HIF-1α促进机械压力下牙周膜细胞的炎症应答反应

HIF-1α promotes the inflammatory response of periodontal ligament cells under mechanical stress

摘要

目的 探讨缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）在机械应力促进人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）炎症因子表达中的分子调控机制，为正畸治疗中的炎症控制提供理论依据和潜在干预靶点。 方法 本研究已获得医院医学伦理委员会批准。体外分离培养hPDLCs，通过集落形成实验验证细胞自我更新能力，采用成骨和成脂诱导分化及茜素红、碱性磷酸酶、油红O染色评估多向分化潜能。建立体外机械压力刺激模型（1.5 g/cm²，12 h），通过实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）、Western Blot及免疫荧光染色检测Control组（无机械压力刺激）和Force组（机械压力刺激，1.5 g/cm²，12 h）hPDLCs的炎症因子：白细胞介素-1β（interleukin-1，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及HIF-1α的表达水平。基于转录组学分析探讨机械压力与HIF-1α调控下的基因表达变化。使用HIF-1α小分子抑制剂LW-6对体外机械压力刺激模型进行干预，通过设置不同的LW6浓度梯度组（10 μmol/L、30 μmol/L、50 μmol/L）探索LW-6干预的适宜浓度；通过qRT-PCR、Western Blot及免疫荧光染色检测Control组（无机械压力刺激）、Force组（机械压力刺激，1.5 g/cm²，12 h）和Force+LW6组（机械压力刺激，1.5 g/cm²，12 h以及30 μmol/L LW-6干预）hPDLCs的炎症因子及HIF-1α的表达水平。 结果 hPDLCs原代细胞具备自我更新及成骨和成脂分化能力；与Control组相比，Force组hPDLCs炎症因子IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的mRNA、蛋白表达明显增强，Force组IL-1β、TNF-α的荧光强度明显高于Control组。转录组学分析揭示机械压力刺激下HIF-1信号通路激活，调控hPDLCs的炎症反应和骨改建过程。相较于Control组，Force组hPDLCs中HIF-1α mRNA和蛋白水平明显升高。10、30、50 μmol/L LW-6均可抑制hPDLCs HIF-1α表达，确定采用30 μmol/L LW-6进行干预。进一步检测发现，相较Control组，Force组IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达及蛋白表达显著上调，HIF-1α、IL-1β和TNF-α荧光强度增强；相较于Force组，Force+LW-6组以上炎症因子的mRNA表达及蛋白表达显著下调，HIF-1α、IL-1β和TNF-α荧光强度减弱。 结论 HIF-1α在机械压力下上调hPDLCs的炎症反应，可作为正畸相关牙周组织炎症控制的潜在靶点。

Abstract

Objective To investigate the molecular regulatory mechanism of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) in mechanical stress-induced inflammatory cytokine expression in human periodontal ligament cells (hPDLCs), providing a theoretical basis and potential therapeutic target for inflammatory control during orthodontic treatment. Methods This study was approved by the Institutional Ethics Committee. Primary human periodontal ligament cells (hPDLCs) were isolated and cultured in vitro. Self-renewal capacity was confirmed via colony-forming assays, while osteogenic and adipogenic differentiation potential was evaluated via Alizarin Red S staining, alkaline phosphatase (ALP) activity assays, and Oil Red O staining. An in vitro compressive force stimulation model (1.5 g/cm², 12 h) was established to compare inflammatory cytokine expression of hPDLCs—interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α), and HIF-1α—between the Control group (no mechanical stimulation) and the Force group (1.5 g/cm², 12 h) using quantitative real-time PCR (qRT-PCR), Western blot, and immunofluorescence (IF) staining. Mechanically induced HIF-1α-regulated gene expression changes were analyzed through transcriptomic sequencing. To explore pharmacological inhibition, the small-molecule HIF-1α inhibitor LW-6 was applied at varying concentrations (10 μmol/L, 30 μmol/L, 50 μmol/L) to optimize the treatment dose. Subsequently, qRT-PCR, Western blot, and IF staining were conducted to evaluate inflammatory cytokine of hPDLCs and HIF-1α expression in three groups: Control (no force), Force (1.5 g/cm², 12 h), and Force+LW6 (1.5 g/cm², 12 h + 30 μmol/L LW-6). Results Primary hPDLCs demonstrated self-renewal capacity along with osteogenic and adipogenic differentiation potential. Compared to the Control group, the Force group exhibited significantly increased mRNA and protein expression levels of inflammatory cytokines IL-1β, IL-6, and TNF-α, along with enhanced fluorescence intensity of IL-1β and TNF-α. Transcriptomic analysis revealed that mechanical compressive force activated the HIF-1 signaling pathway, which subsequently mediated inflammatory responses and bone remodeling processes in hPDLCs. Furthermore, the mRNA and protein levels of HIF-1α were considerably elevated in the Force group compared to the Control group. Treatment with LW-6 (10, 30, or 50 μmol/L) effectively suppressed HIF-1α expression, with 30 μmol/L LW-6 identified as the optimal concentration for intervention. In subsequent experiments, the Force group showed significant upregulation in mRNA/protein expression of IL-1β, IL-6, and TNF-α compared to the Control group, as well as intensified HIF-1α, IL-1β, and TNF-α fluorescence signals. Conversely, the Force+LW6 group (mechanical force + 30 μmol/L LW-6) exhibited a notable reduction in inflammatory cytokine expression levels and a weakening of HIF-1α, IL-1β, and TNF-α fluorescence signals compared to the Force group. Conclusion HIF-1α potentiates mechanical stress-induced inflammatory responses in hPDLCs and may serve as a promising therapeutic target for mitigating orthodontic-associated periodontal inflammation.

Graphical abstract

关键词

机械压力 / 人牙周膜细胞 / 缺氧诱导因子-1α / 炎症应答 / LW-6 / 炎症因子 / 骨改建 / 正畸治疗 / 碱性磷酸酶 / 信号通路

Key words

mechanical stress / human periodontal ligament cells / hypoxia-inducible factor-1α / inflammatory response / LW-6 / inflammatory factor / bone remodeling / orthodontic treatment / alkaline phosphatase / signaling pathway

人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）是正畸治疗过程中最早感受机械刺激并作出应答的关键细胞类型。它们不仅调节牙齿移动所需的牙槽骨改建过程，也在炎症因子释放与免疫细胞募集中发挥重要作用^［1-2］。研究表明，适度的炎症反应有助于骨重建，但过度或持续的炎症可能导致牙根吸收、牙周组织破坏^［3-4］。因此，深入理解机械刺激诱导下hPDLCs炎症应答的分子机制，是优化正畸治疗、保护牙周组织的关键。

缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）被视为细胞响应缺氧应激的经典核心调控因子，其在机械刺激及炎症微环境中同样可被激活，并参与调控细胞自噬、能量代谢及炎症因子的表达等关键生理过程^［5-6］。在骨代谢领域，HIF-1α已被证实是骨改建过程的关键调控因子^［7-8］；在牙周炎病理进程中，其也参与调控了牙槽骨的吸收与破坏^［9-10］。以上发现强烈提示HIF-1α在骨改建-炎症网络中扮演重要角色。然而，HIF-1α是否直接参与机械刺激诱导的hPDLCs炎症反应，以及其具体作用机制，尚缺乏系统深入的研究。

为此，本研究旨在探究HIF-1α在机械压力诱导的hPDLCs炎症应答中的作用机制。本研究拟建立体外hPDLCs机械压力刺激模型，结合小分子抑制剂LW-6特异性阻断HIF-1α活性，并系统检测关键炎症因子的表达变化，以验证HIF-1α是否作为核心转录因子介导了机械压力诱导的炎症因子表达，为正畸治疗中实现精准的炎症控制提供理论依据及潜在干预靶点。

1 材料和方法

1.1 主要材料与仪器

α-MEM培养基（Gibco，美国）、青-链霉素混合液（索莱宝，中国），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；Gibco，美国），胰蛋白酶（索莱宝，中国），β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美锌、氢化可的松、胰岛素（Sigma，美国），磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）（赛维尔，中国），TRIzol裂解液（Invitrogen，美国），Hieff UNICON^® qPCR SYBR（翌圣，中国），BCA蛋白质测定试剂盒（P0010，碧云天，中国），蛋白酶抑制剂（ST507，碧云天，中国）、RIPA裂解液（P0013B，碧云天，中国）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（P0015L，碧云天，中国），PVDF转印膜（Millipore，美国），预制胶、电泳缓冲液（兰博立德，中国），预染蛋白marker （WB1902，博泰斯，中国），一抗 （兔抗人，anti-IL-1β，26048-1-AP，anti-TNFα，17590-1-AP；鼠抗人，anti-IL-6，66146-1-Ig，anti-HIF-1α，66730-1-Ig，anti-β-actin，66009-1-Ig）（proteintech，美国），HRP-二抗（羊抗鼠：SA00001-1、羊抗兔：SA00001-2）（Proteintech，美国），荧光二抗（CoraLite^®488-羊抗兔：SA00013-2；CoraLite^®594-羊抗兔：SA00013-4；CoraLite^®594-羊抗鼠：SA00013-3），DAPI封片剂（中杉金桥，中国），结晶紫染色液（索莱宝，中国），BCIP/NBT碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色显色试剂盒（C3206，碧云天，中国），茜素红染液（Sigma，美国），油红O染色试剂盒（G1262，索莱宝，中国），HIF-1α小分子抑制剂LW-6（S8441，selleck，美国）。

多功能酶标仪（SpectraMax M3，Molecular Devices，中国），化学发光凝胶成像系统（Bio-Rad ChemiDoc MP，Bio-Rad，美国），Nanodrop 8000分光光度计（Thermo，美国），ABI荧光定量PCR仪（ViiA V7Dx，Applied Biosystems，英国），Olympus倒置荧光显微镜（BX53，Olympus，日本），倒置激光共聚焦显微镜（FV3000，Olympus，日本）。

1.2 hPDLCs的提取与培养

该实验已通过贵州医科大学附属口腔医院伦理委员会审查（审批号：2022伦审第40号），并取得患者及监护人知情同意。收集12～18岁正畸患者被拔除的正畸减数牙，刮取牙根中段（中1/3）牙周膜，并切碎，转移至离心管，室温下1 200 r/min离心5 min；弃上清，加入1 mL Ⅰ型胶原酶（6 mg/mL）+ 1 mL Disperse分散酶（8 mg/mL），恒温震荡仪，37 ℃，300~400 r/min，消化1 h；离心重悬后，将细胞接种于细胞培养皿中；加入足量培养基（含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺的α-MEM培养基），在37 ℃，5% CO₂恒温孵箱中静置培养，每2 d换一次液，细胞生长达80%汇合度时，消化传代。使用第3~6代的hPDLCs进行后续实验。

1.3 hPDLCs的自我更新及多向分化能力验证

结晶紫染色：取生长状态良好的hPDLCs，按照1×10³ 个/孔接种于六孔板内。每3 d换液，培养14 d后，弃去孔板内的培养基，PBS洗涤3次，使用无水甲醇室温固定30 min；弃去固定液，PBS洗涤3次，加入0.1% 结晶紫染液浸染3 min；弃去染液，PBS洗涤3次，每次3 min；扫描孔板。

成骨诱导及ALP染色、茜素红染色：按照1×10⁵ 个/mL将hPDLCs接种于孔板内，细胞汇合度达到80%左右时，弃去原培养基，使用无菌PBS洗涤3次，加入成骨诱导培养基（含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺、2 mmol/L β甘油磷酸钠、500 μmol/L维生素C、10 nmol/L地塞米松磷酸钠的α-MEM培养基）；隔天换液。成骨诱导7 d后，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定30 min，按照BCIP/NBT试剂盒说明书进行ALP染色。成骨诱导21 d后，PBS溶液冲洗细胞3遍，4%多聚甲醛固定30 min，加入茜素红染色液染色。

成脂诱导及油红O染色：按照1×10⁵ 个/mL将hPDLCs接种于孔板，细胞完全汇合时，弃去培养基，使用无菌PBS洗涤3次，加入成脂诱导培养基（含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、60 μmol/L吲哚美锌、0.5 μmol/L氢化可的松、10 μg/mL胰岛素的αMEM培养基）；每3 d换液，培养21 d后进行油红O染色；每天观察细胞内脂滴形成情况，如有较多脂滴形成，可提前染色。PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定30 min，超纯水洗涤3次，加入60%异丙醇浸洗20～30 s；晾干后加入油红O工作液，染色20 min；弃去染液，60%异丙醇脱色，超纯水洗涤2次，每次3 min。

1.4 机械压力刺激对hPDLCs炎症因子表达的影响

取生长状态良好的hPDLCs，按照1×10⁵个/mL接种于六孔板内；细胞汇合度达到80%左右时，根据既往研究，按照图1所示方法施加机械压力刺激（1 g/cm²，12 h）^［11］。根据hPDLCs是否受到机械压力刺激分成Control组（无机械压力刺激）和Force组（机械压力刺激，1.5 g/cm²，12 h），通过实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）、Western Blot检测炎症因子：白细胞介素-1β（interleukin-1，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达水平；免疫荧光染色检测IL-1β和TNF-α的表达水平。

qRT-PCR：机械压力刺激后，使用TRIzol法提取细胞RNA后，使用nanodrop 8000测定RNA浓度。使用10 μm体系进行逆转录，进行qRT-PCR，反应条件为预变性95 ℃ 30 s；变性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 20 s，共40个循环。以β-actin的表达水平为内参照，基因相对表达量计算公式为2^-△△CT=2^{-（△Ct实验组-△Ct对照组）}。qRT-PCR引物序列见表1。根据3次独立实验的结果，计算均值与标准误，绘制数据图。

Western Blot：机械压力刺激后去除培养基，PBS洗涤3遍，加入含1% 蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取总蛋白，测定蛋白浓度，加入适量蛋白上样缓冲液，混匀后95 ℃加热10 min使蛋白变性。将20 μg蛋白样本用于Western Blot检测，在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离不同分子量的蛋白，转移至PVDF膜，5% 脱脂牛奶室温封闭1 h，4 ℃条件下anti-IL-1β（1∶500）、anti-IL-6（1∶500）、anti-TNF-α（1∶500）和β-actin（1∶1 000）孵育过夜；次日将PVDF膜转移至装有二抗的抗体孵育盒中孵育1 h。将PVDF膜浸泡于显色液中并于成像仪曝光并保存图像，使用Image J软件进行图像分析。

免疫荧光染色：机械压力刺激后，弃去培养基，PBS洗涤3次，使用4%多聚甲醛室温固定15 min；弃去固定液，PBS洗涤3次，加入5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 溶液，室温封闭60 min；吸去封闭液，加入一抗工作液（anti-IL-1β，1∶100；anti-TNF-α，1∶100），湿盒内 4 ℃静置过夜；室温下，复温1 h，吸去一抗工作液，加入适量 PBS，轻摇洗涤3次，每次10 min，吸去多余液体，加入二抗工作液（CoraLite^®488-羊抗兔；CoraLite^®594-羊抗兔；CoraLite^®594-羊抗鼠：1∶200），湿盒室温避光孵育60 min；吸去二抗工作液，加入适量PBS，室温摇床轻摇洗涤3次，每次10 min，吸去多余液体，滴入适量含DAPI的封片剂；使用FV3000倒置激光共聚焦显微镜采集图像，使用Image J软件进行平均荧光强度分析。

1.5 GEO数据库转录组数据检索及分析

本研究从GEO数据库（Gene Expression Omnibus，https： //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）筛选符合以下条件的转录组数据集：以检索式 （"mechanical force" OR "mechanical stress"） AND （"periodontal ligament cells" OR "PDLCs"）进行搜索，限定物种为人类（homo sapiens），数据类型为mRNA表达谱。最终纳入数据集GSE109167，包含体外机械压力（1.5 g/cm²，12 h）处理的hPDLCs及未处理对照样本。

差异表达基因（different genes，DEGs）筛选：通过GEO2R在线工具对原始表达数据进行归一化处理（log₂转换及分位数标准化），采用limma算法进行差异分析。定义显著差异基因为满足 |log₂FoldChange（log₂FC）| ≥1 且调整后Q值（adj.Q.Val）<0.05 的基因。聚焦于机械压力下上调基因（log₂FC ≥1）进行后续功能注释。

基因本体（gene ontology，GO）分析：使用Metascape平台（https： //metascape.org/gp/index.html#/main/step1）对上调基因进行GO富集分析，包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组分（cellular component，CC），显著性阈值设为 FDR <0.05。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析：通过Metascape平台进行KEGG最新通路注释，采用超几何检验筛选显著富集的信号通路（FDR <0.05），重点关注炎症反应、机械转导相关通路。可视化：利用微生信平台（https： //www.bioinformatics.com.cn/）绘制气泡图，展示前20项显著富集的GO-BP条目及KEGG通路。

1.6 机械压力对hPDLCs中HIF-1α表达的影响

根据hPDLCs是否受到机械压力刺激分成Control组（无机械压力刺激）和Force组（机械压力刺激，1.5 g/cm²，12 h）。

通过qRT-PCR、Western Blot检测HIF-1α的表达水平（方法同1.4）。

1.7 LW-6对hPDLCs中HIF-1α蛋白表达的抑制作用

取生长状态良好的hPDLCs，按照1×10⁵个/mL接种于六孔板内；细胞汇合度达到80%左右时，通过加入不同浓度梯度（10 μmol/L、30 μmol/L、50 μmol/L^［12］）的HIF-1α小分子抑制剂LW-6将hPDLCs分组，对照组加入等体积DMSO，通过Western Blot检测探索LW-6的适宜干预浓度（方法同1.4）。

1.8 LW-6对机械压力下hPDLCs炎症因子和HIF-1α表达的影响

取生长状态良好的hPDLCs，按照1×10⁵个/mL接种于六孔板内；细胞汇合度达到80%左右时，加入30 μmol/L LW6（或等体积DMSO），然后施加机械压力刺激（1.5 g/cm²，12 h）。分为Control组（无机械压力刺激），Force组（机械压力刺激，1.5 g/cm²，12 h），Force+LW6组（机械压力刺激，1.5 g/cm²，12 h以及30 μmol/L LW-6干预）。通过qRT-PCR、Western Blot检测IL-1β、IL-6、TNF-α及HIF-1α的表达水平；免疫荧光染色检测IL-1β、TNF-α及HIF-1α的表达水平（方法同1.4）。

1.9 统计学分析

实验数据以均数±标准误（x-±s）表示，使用Graph Prism 8.0.1进行统计分析。

计量资料2组数据使用非配对t检验；计量资料3组及以上数据使用单因素方差（ANOVA）分析，组间比较采用Tukey多重比较检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 hPDLCs具备自我更新及多向分化能力

提取hPDLCs原代细胞时，小块组织周围可见纤维状细胞成团生长。hPDLCs体外培养14 d后可形成克隆群，表明其具备自我更新能力。成脂诱导培养21 d后，可见细胞内脂滴形成。成骨诱导培养7 d后，hPDLCs的ALP活性增强，成骨诱导培养21 d后，hPDLCs外基质可见矿化结节形成（图2）。

2.2 机械压力促进hPDLCs炎症因子的表达

相较于Control组，Force组 hPDLCs 中炎症相关基因 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的mRNA、蛋白表达水平均显著上调；免疫荧光染色分析显示，Force组IL-1β、TNF-α的荧光强度明显高于Control组（图3）。

2.3 转录组测序分析显示机械压力可激活HIF-1信号通路

通过GEO数据库检索获得GSE109167转录组测序数据，对机械压力刺激下上调的基因进行KEGG通路富集分析及GO生物过程分析。结果显示，机械压力可激活hPDLCs的氧化应激反应，并显著富集于HIF-1信号通路（图4）。

2.4 机械压力刺激后，hPDLCs中HIF-1α表达上调

相较于Control组，Force组hPDLCs中HIF-1α mRNA表达显著上调，HIF-1α蛋白水平亦明显升高（图5）。

2.5 LW-6抑制hPDLCs的HIF-1α蛋白表达

使用不同浓度LW-6刺激hPDLCs后Western Blot检测HIF-1α表达水平，结果表明10、30、50 μmol/L LW-6均可抑制HIF-1α表达（图6）。后续功能验证使用30 μmol/L LW-6与机械压力共同刺激hPDLCs。

2.6 LW-6抑制机械压力下hPDLCs炎症因子和HIF-1α表达

相较Control组，Force组IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达及蛋白表达显著上调，Force组HIF-1α、IL-1β和TNF-α荧光强度增强；相较于Force组，Force+LW 6组以上炎症因子的mRNA表达及蛋白表达显著下调，HIF-1α、IL-1β和TNF-α荧光强度减弱（图7）。

3 讨 论

3.1 机械压力对hPDLCs炎症反应的影响

机械压力作为正畸治疗中的一个重要刺激因子，能显著影响hPDLCs的炎症反应。本研究实验结果表明，机械压力刺激后，hPDLCs中典型炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达显著上调。既往研究也表明从正畸加力开始，压力侧牙周膜局部即呈现炎症状态，大量炎症因子分泌，趋化募集免疫细胞，启动破骨细胞分化及骨基质重塑^［13-15］。机械力刺激下的牙槽骨改建是正畸牙移动的生理基础，此过程涉及骨吸收与骨沉积的动态平衡^［2，11］。炎症微环境作为正畸牙移动局部特征性生理现象，是促进压力侧破骨细胞分化、启动牙槽骨改建的决定性因素^［16-17］。然而，过度的炎症反应也可能导致正畸牙根吸收和牙槽骨过度吸收^［3，18］。因此，调控机械力作用下牙周膜的炎症反应程度，对于确保高效且健康的正畸治疗至关重要。

3.2 HIF-1α在机械压力刺激中的作用及机制

本研究通过分析GEO数据库中的转录组数据，进一步发现HIF-1信号通路在机械压力刺激下显著富集，提示该通路在hPDLCs响应机械力的过程中可能发挥重要作用。qRT-PCR和Western Blot结果表明，机械压力刺激后hPDLCs中HIF-1α的表达显著上调，这一发现与Kirschneck等^［19］的研究结果一致。HIF-1α作为一种关键的低氧应答因子，已被证明在缺氧应激、炎症反应等多种刺激下发挥重要作用，调控细胞的生理功能和状态^［20-22］。值得注意的是，机械压力刺激除了通过细胞内信号通路直接调控HIF-1α的表达外，还可能通过改变局部微环境，间接诱导HIF-1α的激活^［23］。既往研究表明，牙周膜在持续性正畸加力作用下，局部血管受到压迫，血流灌注减少，形成相对缺氧状态，从而激活低氧相关信号通路^［23-24］。HIF-1α作为经典的低氧应答因子，其稳定性受氧浓度影响显著，在缺氧条件下能够逃避PHD酶介导的羟化降解过程，促进其在细胞核内积聚并调控多种靶基因的表达^［25-27］。因此，机械压力可能一方面通过细胞内应力感受机制上调HIF-1α，另一方面通过诱导组织缺氧共同加强其激活水平，进一步增强炎症因子的表达。HIF-1α激活后，直接或间接促进TNF-α、IL-6、IL-1β的转录和释放，增强局部炎症反应；这些炎症因子可通过激活核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）等信号通路，促进HIF-1α的基因转录或蛋白稳定，抑制其降解，从而上调HIF-1α水平，二者形成正反馈调控环^［28-29］。该协同机制提示HIF-1信号通路可能处于“力-氧-炎”交汇的关键节点，对牙周膜细胞状态调控具有重要意义。

3.3 HIF-1α在骨改建中的作用

HIF-1信号通路不仅与氧化应激反应密切相关，还能调控血管生成、代谢调节以及炎症反应等多个方面，因此可能在骨改建过程中起到桥梁作用，协调局部环境中的骨吸收和新骨形成^{［7，30-31］}。此外，HIF-1α也可通过影响骨代谢相关因子的表达，参与颌骨、牙槽骨发育改建过程^［32-34］。已有研究发现，HIF-1α可调控RANKL和骨保护素（osteoprotegerin，OPG）的表达比例，从而间接影响破骨细胞的分化与活化^［35-36］。与此同时，HIF-1α也可介导血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等血管生成因子的表达，促进新生血管形成，为新骨沉积提供必要的血液供应^{［30，37］}。在正畸牙移动过程中，PDLCs作为“信号中枢”，通过炎症、代谢和骨改建信号的整合调控邻近骨组织的动态变化^［2，38］。因此，HIF-1α在PDLCs中可能不仅通过炎症因子的表达介导骨吸收，也可能调控细胞的成骨/破骨分化潜能和分泌谱，从而在牙槽骨改建中发挥双重调节作用。该机制的明确将有助于全面理解正畸加力所触发的骨生物学过程。

3.4 LW-6对炎症反应的影响及潜在治疗价值

LW-6通过加速HIF-1α降解，从而抑制其功能^［39-40］。本研究发现LW-6能够有效抑制机械压力刺激下IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，并且减少了HIF-1α蛋白水平的升高。这一结果提示，HIF-1α在机械压力诱导的hPDLCs炎症应答中起到了关键作用，LW-6通过促进HIF-1α降解，在一定程度上减缓了机械压力引起的炎症反应。既往研究亦表明LW-6可影响多种细胞的炎症应答反应：LW-6可通过抑制II型肺泡上皮细胞尿苷磷酸化酶1（uridine phosphorylase 1，UPP1）表达，抑制其炎症应答反应^［41-42］；LW-6可显著抑制肺纤维化过程中上皮细胞高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）的表达与释放，从而抑制炎症级联反应^［43-44］。此发现为开发基于HIF-1α的治疗策略提供了潜在的方向，LW-6作为一种特定的HIF-1α抑制剂，可能通过调控局部炎症应答水平，在实现牙齿加速移动的同时，优化骨重塑过程，从而提高正畸治疗的效果。尽管LW-6在本研究中的效果值得关注，但其长期效果和安全性仍需通过（大）动物实验、临床前研究来验证。同时，考虑到HIF-1α在多种生理过程中扮演的重要角色，如何精准调控HIF-1α的活性，避免对其他生理过程造成不良影响，是未来研究中需要解决的重要问题。

综上所述，本研究为理解机械压力在正畸治疗中对hPDLCs的影响机制提供了新的见解，尤其是在HIF-1信号通路的调节作用方面。LW-6通过抑制HIF-1α的表达，可能为控制炎症反应和调控骨重塑提供了新的治疗策略。未来的研究将进一步探讨HIF-1α在正畸治疗中的具体作用，以及如何通过精准的靶向干预来改善正畸治疗的临床效果。

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