EZH2蛋白表达对口腔白斑病癌变的预测作用：一项前瞻性队列研究

EZH2 protein expression in predicting malignant transformation of oral leukoplakia: a prospective cohort study

摘要

目的 探讨EZH2蛋白表达对口腔白斑病（oral leukoplakia， OLK）癌变的预测作用，为临床提供参考。 方法 本研究已通过单位医学伦理委员会审查批准，并获得患者书面知情同意。纳入自2020年11月至2022年7月就诊于本院共114例经病理确诊为OLK的受试者，最终纳入数据分析的受试者共105例，其中高表达组14例，低表达组91例。进行组织病理学检查和EZH2蛋白表达的免疫组织化学检测，随访时间为 30个月，受试者完成随访或发生癌变后，即完成本次试验，患者出组。暴露因素为EZH2蛋白表达量，评价指标为OLK癌变率。对OLK受试者黏膜组织中EZH2蛋白高、低表达情况以及OLK癌变情况进行分析。 结果 EZH2高表达组与低表达组在年龄、性别、全身系统性疾病史、不良习惯、精神状态、饮食及睡眠情况等方面等方面差异无统计学意义（P>0.05），高表达组病损部位分布主要集中于舌腹，低表达组多见于舌背及颊部。 EZH2蛋白高表达组、低表达组癌变率分别为28.6%（4/14）和8.8%（8/91），差异无统计学意义（P=0.053）；单因素Cox回归模型中，EZH2高表达组OLK癌变风险是EZH2低表达组的3.647倍（HR=3.647，95%CI： 1.097-12.120， P<0.05）；KM生存分析结果显示，30个月随访中，EZH2高表达组无癌生存率较EZH2低表达组降低19.8%，差异具有统计学意义（P<0.05）；在多因素Cox回归模型中，仅中、重度上皮异常增生是OLK癌变的显著独立危险因素，中、重度上皮异常增生组OLK癌变风险是轻度上皮异常增生组的10.695倍和13.623倍（HR=10.695， 95% CI： 2.270-50.396， P<0.05； HR=13.623， 95%CI： 1.918-96.774， P<0.05），EZH2高表达组对OLK癌变风险预测的独立价值不显著（HR=2.528， 95% CI： 0.752-8.500， P=0.134）。 结论 EZH2蛋白高表达是OLK癌变的危险因素，但无独立预测价值。

Abstract

Objective To investigate the predictive value of EZH2 expression for malignant transformation in oral leukoplakia (OLK) and to provide a reference for clinical practice. Methods This study was approved by the institutional ethics committee, and written informed consent was obtained from all participants. A total of 114 patients diagnosed with OLK by pathological examination and treated at our hospital between November 2020 and July 2022 were initially enrolled. After excluding those with incomplete data or follow-up, 105 participants were included in the final analysis, comprising 14 in the high EZH2 expression group and 91 in the low EZH2 expression group. Histopathological examination of oral mucosa and immunohistochemical detection of EZH2 protein expression were performed. The follow-up period was 30 months; participants were followed until malignant transformation occurred or until the end of follow-up, at which point they were withdrawn from the study. The exposure factor was the level of EZH2 protein expression, and the outcome was the malignant transformation rate of OLK. Differences in EZH2 expression levels and transformation outcomes were analyzed. Results There were no statistically significant differences between the high and low EZH2 expression groups in terms of age, sex, history of systemic disease, lifestyle habits, psychological status, diet, and sleep conditions (P > 0.05). Lesions in the high EZH2 expression group were mainly located on the ventral tongue, while in the low EZH2 expression group, they were more commonly found on the dorsal tongue and buccal mucosa. The malignant transformation rate was 28.6% (4/14) in the high expression group and 8.8% (8/91) in the low expression group; these differences were not statistically significant (P=0.053). In univariate Cox regression analysis, the risk of malignant transformation in the high EZH2 expression group was 3.647 times that of the low EZH2 expression group (HR = 3.647, 95% CI: 1.097–12.120, P<0.05). Kaplan–Meier survival analysis showed that over the 30-month follow-up period, the cancer-free survival rate in the high EZH2 expression group was 19.8% lower than in the low expression group, and the difference was statistically significant (P<0.05). In multivariate Cox regression analysis, only moderate and severe epithelial dysplasia were identified as independent risk factors for malignant transformation. The risk of malignant transformation in the moderate and severe dysplasia groups was 10.695 and 13.623 times higher, respectively, than in the mild dysplasia group (HR = 10.695, 95% CI: 2.270–50.396, P<0.05; HR=13.623, 95% CI: 1.918–96.774, P<0.05). EZH2 high expression was not an independent risk factor in the multivariate model (HR= 2.528, 95% CI: 0.752–8.500, P = 0.134). Conclusion High EZH2 protein expression is a risk factor for the malignant transformation of OLK but does not have independent predictive value.

Graphical abstract

关键词

口腔白斑病 / 癌变 / 生物标志物 / EZH2 / 口腔潜在恶性疾病 / 上皮异常增生 / 前瞻性队列研究 / 口腔鳞状细胞癌

Key words

oral leukoplakia / malignant transformation / biomarker / EZH2 / oral potential malignant lesions / dysplasia / prospective cohort study / oral squamous cell carcinoma

口腔白斑病（oral leukoplakia， OLK）是指发生在口腔黏膜上，不能擦去且不能以临床和组织病理学的方法诊断为其他疾病的一种白色损害，是临床上最重要的具有癌变潜在风险的口腔黏膜疾病，癌变率为1.1% ~ 40.8%^［1-3］。一旦其癌变为口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma， OSCC），患者的治疗难度赠加，预后差，可能危及生命，死亡率高达50%^［4］。因此对OLK的癌变进行监测，评估患者的癌变风险，对预防其癌变至关重要。EZH2作为一种具有高度保守序列的组蛋白甲基化转移酶，参与细胞周期调控、细胞增殖、分化以及与肿瘤进展有关基因的甲基化和沉默^［5-6］。在OSCC的发生发展中，EZH2参与调节STAT3/HOTAIR轴、Wnt/β-Catenin通路，影响其增殖、分化和促进转移^［7-8］。此外，EZH2高表达与OSCC不良预后相关^{［5， 9］}。在口腔癌前病变领域，有研究表明EZH2与OLK的癌变相关，其作用机制可能与细胞周期调控、免疫抑制相关，EZH2的高表达可作为OLK癌变预测的生物标志物^［10-11］。但这些研究均为回顾性研究，目前该领域内缺少前瞻性研究证据。本研究为前瞻性队列研究，通过对OLK受试者黏膜组织中EZH2蛋白高、低表达情况以及OLK癌变情况进行分析，寻找EZH2蛋白表达与OLK癌变的相关性，探讨EZH2蛋白作为OLK癌变预测指标的可行性。

1 资料和方法

1.1 研究对象

1.1.1 受试者来源

本研究纳入自2020年11月至2022年7月就诊于本院口腔黏膜科，病理诊断为口腔黏膜白斑的患者。研究已通过单位医学伦理委员会审查批准（伦理号：SH9H-2020-T123-2），所有参与研究的患者均签署书面知情同意书。研究过程严格按照国家药品监督管理局施行的《药物临床试验质量管理规范》和《赫尔辛基宣言》的要求进行。

1.1.2 纳入标准

①年龄在20岁以上（含20岁），80岁以下（含80岁），性别不限；②经病理组织学确诊口腔黏膜白斑病；③未行诱导分化治疗（如维甲酸口服/外用等）；④女性育龄受试者妊娠试验阴性，须同意使用有效避孕措施以保证试验期间及停止治疗后3月内不怀孕。排除标准：①明确的远处转移或发生其他恶性肿瘤；②患有精神疾病，不能配合治疗者；③重要脏器功能受损，存在生命危险者；④凝血功能异常，有出血性倾向者；⑤妊娠、哺乳期妇女；⑥既往30 d内参加过其他临床试验。

1.1.3 样本量计算

根据文献及预实验，EZH2在口腔黏膜白斑中高表达癌变率约为30%，低表达癌变率约为6%，取α=0.05，β=0.1，按样本量计算公式得出样本量为高表达组52例，低表达组52例，考虑10%左右的脱落率，则每组样本量设为高表达组57例，低表达组57例，共计114例。样本量计算公式如下：

n={\left(\frac{Z_{\alpha /\mathrm{2}}\sqrt[]{\mathrm{2}\overline{pq}}+Z_{\beta }\sqrt[]{p_{\mathrm{0}}{q}_{\mathrm{0}}+p_{\mathrm{1}}{q}_{\mathrm{1}}}}{p_{\mathrm{1}}-p_{\mathrm{0}}}\right)}^{\mathrm{2}}

Z_{\alpha /\mathrm{2}}取Z_{\mathrm{0.05}}=1.96；Z_{\beta }取Z_{\mathrm{0.1}}=1.28；p_{\mathrm{0}} 为EZH2低表达组癌变率6%，p_{\mathrm{1}}为EZH2高表达组癌变率30%； \overline{p}为两组平均发病率，即（p_{\mathrm{0}}+p_{\mathrm{1}}）/2；q_{\mathrm{0}}=1-p_{\mathrm{0}}，q_{\mathrm{1}}=1-p_{\mathrm{1}}，\overline{q}=\mathrm{1}-\overline{p};暴露组与非暴露组样本量配比为1：1，即EZH2高、低表达组样本量n₁=n₀=n。

1.2 研究方法

1.2.1 基线数据收集

在受试者入组时，收集受试者人口学基本信息，包括性别、年龄等；病史基本资料，包括病损部位、病损大小、是否有疼痛、治疗及用药情况、吸烟、饮酒、咀嚼槟榔情况等；全身系统疾病情况、饮食习惯、精神状态、睡眠状况等。

1.2.2 病理诊断和免疫组织化学检测

当受试者符合入组条件入组时，将收集其病理组织，除进行常规石蜡病理诊断外，同时进行EZH2蛋白表达的免疫组化检测。采集入组受试者的口腔黏膜组织标本，常规进行甲醛固定及石蜡包埋等处理后，将蜡块切成4 μm厚的薄片进行免疫组织化学染色。EZH2的组织化学染色使用EZH2抗体试剂盒（GT228502/04/07/14，基因科技（上海）股份有限公司，中国）。具体步骤如下：使用二甲苯将石蜡切片进行脱蜡处理，使用梯度浓度的乙醇（100%、95%、70%、50%）进行水化后进行抗原热修复，将组织切片放入盛抗原修复液（GT100210，基因科技（上海）股份有限公司，中国）的抗原修复盒中，抗原修复盒置于高压锅内煮沸，冒蒸汽后计时2 min，缓慢冷却至室温。抗原修复后加非特异性反应阻断剂1~2滴，室温下孵育10 min，TBS缓冲液（GT100110，基因科技（上海）股份有限公司，中国）冲洗3次，每次3 min。然后，切片上滴加1~2滴EZH2抗体工作液，室温下孵育60 min，TBS缓冲液冲洗3次，每次3 min。加酶标羊抗鼠/免lgG聚合物1~2滴，TBS缓冲液冲洗3次，每次3 min。使用DAB显色液（GK800711，基因科技（上海）股份有限公司，中国）进行染色反应，苏木素进行核复染，自来水冲洗。将切片脱水至透明、自然风干后取适量封片胶封片。

口腔上皮异常增生（oral epithelial dysplasia， OED）的病理诊断由经验丰富的口腔病理医师完成，诊断参考2017年世界卫生组织（World Health Organization， WHO）的分级法^［12］，分别为上皮轻度、中度和重度异常增生。当病理诊断提示为轻-中度上皮异常增生时，以中度纳入数据统计；当病理诊断提示为中-重度上皮异常增生时，以重度纳入数据统计。

免疫组织化学诊断由经验丰富的口腔病理医生完成，EZH2蛋白表达标记指数标准如下：采用半定量结果，计算镜下视野内阳性细胞百分比，以及染色强度［阴性0（-），弱阳性1（+），阳性2（++），强阳性3（+++）］。病理医师在每张切片中随机检查7 ~10个细胞区域，计算染色强度（0、1、2、3）乘以阳性细胞百分比，取平均值作为EZH2蛋白表达的标记指数（labeling index， LI）^［10-11］。EZH2高低表达的临界值为145，将EZH2 LI ≥145的纳入EZH2高表达组，EZH2 LI<145的纳入低表达组。

1.2.3 随访要求与结局

①受试者每3个月接受随访，进行口腔临床检查。②每12个月进行组织病理活检和免疫组织化学检测，记录病理结果和EZH2蛋白表达水平。③如临床怀疑白斑发生恶变，即时进行病理活检和免疫组织化学检测，记录病理结果和EZH2蛋白表达水平。④随访持续时间为口腔白斑确诊后30个月。⑤终点指标：病理诊断为口腔鳞状细胞癌。⑥评价指标：30个月口腔白斑癌变率。⑦暴露因素：受试者OLK组织样本中EZH2蛋白表达。⑧随访期间治疗方案：口服绞股蓝总苷胶囊（红云制药有限公司，中国），3次/d，每次1粒（每粒含绞股蓝总苷60 mg）。

1.3 统计学分析

使用Statistical Package for Social Science 27（IBM SPSS Statistics 27）软件进行统计分析。计数资料的统计描述用例数（%）表示，统计检验采用卡方检验或Fisher精确概率法。符合正态分布的计量资料（如受试者年龄）的统计描述用均数±标准差表示，统计检验采用两独立样本t检验。运用Kaplan-Meier（KM）生存分析，结合受试者的癌变时间和癌变状态，绘制不同组别的KM生存曲线，运用Log-rank检验对EZH2高低表达组受试者的组间癌变差异进行比较。运用单因素、多因素Cox比例风险回归确定变量的预测价值。研究中所有的统计检验均采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 入组受试者基本信息

本研究共纳入114例经病理诊断确诊为OLK的受试者，随访过程中，6例受试者因随访中使用维A酸药物而排除，3例受试者因未说明原因的失访而退出，最终纳入数据分析的受试者共105例，其中高表达组14例，低表达组91例（图1）。所有入组受试者均进行组织病理学检查和EZH2蛋白的免疫组织化学染色（图2）。

本研究中，共有12（11.4%）例受试者的OLK病损发生癌变，其中女性7例（n=53），男性5例（n=52），中位癌变时间为17.5月，所有的受试者癌变病损部位均位于舌腹。

2.2 EZH2高表达组和低表达组基线信息分析

基线分析显示，EZH2高表达组和低表达组在年龄、性别、全身系统性疾病史、不良习惯、精神状态、饮食情况、睡眠情况上的差异均无统计学意义（P>0.05）。在病损位置上，EZH2高表达组中的舌腹处病损占比为85.7%，舌背或口内其他位置处病损占比为14.3%，颊部病损未见EZH2高表达，EZH2低表达组中，舌腹处病损占比为50.5%，舌背或口内其他位置处病损占比为18.7%，颊部病损占比为30.8%，差异有统计学意义（P=0.017）。进一步两两比较，EZH2高、低表达组中，舌腹和舌背及其他、颊部和舌背及其他进行比较，差异无统计学意义（P>0.05），舌腹和颊部进行比较，差异有统计学意义（P=0.007）（表1）。

2.3 EZH2高、低表达与OLK癌变相关性分析

通过Fisher精确概率法进行EZH2高表达组和低表达组中OLK癌变率差异分析，结果显示，EZH2高表达组受试者癌变率为28.6%，低表达组受试者癌变率为8.8%，差异无统计学意义（P=0.053，表2）。

为评估当前样本量下的统计效能，进行了事后检验效能分析。以α=0.05，效应量为0.221，总样本量n=105为基础，计算出实际检验效能（1-β）为0.58。

2.4 OLK癌变风险因素的单因素Cox比例风险回归模型

通过单因素Cox比例风险回归模型探究各因素与OLK癌变风险的关系。纳入分析的变量包括：①人口学特征：性别、年龄；②病损特征：病损位置、大小、上皮异常增生程度；③分子标志物：EZH2表达分组；④系统性疾病史：高血压、糖尿病、高血脂；⑤生活习惯：吸烟、饮酒、咀嚼槟榔；⑥其他因素：疼痛情况、饮食情况、精神状态及睡眠情况（表3）。结果显示，相比于EZH2低表达组，EZH2高表达组受试者的癌变风险升高3.647倍（HR=3.647，95%CI：1.097-12.120，P=0.035）。进行事后检验效能分析，以HR=3.647，事件数为12，总样本量n= 105为基础，计算出实际检验效能为0.662。相比于轻度上皮异常增生，中度上皮异常增生受试者癌变风险升高10.695倍（HR=10.695，95%CI：2.270-50.396，P=0.003），重度上皮异常增生受试者癌变风险增加至13.623倍（95%CI： 1.918-96.774，P=0.009）。进行事后检验效能分析，分别以HR=10.695、HR=13.623，事件数为12，总样本量n=105为基础，计算出实际检验效能为0.914和0.945。

2.5 OLK癌变风险因素的KM生存分析

基于Kaplan-Meier法构建的生存分析模型显示，在30个月的随访中，EZH2高表达组无癌生存率较EZH2低表达组降低19.8%。生存曲线的时序检验（Log-Rank test）证实两组间差异具有统计学意义（P=0.023）（图3）。

2.6 OLK癌变风险因素的多因素Cox比例风险回归模型

选择单因素Cox比例风险回归分析中显著性小于0.1的变量构建多变量Cox比例风险模型（逐步后退法）以评估各因素的独立预后价值，最终模型仅纳入中度、重度上皮异常增生两个变量，模型通过比例风险假设检验（P<0.001），具备良好可靠性。结果显示，较轻度上皮异常增生来说，中度上皮异常增生受试者癌变风险是其10.695倍（HR=10.695，95%CI： 2.270-50.396， P=0.003），重度上皮异常增生受试者癌变风险是其13.623倍（HR=13.623， 95%CI： 1.918-96.774， P=0.009）。EZH2高表达组对OLK癌变风险预测的独立价值不显著（P=0.134）。进行事后检验效能分析，计算出EZH2高表达、年龄、中度上皮异常增生及重度上皮异常增生的多因素Cox回归分析实际检验效能为0.507、0.050、0.914和0.945（表4）。

3 讨 论

OLK是临床常见的、有较大癌变潜能的一类口腔黏膜潜在恶性疾病（oral potentially malignant disorder， OPMD），OLK进展为OSCC，被称为是口腔白斑病癌变（malignant transformation， MT）^［13］。OLK的癌变率为1.1% ~ 40.8%^［14-16］，近期一项囊括了26项研究共6 486个OLK病例的系统性综述结果得出总体癌变率为7.2%^［14］。而Pinto等^［15］对全球各个地区23 489例OLK患者的癌变率进行系统性分析，得出总体癌变率为 9.7%。本研究中OLK癌变率为11.42%，略高于此前meta分析中报道的总体癌变率，差异可能与随访时间、样本来源有关。

近年来，分子生物学的进步为揭示OLK癌变机制和预测OLK癌变风险提供了新的视角。OLK的癌变是一个复杂且多因素的过程，涉及基因突变、表观遗传修饰和肿瘤微环境失调^［17-18］。其中表观遗传调控是指基因表达的可遗传且稳定的改变，这种改变通过调节基因表达而不影响DNA序列来促进OSCC的形成和发展，包括 DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重组和非编码RNA（non-coding RNAs， ncRNAs）失调^［19］。

EZH2是一种具有高度保守序列的组蛋白甲基化转移酶，通过PRC2复合物从调控组蛋白H3第27位赖氨酸（H3K27）的甲基化调控基因表达，从而影响细胞增殖、分化以及凋亡等生物过程^［20-21］。作为表观遗传调控的重要蛋白，EZH2因其在口腔癌^［8］、鼻咽癌^［22］、胃癌^［23］、肝癌^［24］、肾癌^［25］、前列腺癌^［26］、乳腺癌^［27-28］和肺癌^［29］等多种恶性肿瘤中具有重要作用而备受关注，正在成为新兴的肿瘤免疫治疗靶点^［30-31］。在OSCC发生发展过程中，EZH2通过抑制上皮标志物E-cadherin、激活细胞间质标志物N-cadherin，驱动上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition， EMT），增强肿瘤细胞迁移与侵袭能力；EZH2激活下游致癌通路（如Wnt/β-Catenin通路），驱动EMT及细胞周期进程，促进OSCC进展^［32］。此外，近年来多项研究揭示了长链非编码RNA（long non-coding RNA， lncRNA）与EZH2在OSCC中的协同促癌作用^［33-36］。EZH2也与OSCC患者存活率低、不良预后相关。EZH2高表达显著诱导肿瘤糖酵解、EMT、OSCC细胞迁移和侵袭^［37-38］。在小鼠中将EZH2基因选择性敲除以观察EZH2在小鼠OSCC发生过程中的作用，结果显示EZH2基因敲除小鼠中，发生侵袭性OSCC病变的比例更高^［39］。

然而，目前仅有少量研究初步探讨了EZH2在OLK中的潜在作用。EZH2与HOXC-AS1竞争性结合，抑制其与HOXC9启动子区H3的结合，导致H3K27甲基化降低和HOXC9表达增强，从而促进OLK癌性干细胞分化和间充质转化，最终导致其癌变^［40］。既往回顾性研究结果显示，OLK患者上皮中的T细胞数量与表达 EZH2的细胞数量呈中度正相关，EZH2高表达组的无癌生存率（cancer-free survival， CFS）显著降低，EZH2 高表达组发生OSCC的危险比是EZH2低表达组的13倍^［10］。另一项研究结果表明，EZH2可作为OLK患者癌变的独立预测因子，其作用机制可能与EZH2促进细胞增殖和侵袭相关^［11］。

本研究结果显示，EZH2高表达组和低表达组在年龄、性别、全身系统性疾病史、不良习惯、精神状态、饮食情况、睡眠情况上的差异均为无统计学意义。而EZH2高、低表达组的病损位置存在统计学上的显著差异，且这种差异主要存在于舌腹处病损和颊部病损之间。舌腹处病损EZH2高表达占比较多（20.7%），舌背及其他处病损EZH2高表达占比仅为10.5%，而颊部病损无EZH2高表达，表明EZH2高表达与OLK病损位置存在相关性。尽管舌腹处病损是OLK病损的高风险区之一^{［14， 41］}，但在本研究的Cox单因素回归分析中，病损位置并未显示为OLK癌变的危险因素。以上结果提示EZH2高表达、OLK病损位置、OLK癌变三者间可能存在潜在的关联机制，尚需进一步研究以阐明其具体关系。

Fisher精确概率法结果显示， EZH2高、低表达组中癌变率分别为28.6%、8.8%，差异无统计学意义。尽管本研究未在两组之间发现显著差异，但本研究的事后效能分析显示统计效能为0.580（低于常规标准0.80），提示当前样本量可能不足以检测EZH2与OLK癌变间的真实关联，未来需扩大样本量进一步验证。因此，当前的非显著结果可能反映的是样本量不足而非效应不存在，应谨慎解读。KM生存分析模型和单因素Cox比例风险回归分析模型结果显示，EZH2高表达患者30个月癌变风险增加，提示EZH2可作为OLK癌变预测标志物。但在多因素Cox比例风险回归分析模型中，EZH2高表达对OLK癌变的影响不显著，表明EZH2对OLK癌变的独立预测价值不显著。但单因素Cox回归分析的检验效能为0.662，而多因素Cox回归分析的检验效能则进一步降低至0.507。这表明在当前样本量和阳性事件数条件下，所采用的统计方法检测实际效应的能力存在一定限制。尤其是多因素模型中，由于变量数量增加且事件数有限，可能导致过拟合，统计功效不足，未能检出真实效应的可能性较大。因此，后续研究中会进一步增加样本量或延长随访时间以获得更多癌变病例，以提升统计效能，确保多因素分析结果的稳定性和可靠性。

尽管EZH2表达水平与OLK癌变终点的二分类关联（Fisher精确概率法）未达统计学显著性，但在单因素Cox比例风险回归模型中，结果显示EZH2为显著风险因素，这种差异可能源于：首先，Fisher精确概率法主要用于比较两个或多个类别变量之间的比例差异，而并不考虑时间因素或结局出现的先后顺序，而Cox回归模型作为一种生存分析方法，可综合考虑时间-事件因素，更适合评估随访期间事件（如癌变）发生的风险，因此在检测时间相关的结局变量时更为敏感和高效^［42］。其次，Fisher精确检验的检验效能受到分组样本数和事件数的较大影响。当样本量不足或事件较少时（如本研究中事件数为12例），其检验可能因效能不足而未能检测到真实差异，从而出现接近显著但未达阈值的结果，而 Cox 模型通过整合时间信息，在事件较少的情况下可能仍具备较高的检出能力。此外，两者使用的数据结构也存在差异。Fisher精确检验只使用终点状态（即是否发生事件），而 Cox 回归可以利用了完整的生存数据（包括发生时间和删失信息），因此其结果更为全面。综上所述，两种统计方法在原理和应用上的差异可能导致分析结论不一致。在解释研究结果时，需结合方法学特性进行综合理解与判断。

此外，本研究样本量根据预试验及前期研究中EZH2高、低表达组OLK癌变率进行估算，考虑10%的脱落率，预期共需纳入114例受试者，按1： 1比例分配至高、低表达组。然而在实际入组过程中，EZH2高表达个体数量明显少于预期。20个月内共纳入105例受试者，其中仅14例为EZH2高表达组，其余91例为低表达组。这一偏差主要由于OLK人群中EZH2高表达发生频率较低所致。本研究严格依据实际暴露比例进行分析，虽导致与初始设计样本不符，影响统计效能，但更贴近真实情况。未来研究可考虑扩大样本量或开展多中心合作，以提高结果的稳健性与外推性。

本研究的随访时间为 30 个月，中位癌变时间为17.5个月，然而，有研究表明OLK的癌变过程通常较为缓慢，平均癌变时间超过4年，部分患者甚至在10年后才发生癌变^［43-44］。因此，本研究的随访时长虽具有一定的观察价值，但仍可能低估了真正的累积癌变风险，特别是对于癌变发生较晚的个体。因此，笔者在讨论结果时应谨慎解释，承认随访时间有限可能造成的低估偏倚，并建议未来进行更长期随访研究，以全面评估 OLK 的真实癌变风险及其时间特征。

综上所述，虽然既往研究已报道EZH2在OSCC中的高表达现象，并指出其与不良预后相关^［45］，或是提示EZH2在癌前病变中亦具有重要作用^［11］，但是这些研究为横断面研究或回顾性研究，未进行长期随访。本研究通过前瞻性队列设计，克服了横断面研究及回顾性研究的局限性，通过Fisher精确检验、KM生存分析、单因素及多因素Cox比例风险回归模型多种统计学分析方法进一步确认EZH2可作为OLK癌变的生物标志物，但其对OLK癌变的独立预测作用仍待进一步验证，鉴于本研究中高表达组样本量有限，事后检验效能分析结果提示以上结果检验效能一般，相关结论的推断强度应予以谨慎解读，尚需通过更大样本量的研究进一步验证。

未来研究希望能构建多中心、长期的前瞻性OLK队列，整合临床危险因素、组织病理学数据以及相关生物标志物，进一步确定EZH2高表达对OLK癌变的预测作用，同时可以进一步结合多组学分析深入探讨EZH2在OLK癌变中的分子机制，明确EZH2蛋白在OLK癌变中的具体作用。

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基金资助

上海市科技计划项目(20Y11903700)

上海市第九人民医院“临+”研究基金项目(JYLJ202121)