含BGN温敏粘接剂的制备及其对屏障膜的固定性能研究

A study on the preparation of a BGN-loaded thermosensitive adhesive and its performance in barrier membrane fixation

摘要

目的 探讨含生物活性玻璃纳米颗粒的温敏型粘接剂对屏障膜的固定性能及增强引导骨再生（guided bone regeneration，GBR）的能力，为GBR术中屏障膜固定提供新方案。 方法 通过自由基聚合构建以丙烯酸甲氧基乙酯、N-异丙基丙烯酰胺和原儿茶酸为基础粘接剂，掺入生物活性玻璃纳米颗粒（bioactive glass nanoparticle，BGN）制备温敏型粘接剂M2NP@BGN（methoxyethyl acrylate-co-N-isopropylacrylamide-co-protocatechuic acid@Bioactive glass nanoparticle）。利用衰减全反射傅里叶变换红外光谱、核磁共振波谱对基础粘接剂M2NP进行合成表征，利用扫描电镜、流变仪对BGN掺入后的温敏粘接剂M2NP@BGN（BGN浓度为1 mg/mL）进行合成表征。随后调控BGN的浓度（0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL），利用万能试验机评估各组材料的粘接强度和机械强度，并采用CCK-8细胞增殖与毒性实验和溶血实验评估各组材料生物相容性，以优选出性能最佳的粘接剂配比。将优选的材料浸提液与小鼠骨髓间充质干细胞共孵育，通过RT-qPCR、碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测其体外促成骨能力。最后，建立大鼠下颌骨缺损模型，并充填骨粉，随后采用不同方式固定屏障膜，分为M2NP@BGN（BGN浓度为1 mg/mL）固定组（M2NP@BGN组）、钛钉固定组（Nail组）及未固定组（Negative组），于术后8周通过微计算机断层扫描技术和组织学染色分析其体内引导骨再生效果。 结果 成功构建了M2NP@BGN（BGN浓度为1 mg/mL）粘接剂，在湿热环境下能快速成胶。其中 BGN浓度为1 mg/mL的粘接剂在37 °C湿条件下粘接强度最高（P < 0.001），机械强度明显增强（P < 0.001），且各组材料细胞活性>80%，溶血率<5%，生物相容性良好。M2NP@BGN（BGN浓度为1 mg/mL）还能上调成骨基因Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）和Ⅰ型胶原（collagen type Ⅰ，Col Ⅰ）的表达（P < 0.001），并增强成骨分化标志物的活性（P < 0.05）。动物实验表明，与Negative组和Nail组相比，M2NP@BGN（BGN浓度为1 mg/mL）组能显著增加新生骨的体积分数（P < 0.05）和成熟度。 结论 M2NP@BGN（BGN浓度为1 mg/mL）兼具优异的湿粘接性和促成骨活性，能够增强屏障膜的骨增量效果，为GBR术提供了一种具有临床转化潜力的新固定方案。

Abstract

Objective To investigate the barrier membrane fixation performance and enhanced guided bone regeneration (GBR) capability of a thermosensitive adhesive containing bioactive glass nanoparticles in order to provide a novel solution for membrane fixation during GBR procedures. Methods M2NP@BGN (methoxyethyl acrylate-co-N-isopropylacrylamide-co-protocatechuic acid@Bioactive glass nanoparticle), a thermosensitive adhesive, was synthesized via free radical polymerization by compositing methoxyethyl acrylate, N-isopropylacrylamide, and protocatechuic acid into a basic adhesive that was modified with bioactive glass nanoparticle (BGN). The successful fabrication of basic adhesive M2NP was characterized by attenuated total reflection–Fourier transform infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance spectroscopy. The thermosensitive adhesive M2NP@BGN (BGN concentration of 1 mg/mL) was characterized by scanning electron microscopy and a rheometer. By adjusting the BGN concentration (0.1 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, and 2 mg/mL), the adhesive and mechanical strengths were investigated with a universal testing machine. Biocompatibility was evaluated with a cell counting kit-8 assay and hemolysis test to identify the optimal formulation. The optimal material’s extract was co-cultured with mouse bone marrow mesenchymal stem cells, and its osteogenic activity was examined in vitro by quantitative real-time PCR, alkaline phosphatase, and alizarin red S staining. The rat mandibular defect model was established, filled with bone graft, and divided into 3 groups based on membrane fixation method: M2NP@BGN (BGN concentration of 1 mg/mL) fixation group (M2NP@BGN), titanium nail fixation group (Nail), and unfixed control group (Negative). Bone regeneration was analyzed after 8 weeks by micro computed tomography and histological staining. Results M2NP@BGN (BGN concentration of 1 mg/mL) was successfully synthesized and demonstrated rapid gelation under warm, humid conditions. The adhesive with a BGN concentration of 1 mg/mL exhibited the highest adhesive strength (P < 0.001) and significantly enhanced mechanical strength (P < 0.001) under 37°C wet conditions. All formulations showed excellent biocompatibility, with cell viability > 80% and hemolysis ratio < 5%. M2NP@BGN (BGN concentration of 1 mg/mL) significantly upregulated the expression of Runx2 and Col I (P < 0.001) and enhanced the activity of osteogenic differentiation markers (P < 0.05). In the animal model, the M2NP@BGN group (BGN concentration of 1 mg/mL) achieved significantly higher bone volume fraction and better bone maturity compared to the negative and nail groups (P < 0.05). Conclusion M2NP@BGN (BGN concentration of 1 mg/mL) combines excellent wet adhesion with potent osteogenic activity, enhances the bone augmentation efficacy of membranes, and presents a novel fixation strategy with significant clinical translation potential for GBR therapy.

Graphical abstract

关键词

引导骨再生 / 屏障膜 / 固定 / 粘合剂 / 生物活性玻璃纳米颗粒 / 湿粘接 / 温敏材料 / 骨缺损 / 骨修复 / 成骨分化

Key words

guided bone regeneration / barrier membrane / fixation / adhesive / bioactive glass nanoparticle / wet adhesion / thermosensitive materials / bone defect / bone repair / osteogenic differentiation

引导骨再生（guided bone regeneration，GBR）是一种常用的骨增量手段，需要通过覆盖屏障膜隔离周围软组织，营造封闭、稳定的成骨微环境^［1-2］。其中，屏障膜不仅在生物屏障功能中发挥关键作用，还能为骨替代材料（如骨粉）提供空间稳定作用^［3］。因此，屏障膜固定对于确保GBR手术的成功至关重要。然而，现有的屏障膜固定方式存在诸多局限。如临床上常用的膜钉、缝线固定，存在操作繁琐、术区受限，以及组织损伤的风险^［4-7］。研究显示，在未进行有效膜固定的情况下，骨移植物的位移率高达30%，从而导致骨增量不足的问题^［8］。因此，具备操作简便、组织损伤小等优势的组织粘接剂逐渐受到重视^［9］。然而，市售的组织粘接剂（如纤维蛋白胶等）存在湿润环境中粘附力不足、固化时间不可控等问题，目前临床上尚缺乏能够有效满足GBR手术需求的专用屏障膜粘接剂^［10-12］。

研究表明，在粘接体系中引入疏水性成分，可有效提升粘接剂在湿润环境中的耐湿性，从而保障其长期粘接强度^［13-14］。同时，温敏材料在体温条件下能够快速成胶，有助于实现可控的固化过程，提高手术操作性^［15-16］。近年来，生物活性玻璃纳米颗粒（bioactive glass nanoparticle，BGN）因其良好的生物活性和骨传导性而备受关注^［17-19］。此外，BGN的掺入还能通过与聚合物基质形成物理缠结与氢键作用以提高粘接强度，将其引入粘接体系有望在实现稳定粘接的同时协同促进骨再生过程^［20］。基于上述现状，本研究构建一种以丙烯酸甲氧基乙酯（methoxyethyl acrylate，MEA）、N-异丙基丙烯酰胺（N-isopropylacrylamide，NIP）和原儿茶酸（protocatechuic acid，PCA）为粘接剂基础，并掺入BGN的温敏湿粘接剂，并对其粘接性能、生物相容性、诱导成骨分化和骨增量能力进行检测，以期为屏障膜固定提供更加便利、有效的新方案。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

MEA（3121-61-7，阿拉丁公司，中国）；NIP（2210-25-5，阿拉丁公司，中国）；PCA（99-50-3，阿拉丁公司，中国）；BGN（B139901，阿拉丁公司，中国）；可吸收屏障膜（Bio-Gide^®，Geistlich，瑞士）、骨粉（Bio-Oss^®，Geistlich，瑞士），二者在文中简称为屏障膜与骨粉；无酶水（5L510B，Biosharp，中国）；多聚甲醛（BL539A，Biosharp，中国）；N，N-二甲基甲酰胺（68-12-2，富宇化工，中国）；无水乙醇（64-17-5，富宇化工，中国）；α-MEM培养基（M3404，索莱宝，中国）；胎牛血清（16000-044，Gibco BRL，美国）；CCK-8细胞增殖与毒性检测试剂（96992，MilliporeSigma，美国）；青霉素链霉素双抗（PB180120，普诺赛，中国）；小鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）（CP-M131，普诺赛，中国）；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）（PB180327，普诺赛，中国）；模拟体液（G0390，索莱宝，中国）；0.22 μm针式滤器（SLGP033RB，Millipore，美国）；超速纯化细胞RNA提取试剂盒（RC102-01，诺唯赞，中国）；PrimeScriptTM RT Master Mix（RR036Q，Takara，日本）；TB GreenTM Premix Ex TaqTM（RR820Q，Takara，日本）；曲拉通X-100（octylphenol ethoxylate，TritonX-100）（04807426，MP Biomedicals，美国）；碱性磷酸酶染液（alkaline phosphatase staining，ALP）（G1480，索莱宝，中国）；茜素红染液（Alizarin Red S，ARS）（C0138-100ml，碧云天，中国）；苏木精伊红染色试剂盒（G1005，赛维尔生物科技，中国）、马松三色染色液（G1006，赛维尔生物科技，中国）。

旋蒸仪（蒸发仪2000A，秋佐科技，中国）；衰减全反射傅里叶变换红外光谱仪（attenuated total reflection-Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR）（FTIR-8400S，Shimadzu，日本）；核磁共振波谱仪（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）（400MHz，BRUKER，德国）；扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）（S-4800，Hitachi，日本）；旋转流变仪（MCR102e，安东帕，奥地利）；万能试验机（AGS-X，Shimadzu，日本）；全波长酶标仪（Multiskan SkyHigh，Thermo Fisher Scientific，美国）；实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Real-time PCR，qPCR）（CFX9 Conne，Bio-Rad，美国）仪；倒置相差显微镜（CKX53，Olympus，日本）；激光共聚焦显微镜（FV1000，Olympus OlyVIA，日本）；微计算机断层扫描（micro computed tomography，Micro-CT）（AX-2000，奥影检测，中国）。

1.2 M2NP@BGN的制备

利用自由基聚合反应来构建基础粘接剂M2NP（methoxyethyl acrylate-co-N-isopropylacrylamide-co-protocatechuic acid）。将2.5 g MEA、4.32 g NIP 和 2.653 g PCA溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，并与引发剂偶氮二异丁腈混合后，通入氩气30 min以充分排出空气。将该混合液在厌氧80 ℃条件下充分反应12 h，形成基础粘接剂M2NP。称取不同质量的BGN加入到等量基础粘接剂M2NP中，制备BGN在基础粘接剂中浓度为0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL的温敏粘接剂，分别命名为M2NP@0.1BGN、M2NP@0.5BGN、M2NP@BGN和M2NP@2BGN。使用前，在旋蒸仪中去除多余的溶剂以纯化样品。

1.3 M2NP@BGN的合成表征

1.3.1 衰减全反射傅里叶变换红外光谱检测

根据实验设计，使用ATR-FTIR检测基础粘接剂M2NP中的官能团，与各单体的图谱对比研究。

1.3.2 核磁共振氢谱检测

使用NMR波谱仪在25 °C下，以甲醇为溶剂采集M2NP的核磁共振谱。

1.3.3 扫描电镜观察

将M2NP@BGN（BGN浓度为1 mg/mL）样品与屏障膜进行粘接，待在去离子水中完全成胶后，脱水干燥喷金，通过SEM配套的能量分散X射线光谱分析粘接剂表面的元素组成。

1.3.4 流变性检测

将M2NP@BGN（BGN浓度为1 mg/mL）置于液体环境中完全成胶固化，使用25 mm的平行板记录湿粘接剂的粘弹性。按1%应变和1 Hz频率进行温度扫描测试，从25 °C到37 °C进行测量。记录存储模量（storage modulus，G'）与损耗模量（loss modulus，G''），以评估M2NP@BGN样品的温敏凝胶化行为和粘弹性。

1.4 不同BGN浓度的M2NP@BGN的粘接性能和力学性能优化

1.4.1 粘接强度检测

采用砝码提拉法初步检验粘接剂在干、湿环境下的粘接效果。首先，在干燥的烧杯底部涂布粘接剂，用砝码按压后尝试提拉烧杯；继而，在涂有粘接剂的烧杯内加入去离子水以模拟口腔湿润环境，再进行相同的按压与提拉操作。通过对比两种状态下烧杯能否被成功提起，以评估其湿粘接能力。

使用万能试验机在100 mm/min 的恒定剪切速度下评估可吸收屏障膜（6 mm × 10 mm）与牛皮质骨（3 mm × 6 mm × 20 mm）之间的剪切粘接强度。皮质骨事先去除骨膜并清洁表面，将各比例粘接剂（BGN浓度分别为0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL）涂覆于骨表面，随后立即放置可吸收屏障膜。然后将每个样本随机分配，在以下4种条件下成胶固化12 h：25 °C干燥环境、37 °C干燥环境、25 °C湿环境和37 °C湿环境中孵育。为了模拟生理条件，使用PBS作为液体湿环境，随后将可吸收屏障膜-粘接剂-牛皮质骨粘接样品在25 ℃或37 ℃的湿盒中孵育不同的时间，并在25 ℃或37 ℃下检测粘接强度。粘接强度通过最大剪切力除以接触面积计算得到。

1.4.2 拉伸断裂强度评估

使用标准哑铃状2型试样模具制作湿粘接剂的拉伸实验样品，待样品完全固化后在万能试验机上进行拉伸试验。拉伸断裂强度通过材料断裂时的最大拉力除以材料的原始横截面积计算得到。

1.5 不同BGN浓度的M2NP@BGN的生物相容性的评估

1.5.1 CCK-8细胞增殖实验

将BGN浓度分别为0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL的粘结剂材料500 mg，分别加入到50 mL α-MEM培养基中浸泡4 h，用0.22 μm针式滤器过滤除菌，制备得到10 mg/mL浓度的各组粘接剂材料浸提液备用。在96孔板中以3 × 10³ /孔的密度接种小鼠BSMCs，与材料浸提液共孵育。常规培养48 h后，使用CCK-8试剂盒定量细胞活力。

1.5.2 溶血实验

按参考文献^［21］的方法，将各组粘接剂样本置于1.5 mL微量离心管中，在37 ℃的模拟体液中完全固化后，随后向管中滴加1 mL 2%大鼠红细胞混悬液，以PBS为阴性对照、TritonX-100为阳性对照。37 ℃下孵育30 min后，离心5 min，取200 μL上清于96孔板中，检测540 nm的光密度值。通过分析各组光密度值进行血液相容性评价。

1.6 M2NP@BGN的成骨性能评估

1.6.1 成骨诱导培养基的配置

按照地塞米松终浓度为100 nmol/L、β甘油磷酸钠终浓度为10 mmol/L、维生素C终浓度为50 ug/mL、双抗终浓度为1%和胎牛血清终浓度为10%的配方配置完全成骨诱导培养基，并在4 ℃条件下避光保存。将500 mg的M2NP@BGN（BGN浓度为1 mg/mL）粘接剂材料，加入到50 mL的成骨诱导培养基中浸泡24 h后，用0.22 μm针式滤器过滤除菌备用。以不含材料浸提液的完全成骨诱导培养基作为对照。

1.6.2 ALP和ARS染色

将小鼠BSMCs按8×10³ /孔的密度接种于6孔板，待细胞密度长至70%~80%时开始加入各组成骨诱导培养基（含或不含材料浸提液）。每3 d进行半换液，14 d后，用PBS洗涤，并用4%多聚甲醛固定15 min，使用ALP进行染色；在21 d后，用PBS洗涤，并用4%多聚甲醛固定15 min后，使用ARS进行染色，弃去染液，用去离子水轻轻多次清洗，于倒置显微镜不同倍数下拍照观察。

1.6.3 RT-qPCR检测

成骨诱导及检测参照文献^［22］的方法。将BSMCs按密度8×10³ /孔接种于6孔板上，待细胞密度为70%~80%时开始加入成骨诱导液。每3 d换液，14 d后使用RNA提取试剂盒提取RNA，随后使用PrimeScriptTM RT试剂进行逆转录以制备cDNA，在实时荧光定量PCR仪上检测Runx2、Col Ⅰ的mRNA表达，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参。引物序列见下表1。

1.7 M2NP@BGN的体内应用效果评价

1.7.1 构建大鼠下颌骨缺损模型

所有SD（sprague-dawley）大鼠购买于空军军医大学实验动物中心（实验动物合格证：NO20240150），动物实验方案获经空军军医大学实验动物福利与伦理委员会批准（伦理批准号： 2024-kq-028）。取8周龄、体重250~300 g SD大鼠，随机分为3组（每组 n=3），实验组以M2NP@BGN（BGN浓度为1 mg/mL）粘接固定屏障膜（M2NP@BGN）；阳性对照组以钛钉固定屏障膜（Nail）；阴性对照组屏障膜不固定（Negative），所有大鼠于手术前通过腹膜内注射3%戊巴比妥钠进行麻醉。沿下颌骨下缘做手术切口，仔细分离重要神经血管。使用骨膜剥离器剥离下颌骨的骨膜。为确保屏障膜具备充足的粘接支撑面，参照文献^［23-25］的方法，在无菌生理盐水持续冲洗下，使用高速钻头制造骨缺损（长×宽×高：3 mm×2 mm×1 mm）。随后，在缺损处填充骨粉，并分别使用M2NP@BGN粘接剂或大鼠用钛钉固定屏障膜，阴性对照不固定。随后使用5-0可吸收缝线缝合肌肉层，4-0不可吸收缝线缝合皮肤层。术后给予大鼠软食。

1.7.2 Micro-CT评估骨再生效果

Micro-CT扫描参数如下：电压80 kv，电流70 μA。在8周时采用过量戊巴比妥钠（100 mg/kg）处死大鼠，使用灰度分析量化骨再生效果，得出骨体积分数（bone volume/total volume，BV/TV）和骨小梁厚度（trabecula thickness，Tb.Th）。

1.7.3 Masson染色分析骨再生效果

将术后第8周大鼠下颌骨样本，脱钙包埋于石蜡中并切片，按照说明书用Masson三色染料进行下述染色：切片脱蜡至水，先后用苏木素、丽春红和苯胺蓝进行染色，染色完成后，进行脱水和透明处理，最后用树脂封存，于倒置显微镜不同倍数下拍照观察。

1.8 统计分析

使用GraphPad Prism 10.0 进行统计学分析，计量资料用\overline{x}±s表示，数据符合正态分布和方差齐性，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析方法。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 M2NP@BGN的构建及表征

采用自由基聚合法构建M2NP基础粘接剂。聚合产物的ATR-FTIR结果显示3 280 cm^-1处的吸收峰归属于NIP上的N-H的伸缩振动峰，1 589 cm^-1处是PCA中苯环的骨架振动吸收峰，1 157 cm^-1处则对应MEA上C-O-C的伸缩振动吸收峰，产物基础粘接剂M2NP的红外基团峰中包含了原料上的基团，说明材料复合成功（图1a）。

进一步通过NMR分析显示，反应后单体的烯烃质子（δH 5.60~6.19 ppm）信号基本消失，各单体的特征质子信号均得到归属，表明M2NP聚合成功。而PCA作为粘接功能基团，通过与NIP形成氢键稳定存在于该体系中，羧基峰得到归属，因此成功构建出M2NP基础粘接剂（图1b）。采用能量分散X射线光谱对M2NP@BGN（BGN浓度为1 mg/mL）粘接剂表面的元素分布进行分析，结果显示BGN在整个基础粘接剂网络中均匀分布（图1c）。

M2NP@BGN在成胶前表现出良好的可注射性，并在湿环境中能迅速凝胶化（图2a），所得的水凝胶具有一定的初始黏性（图2b）。相比之下，该水凝胶在干燥条件下的粘接性能较差，而加水后其粘接性能则可以提升（图2c）。流变学检测显示，当温度升至临界值（约32°C）时，G'开始超越G''，表明体系发生溶胶-凝胶转变（图2d）。以上结果表明通过自由基聚合成功构建了M2NP@BGN粘接剂，其具备作为体内屏障膜粘接剂的应用潜力。因此，后续实验着重于优化其配方比以进一步提升各项性能。

2.2 不同BGN浓度的M2NP@BGN的粘接性能及力学性能优化

为探究M2NP@BGN湿粘接剂在不同条件下的粘接性能，本研究评估了4种处理条件（25 °C干燥环境、37 °C干燥环境、25 °C湿环境和37 °C湿环境）下材料的粘接强度。结果显示，于不同条件处理12 h后，湿热情况下的粘接强度最高（P < 0.001，图3a），表明M2NP@BGN能适应体内湿热环境。

随后，通过调控BGN的投入比（BGN浓度分别为0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL）以优选湿粘接性能最佳的粘接剂组，结果显示M2NP@0.1BGN（BGN浓度为0.1 mg/mL）与M2NP@BGN（BGN浓度为1 mg/mL）组表现出最优的粘接强度，且两组间差异不具有统计学意义（P > 0.05，图3b）。

进一步，通过评估各组材料完全固化后的拉伸断裂强度以分析其力学行为，结果显示，随着BGN含量的增加，粘接体系的力学强度呈上升趋势（图3c）。

为了检测BGN改性湿粘接剂的长期应用效果，将各组粘接剂在37 ℃湿环境下孵育24、48、72、120、168 h后检测其粘接强度。结果表明，M2NP@BGN组虽然在72 h后有所下降，但仍保持最高粘接强度并趋于稳定（图3d）。

综上所述，M2NP@BGN在长期湿热环境中具备优异的粘接性能，粘接性能表现更佳。

2.3 不同BGN浓度的M2NP@BGN的生物相容性的评估

CCK-8实验结果显示， BMSCs与各组湿粘接剂共培养48 h后， 细胞活性均在80%以上（图4a），表明湿粘接剂具有良好的细胞相容性。

由于粘合剂不可避免地会在手术期间与血液接触，因此通过溶血测试以评估水凝胶的血液相容性。各组湿粘接剂均表现出低于5％的溶血率，满足体内安全要求（图4b）。

虽然上述材料的安全性均在规定阈值内，但随着BGN含量的增高，材料的细胞安全性有所减弱。

综合考虑粘接性能以及材料的安全性，最终选择M2NP@BGN（BGN浓度为1 mg/mL）用于后续体内外成骨性能检测。

2.4 M2NP@BGN的成骨性能表征

将BSMCs与材料浸提液共培养成骨诱导14 d、21 d后分别进行ALP与ARS染色观察。结果显示，BSMCs与M2NP@BGN组（BGN浓度为1 mg/mL）材料浸提液共培养14 d后，ALP 活性显著高于对照组（ P < 0.05，图5a、5b）；21 d时形成矿化结节明显增多，ARS染色程度显著增强（P < 0.05，图5a、5b）。

成骨诱导培养14 d后，通过RT-qPCR检测材料浸提液对BSMCs成骨相关基因Runx2和Col Ⅰ相对表达量的影响。结果显示，与对照组相比，M2NP@BGN组Runx2基因和Col Ⅰ基因的相对表达显著提高，差异有统计学意义（P<0.001，图5c），表明M2NP@BGN粘接剂具有促成骨效果。

综上，M2NP@BGN不仅具有优异的粘接力和生物安全性，还表现出显著的促成骨能力，为体内骨增量应用奠定基础。

2.5 M2NP@BGN的体内应用效果评价

通过构建大鼠下颌骨缺损模型，评估M2NP@BGN（BGN浓度为1 mg/mL）在体内固定屏障膜并促骨再生的能力。在大鼠下颌骨咬肌窝处制备标准骨缺损并充填骨粉，然后于骨缺损周边骨面涂布M2NP@BGN粘接剂，随即覆盖屏障膜并施压实现初步粘接。伤口缝合后，粘接剂在体温和体液作用下完成原位凝胶化（图6）。

通过Micro-CT分析评估骨增量效果，扫描结果显示，术后8周时，M2NP@BGN组骨缺损区域已有大量新生骨组织充填，而Nail组与Negative组仍存在明显骨缺损（图7a）。进一步定量分析显示，M2NP@BGN组的BV/TV值（82.25±4.57%）显著高于Nail组（64.22±5.83%）与Negative组（50.88±6.30%）（P < 0.05），而Nail组与Negative组之间差异无统计学意义（P > 0.05，图7b）。此外，M2NP@BGN组的Tb.Th同样为3组中最高（图7c）。这些结果表明，M2NP@BGN粘接剂能有效促进骨再生，改善GBR手术的预后效果。

为了进一步观察骨缺损部位新生骨组织形态，对术后８周的下颌骨样本进行组织学分析。Masson染色结果显示，各组骨缺损边缘均有不同程度的新生组织长入，其中M2NP@BGN组的新生组织面积最大、成熟度最高，Nail组与Negative组骨缺损处仅有少量新生骨组织长入（图8）。除此，各组骨粉均未完全降解，其中M2NP@BGN组的残余骨粉均分布于新生骨和粘接剂内，Nail组的残余骨粉也分布于骨缺损区域，而Negative组残余骨粉最少。M2NP@BGN粘接剂能有效固定屏障膜并显著促进骨缺损修复，在GBR术中展现出良好的应用潜力。

3 讨 论

GBR的成功在很大程度上依赖于屏障膜的固定，以维持骨再生微环境的稳定^［26］。本研究成功构建了一种BGN改性的湿粘接剂—M2NP@BGN，旨在解决当前临床中屏障膜固定方法的局限性。

本研究通过自由基聚合，将具有疏水性的MEA、温敏性的NIP和提供粘接基团的PCA整合到同一聚合物网络中，并在粘接体系中引入成骨活性的BGN。合成表征结果证实目标产物的成功构建。该材料在湿环境中具有疏水诱导相分离引起的水触发行为。流变分析进一步表明，材料在体温附近具有温敏成胶性，这一温敏性使得粘接剂从软凝胶态转化为刚性聚合物网络，从而在凝胶化后获得更优异的力学性能^［27］。上述特性使其适于术中注射和体内原位成胶固化，提升了手术的可操作性^［28-30］。尽管目前临床尚无屏障膜专用粘接剂，但本研究表明，M2NP@BGN在模拟体内环境的湿热条件下表现出优异的粘接强度，M2NP@BGN的粘接强度远超临床常用的纤维蛋白胶（27.2 kPa）^［31］。这凸显了其作为体内应用粘接剂的巨大潜力。

值得注意的是，BGN的引入对粘接剂的综合性能也起到了调控作用。研究发现，当BGN浓度为1 mg/mL时，粘接剂能获得最佳的湿粘接强度，同时能获得较强的力学性能。这可能是由于BGN与聚合物网络中的PCA的酚羟基发生了离子螯合作用，虽然能增强材料的内聚强度^［32］， 但过量BGN可能屏蔽PCA酚羟基在界面上的粘接作用，从而影响了界面粘附力^［33］。这一现象揭示了粘接剂内部内聚力与界面粘附力之间的复杂平衡关系^［34-36］。本研究发现，M2NP@BGN（BGN浓度为1 mg/mL）展现了最稳定的粘接性能，表明其具有最持久可靠的固定效果。

在生物安全性方面，CCK-8和溶血实验结果均表明M2NP@BGN具有良好的细胞相容性和血液相容性，满足体内植入材料的基本要求^［37］。成骨诱导实验表明，M2NP@BGN能显著上调成骨相关基因（Runx2， Col I），并促进碱性磷酸酶活性和矿化结节的形成。这证实了M2NP@BGN能有效诱导BMSCs的成骨分化^［38］。

在大鼠下颌骨缺损模型中，M2NP@BGN实验组能将骨粉有效固定于骨缺损内，最终实现出最显著的骨再生效果，而Negative组不仅骨再生效果不佳其残余骨粉也最少，这可能与其骨粉大量泄漏有关。传统的Nail组虽具有良好的骨粉稳定效果，但是可能因钛钉植入过程造成了手术创伤，导致了不良预后，这更加凸显粘接剂具有微创的临床应用优势^［39-40］。因此，M2NP@BGN不仅通过粘接固定屏障膜稳定成骨微环境，更通过BGN的生物活性促进了骨修复进程，实现了“固定”与“促成骨”的双重功效。

本研究还存在一定局限性。例如，因目前缺乏市售的屏障膜专用粘接剂，笔者选择传统固定方式钛钉作为阳性对照，因而与传统湿粘接剂的对比还需要进一步检测探索。此外，本研究仅使用市售的模拟体液处理粘接剂，未考虑口腔微生物环境对粘接剂性能的潜在影响，因此未来的研究需要进一步纳入考量。目前实验仅基于大鼠模型，后续需在大动物模型中进行验证，以更好地预测M2NP@BGN的临床转化潜力。粘接剂在长期降解过程中与新生骨的整合过程仍需进一步探索^［36］。

综上所述，本研究开发的M2NP@BGN湿粘接剂具有湿粘接性能、良好生物相容性以及促成骨活性等多种优势，为GBR术中屏障膜固定提供了一种高效、微创且具有成骨活性的新策略。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82325012)

国家自然科学基金项目(82301043)