮具有潜在抗菌价值。该实验通过自主设计与多变量分析，能有效提升学生的科学探究与生物学核心素养。

Graphical abstract

关键词

遵义朝天椒 / 提取液 / 教学研究 / 青霉素 / 菌株 / 抑菌作用 / 生物学核心素养 / 耐药菌

“探究·实践　探究抗生素对细菌的选择作用”是人教版（2019年版）高中生物学必修2《遗传与进化》第6章第3节的内容，也是《普通高中生物学课程标准（2017年版2025年修订）》建议开展的活动，其目标是认识抗生素滥用与耐药菌出现的关系。但教材对培养基制备、供试菌活化等操作的细节未充分展开，且实验仅停留在“观察抑菌圈”，缺乏“耐药菌筛选—植物提取液验证—联合用药”的后续探究环节，导致学生探究的兴趣不浓。

为解决上述问题，笔者以本土材料遵义朝天椒（种子、果皮、叶片）为切入点，通过优化耐药菌筛选流程（如缩短传代周期至2 d/代）、增设朝天椒不同部位提取液的抑菌验证及与青霉素的联合实验，提升实验的趣味性与生活化；设计可在2~3节课时内完成的实验方案，为实验教学提供参考。同时，通过验证朝天椒叶、皮提取液对耐青霉素菌的显著抑菌作用及与青霉素的协同效果，为遵义朝天椒作为天然抗菌资源应对耐药菌问题，提供“教材实验拓展+本土资源开发”的新思路与可操作模式^［1］。

1 实验材料、试剂与仪器

1.1 实验材料

植物材料：遵义朝天椒（Capsicum frutescens）种子，购自当地农产品种子店。微生物菌株：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，菌株编号：ATCC 25923，购自中国菌种保藏中心）。培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（配方：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L，pH 7.2~7.4，121 ℃高压灭菌20 min）。实验耗材：直径6 mm无菌圆形滤纸片（不含青霉素/含青霉素，均经121 ℃高压灭菌20 min）。

1.2 实验试剂

75%的乙醇、青霉素等。

1.3 实验仪器

电子天平、超声波细胞破碎仪、微生物培养箱、恒温振荡箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、毫米尺、涂布器等。

2 实验方法

2.1 种子、果皮、叶片提取液的制备

取新鲜遵义朝天椒叶片与果实，洗净后从果实中分离出种子与果皮；将叶片和果皮剪碎，置于电热恒温鼓风干燥箱中65 ℃烘干至恒重（两次称量质量差≤0.005 g）；分别称取种子、叶片和果皮干样各2.60 g，置于烧杯中，加入30 mL 75%乙醇（V/V），间歇搅拌（50 r/min）浸泡45 min；采用超声波细胞破碎仪（功率300 W、频率40 kHz）30 ℃超声提取30 min，用定性滤纸（Whatman No.1）过滤，收集滤液于棕色试剂瓶中，4 ℃冷藏备用。

2.2 青霉素耐药菌的筛选

取金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 25923，经3次划线活化至单菌落后）接种于200 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于30 ℃、150 r/min恒温振荡箱培养24 h；采用平板计数法（倾注法）测定菌液浓度，结果为8.96×10⁶个/mL，后续实验所用菌液均调整至该浓度±10%范围内。为筛选耐青霉素金黄色葡萄球菌，以F₀代（亲本菌）为起点，取上述菌液500 μL，用无菌涂布器均匀涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板上，在平板中央放置直径6 mm、含青霉素（100 U/片）的无菌滤纸片，置于恒温培养箱中25 ℃培养48 h±2 h，得到F₁代耐药菌。用毫米尺测量抑菌圈直径（若形状不规则，取长轴与短轴均值；每个平板测量3个重复，取平均值），挑取抑菌圈边缘生长旺盛的单个菌落，转接至含青霉素的液体培养基中，30 ℃、150 r/min振荡培养24 h，获得F₂代耐药菌；重复“含青霉素平板筛选→挑取边缘菌落→液体培养”流程，连续传代4次，获得F₁~F₄代耐药菌^［2］。

2.3 种子、果皮、叶片提取液对耐药菌的抑菌作用

将F₄代耐药菌用无菌涂布器均匀涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板上，待菌液吸收后，放置直径6 mm的圆形滤纸片：实验组滤纸片浸泡于1 mL遵义朝天椒不同部位提取液（叶片/果皮/种子，浓度与前期提取一致）中30 min，对照组滤纸片浸泡于1 mL 75%乙醇（V/V）中30 min（均经高压灭菌）。将平板置于恒温培养箱中25 ℃培养48 h±2 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径（取边缘清晰处的垂直距离，若形状不规则则取长轴与短轴均值；每个滤纸片测量3次，取平均值）。每个处理组（叶片/果皮/种子提取液组及乙醇对照组）均设置3个独立平行平板，对比各组抑菌效果。

2.4 提取液与青霉素联合使用对耐药菌的抑菌作用

将F₄代耐药菌用无菌涂布器均匀涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板上，待菌液吸收后，放置直径6 mm的青霉素圆形滤纸片（含青霉素100 U/片）：实验组滤纸片浸泡于1 mL朝天椒叶片/果皮/种子提取液中30 min，对照组滤纸片浸泡于1 mL 75%乙醇（V/V）中30 min（青霉素含量一致，乙醇为溶剂对照）。将平板置于恒温培养箱中25 ℃培养48 h±2 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径（取边缘清晰处的垂直距离，若形状不规则则取长轴与短轴均值；每个滤纸片测量3次，取平均值）。每个处理组（叶片/果皮/种子提取液+青霉素组及乙醇+青霉素对照组）均设置3个独立平行平板，对比3种提取液与青霉素联合使用对耐药菌的抑菌效果^［3］。

2.5 数据处理和分析

实验所得数据用统计分析与可视化工具（Excel、SPSS等）进行综合分析、作图。

3 结果与分析

3.1 青霉素耐药菌的筛选

如表1所示，F₀代（亲本菌）金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径约为14.50 mm，而F₄代抑菌圈直径≤6.00 mm（无可见抑菌圈），抑菌圈直径显著降低（独立样本t检验，P<0.05），表明金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药性随传代次数增加（F₀→F₄）逐步增强（图1，F₀~F₄代抑菌圈直径呈递减趋势）。

3.2 种子、果皮、叶片提取液对F₄代耐药菌的抑菌效果

乙醇（对照组）与朝天椒种子提取液组的抑菌圈平均直径均为6.00 mm，果皮提取液组为7.02 mm，叶片提取液组最大（10.85 mm）（图2、表2）。独立样本t检验显示：叶片组抑菌圈直径显著大于果皮组（P<0.05）及种子/乙醇组（P<0.05），表明叶片提取液对F₄代耐药菌的抑菌效果最明显；果皮组与种子/乙醇组无显著差异（P>0.05），抑菌效果不明显；乙醇与种子提取液对F₄代耐药菌无显著抑菌作用（与阴性对照无差异，P>0.05）。

3.3 醇提液与青霉素联合使用对耐药菌的抑菌效果

实验结果显示：乙醇（对照组）与朝天椒种子提取液组的平均抑菌圈直径分别为6.05 mm、6.00 mm，与阴性对照无显著差异（P>0.05），视为无显著抑菌作用；朝天椒果皮+青霉素组为14.32 mm，朝天椒叶片+青霉素组最大（18.55 mm）（图3、表3）。独立样本t检验表明：叶片+青霉素组抑菌圈直径显著大于果皮+青霉素组（P<0.05）及种子/乙醇+青霉素组（P<0.05），联合抑菌效果最明显；果皮+青霉素组（14.32 mm）的抑菌圈直径显著大于果皮单独使用组（7.02 mm，表2）（P<0.05），抑菌效果相较于单独使用显著增强；乙醇+青霉素组（6.05 mm）与种子+青霉素组（6.00 mm）的抑菌圈直径与乙醇/种子单独使用组无显著差异（P>0.05），对F₄代耐药菌无显著抑菌作用。

4 讨论

连续传代4次（F₁~F₄代），获得对青霉素耐药性逐渐增强的金黄色葡萄球菌，表明耐药性增强与传代代数显著相关。这与文献^［4］报道的“耐药基因在细菌种群中通过水平转移累积，导致耐药性增强”的机制一致，但具体耐药机制仍需进一步研究明确。对比朝天椒种子、果皮、叶片提取液与青霉素联合使用的抑菌效果发现：叶片提取液抑菌圈直径最大（18.55 mm），显著高于果皮（14.32 mm）、种子（6.00 mm）及乙醇对照组（6.05 mm）（P<0.05），抑菌效果最明显。这可能与其叶片中富含辣椒素、黄酮类等活性物质有关；果皮提取液单独使用抑菌效果不明显（7.02 mm），但与青霉素联合使用后（14.32 mm）显著增强（P<0.05）。未来将通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分析叶片/果皮提取液中的抗菌活性成分，并采用分子对接技术探讨其作用靶点。

参考文献

[1] 文静，江有尉，韦妙欣.利用模型解释抗生素对细菌的选择作用［J］.中学生物教学，2024（20）：51-53.

[2] 冯慧琳，高学林.高中生物学探究式教学中ATDE模式的运用：以“探究抗生素对细菌的选择作用”为例［J］.中学生物教学，2024（12）：7-10.

[3] 梁丽鹏.辣椒果实中辣椒碱的含量、动态变化及其浸取物的抑菌效果研究［D］.咸阳：西北农林科技大学，2008.

[4] 王磊，陈燕.抗生素对细菌选择作用的拓展实验［J］.生物学教学，2022，47（12）：79-81.

基金资助

2023年贵州省教育科学规划一般课题“基于LACID理论的高中生物学跨学科学习活动设计与实践研究”(2023B127)

2022年遵义市基础教育科学研究一般课题“基于PBL-STEAM的高中生物学创新实验课程开发与应用研究”(2022ZB011)

2023年贵州省教育科学规划重点课题“基于‘PBL’教学法初中物理跨学科教学的实践研究”(2023A033)