一种新的F型嗜麦芽菌素的特征分析及其基因簇的确定

Characterization of a novel F⁃type maltocin and identification of its gene cluster

摘要

嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）是一种条件致病菌，其拥有多重耐药性。细菌素是由细菌合成的具有杀菌功能的蛋白质或蛋白聚合物，其中类噬菌体尾部细菌素的形态与肌尾噬菌体或长尾噬菌体的尾部相似，分为R型和F型。嗜麦芽菌素F1是一种新的F型类噬菌体尾部细菌素，由嗜麦芽寡养单胞菌c25合成。电镜观察显示其形态类似长尾噬菌体的尾部，双层平板法检测其杀菌活性最高达到64 000 AU/mL，能够裂解64株测试菌株中的32株。通过序列分析和基因敲除实验确定其基因簇由18个基因组成，这些基因的排列与Lambda噬菌体尾部结构基因的排列一致。这是首次分离到嗜麦芽寡养单胞菌合成的F型类噬菌体尾部细菌素，该细菌素有较强的杀菌能力和较广的杀菌谱，有望代替抗生素用于治疗嗜麦芽寡养单胞菌的感染。

Abstract

Stenotrophomonas maltophilia is an opportunistic pathogen， with multi⁃drug resistance. Bacteriocin is a kind of bactericidal protein or protein complex synthesized by bacteria， and the morphology of phage tail⁃like bacteriocin is similar to the phage tails of Myoviridae or Siphoviridae and can be divided into R⁃type and F⁃type. Maltocin F1 isolated in this study was detected as a new F⁃type phage tail⁃like bacteriocin synthesized by S. maltophilia c25. Transmission electron microscopy showed that its morphology was similar to the tail of Siphoviridae.The bactericidal activity of maltocin F1 was up to 64 000 AU/mL. Thirty⁃two strains of the 64 tested strains were sensitive to maltocin F1. Sequence analysis and gene knockout experiment predicted that the gene cluster of maltocin F1 was composed of 18 genes， the arrangement of which was consistent with that of the tail structural genes of phage lambda. This is the first time to isolate the F⁃type phage tail⁃like bacteriocin synthesized by S. maltophilia. Maltocin F1 has strong bactericidal ability and broad bactericidal spectrum， suggesting that it is a potent substitute of antibiotics in the treatment of S. maltophilia infections.

Graphical abstract

关键词

嗜麦芽寡养单胞菌 / 类噬菌体尾部细菌素 / 杀菌活性 / 基因组分析

Key words

Stenotrophomonas maltophilia / phage tail⁃like bacteriocin / bactericidal activity / genomic analysis

0 引 言

嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），又名嗜麦芽窄食单胞菌，是一种专性需氧的非发酵型革兰氏阴性菌，因其拥有快速分解麦芽糖的能力而得名^［1］。该菌分布非常广泛，包括水体、土壤和植物根际等自然环境^［2］，动物和人类的皮肤、呼吸道、肠胃^［3］，以及医院的呼吸装置、内窥镜等临床设备^［4］。嗜麦芽寡养单胞菌是重要的条件致病菌，免疫力低下及危重症患者感染后死亡率较高^［5］。该菌不仅天然多重耐药^［6⁃8］，还能通过种内或种间的基因水平转移获得新的多重耐药性^［9⁃12］，极大增加了嗜麦芽寡养单胞菌感染的临床治疗难度。目前，该菌已被世界卫生组织列为全球医院的主要耐药病原体之一^［13］。

细菌素（bacteriocin）是一类由细菌合成的蛋白质或蛋白复合物，有高效、专一的杀菌能力，但对产生菌具有免疫原性，能使产生菌在种间竞争中处于优势^［14］。根据细菌素组成的不同，可分为单基因编码的细菌素和多基因编码的细菌素，其中类噬菌体尾部细菌素（phage tail⁃like bacteriocin， PTLB）是典型的多基因编码的细菌素^［15］。根据形态可将PTLB分为R型和F型两类。R型PTLB形态类似于肌尾噬菌体（Myoviridae）的尾部，可伸缩，结构包含尾管、尾鞘、基板和尾丝等，目前已报道的PTLB大多数为R型^［16］；F型PTLB形态类似于长尾噬菌体（Siphoviridae）的尾部，柔软不可伸缩，结构上有尾管没有尾鞘^［17］。PTLB在进化过程中与噬菌体有一定的亲缘关系^［15］，大多数PTLB基因簇上能预测到典型的噬菌体裂解基因，PTLB释放到胞外依赖其自身的裂解系统。研究发现PTLB具有较高的杀菌效率^［18］，这表明PTLB对于病原菌的防控有着良好的效果，在抗生素滥用的大背景下，PTLB成为了治疗多重耐药性病原菌感染的潜在手段^{［19，20］}。

本研究分离到一种由嗜麦芽寡养单胞菌产生的F型PTLB，命名为嗜麦芽菌素F1（maltocin F1），测定了其基本理化特性和杀菌谱，并确定了其基因簇，为探索应对嗜麦芽寡养单胞菌多重耐药性的解决策略提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源和培养条件

本研究涉及的65株嗜麦芽寡养单胞菌菌株均由本实验室保存，其中嗜麦芽寡养单胞菌c25分离自临床唾液样本，是嗜麦芽菌素的产生菌株。嗜麦芽寡养单胞菌接种至LB液体培养基中，于30 ℃，200 rpm振荡培养^［21］。

1.2 试剂和引物

胰蛋白胨、酵母提取物购于OXOID公司；氯化钠、EDTA购于国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉、Tris、PEG8000购于BioFroxx公司；氨苄青霉素、氯霉素、丝裂霉素C购于北京索莱宝科技有限公司；蛋白酶K购于Thermo Fisher Scientific 公司；质粒小提试剂盒购于天根生化科技有限公司；胶回收试剂盒购于OMEGA公司。本实验所用引物见表1。

1.3 嗜麦芽菌素的分离纯化

向对数期（OD_{600 nm}≈1.0）的嗜麦芽寡养单胞菌菌液中加入1‰（m/V）的起始浓度为0.5 mg/mL的丝裂霉素C，于30 ℃，200 rpm振荡培养6 h。菌液12 000 rpm离心10 min，收集上清，重复两次，得到嗜麦芽菌素粗液^［22］。取50 mL嗜麦芽菌素粗液，使用0.22 μm滤膜过滤，向滤液中加入4%（m/V）的PEG8000和3%（m/V）的NaCl^［23］，充分混匀，12 000 rpm离心30 min，弃上清，用1 mL TE缓冲液孵育沉淀12 h，12 000 rpm离心10 min后的上清液为浓缩的细菌素，通过氯化铯密度梯度离心^［24］，得到纯化的嗜麦芽菌素样品。

1.4 电镜观察嗜麦芽菌素

取1 μL纯化的嗜麦芽菌素样品，滴在铜网上，用2%的醋酸双氧铀负染，干燥后通过透射电镜观察嗜麦芽菌素形态^［21］。

1.5 嗜麦芽菌素的杀菌活性检测

采用双层平板法检测细菌素的杀菌活性^［22］。首先，取50 μL指示菌菌液和4 mL熔化的LB半固体培养基，混匀，倒在LB平板上，制备双层平板；然后，将嗜麦芽菌素样品作2倍梯度稀释，取2 μL稀释液滴加到平板表面，置于30 ℃培养过夜，观察有无抑菌圈，并计算杀菌活性。

1.6 同源重组基因敲除

使用自杀质粒pDM4构建敲除载体^［25］。以嗜麦芽寡养单胞菌c25基因组DNA为模板，用TT⁃LA F/R和TT⁃RA F/R引物，通过PCR分别扩增上下游同源臂，并通过重叠PCR将上、下游同源臂连接到一起^［22］，再将整个同源臂插入pDM4，构建敲除gene0230的载体pDM4⁃TT；用HTC⁃LA F/R和HTC⁃RA F/R引物，采取相同方法构建敲除gene0227的载体pDM4⁃HTC。通过接合法^［26］，将敲除载体转入嗜麦芽寡养单胞菌c25，多次传代培养后，用蔗糖培养基筛选获得目的基因缺失的菌株，后通过PCR反应和测序验证目的基因是否敲除成功。

1.7 基因回补

使用质粒pBTP3构建回补载体^［21］。以嗜麦芽寡养单胞菌c25基因组DNA为模板，用TT F/R引物和HTC F/R引物，PCR扩增目的基因gene0230和gene0227，并将其分别插入质粒pBTP3的P3启动子之后，通过接合法^［26］将回补载体分别转入嗜麦芽寡养单胞菌c25缺失菌株内。

2 结果与分析

2.1 嗜麦芽菌素的形态观察

在透射电子显微镜下观察纯化嗜麦芽菌素的形态（图1）。嗜麦芽菌素形状类似于长尾噬菌体的尾部，长约120 nm，宽约7.5 nm，属于F型PTLB，将其命名为嗜麦芽菌素F1。

2.2 嗜麦芽菌素F1的杀菌谱

双层平板法检测发现嗜麦芽菌素F1对供试的64株嗜麦芽寡养单胞菌的 32株能够形成抑菌圈，其中对20株菌的抑菌圈是透明的，对12株菌的抑菌圈是不透明的（图2）。以这32株嗜麦芽寡养单胞菌作为指示菌，检测嗜麦芽菌素F1的杀菌活性（表2）。结果表明，嗜麦芽菌素F1对其中6株菌杀菌活性最高，达到64 000 AU/mL。后面的实验选择从土壤样品中分离到的嗜麦芽寡养单胞菌25作为嗜麦芽菌素F1的指示菌。

2.3 嗜麦芽菌素F1的敏感性

将嗜麦芽菌素F1在不同温度下水浴10 min，迅速冰浴冷却，用双层平板法检测其杀菌活性（表3）。结果表明，温度在30~60 ℃时，嗜麦芽菌素F1能够维持较高的杀菌活性；温度高于60 ℃时活性迅速降低，65 ℃已完全失活。

嗜麦芽菌素F1悬液中加入终浓度为100 μg/mL的蛋白酶K，50 ℃水浴20 min后，双层平板法未检测到抑菌活性，说明嗜麦芽菌素F1的主要成分是蛋白质。

2.4 嗜麦芽菌素F1的基因簇定位和分析

实验室前期已经完成了嗜麦芽寡养单胞菌c25的全基因组测序（GenBank No.CP129112），序列分析发现c25菌的基因组上有两个预测的前噬菌体区域，其中一个区域与该菌产生的短尾噬菌体序列完全一致，说明c25菌含有一个溶原噬菌体；另一个区域全长16 465 bp，GC含量为65%，包含从gene0227到gene0244共18个预测的基因。以gene0227的起始密码子ATG的A为起始，对各个预测基因编码的蛋白BLASTp分析比较结果见表4。BLASTp对比发现10个基因预测到编码功能蛋白，这些基因的排列与Lambda噬菌体尾部结构基因的排列一致。其中，gene0230编码的蛋白含有噬菌体尾管蛋白特有的保守结构域Phage_tail_3，尾管蛋白是噬菌体尾部的主要结构蛋白^［27］。同时，在gene0227的上游和gene0244的下游均没有检测到与噬菌体头部结构和组装相关的基因。因此，推测gene0227到gene0244区域是合成嗜麦芽菌素F1的基因簇。

为进一步确定该区域为嗜麦芽菌素F1的基因簇，通过同源重组基因敲除法，缺失了c25菌株的gene0230。分别以嗜麦芽寡养单胞菌c25和缺失菌株作为模板，用TT⁃C L/R引物进行PCR检测，c25菌的PCR条带应为1 992 bp，缺失菌株的PCR条带大小应为1 344 bp，电泳结果与预期相符，将缺失菌株命名为c25ΔTT，见图3（a）。对c25菌和c25ΔTT菌进行丝裂霉素（MMC）诱导，取离心后的上清液滴加在双层平板上，c25菌的样品出现抑菌圈而c25ΔTT菌的样品无抑菌圈，见图3（b）。说明gene0230的缺失导致嗜麦芽菌素F1无法被合成。构建gene0230的回补载体pBTP3⁃TT，通过接合法转入c25ΔTT，回补菌株命名为c25ΔTT/gene0230。将c25ΔTT/gene0230的菌液进行MMC诱导，取离心后的上清液滴加在双层平板上，未检测到抑菌活性，见图3（b）。由于嗜麦芽菌素F1类似于Lambda噬菌体尾部，而尾管蛋白在Lambda噬菌体尾部组装过程中非常重要^［27］，且尾管蛋白是尾部的主要结构蛋白，通过回补载体合成的尾管蛋白可能在空间位置上距离其他尾部蛋白很远，导致其无法完成尾部组装过程中的被招募和招募过程，敲除尾管基因后回补也无法恢复嗜麦芽菌素F1的合成。

紧接着缺失了c25菌株的gene0227。分别以嗜麦芽寡养单胞菌c25和缺失菌株的基因组DNA作为模板，用HTC⁃C L/R引物进行PCR检测，c25菌的PCR条带应为1762 bp，缺失菌株的PCR条带大小应为1279 bp，电泳结果与预期相符，将缺失菌株命名为c25ΔHTC，见图3（c）。对c25菌和c25ΔHTC菌进行MMC诱导，取离心后的上清液滴加在双层平板上，发现c25ΔHTC菌的样品的抑菌活性对比c25菌的样品显著减弱，见图3（d），说明gene0227的缺失导致嗜麦芽菌素F1的功能出现异常。构建gene0227的回补载体pBTP3⁃HTC，通过接合法转入c25ΔHTC，回补菌株命名为c25ΔHTC/gene0227。将c25ΔHTC/gene0227的菌液进行MMC诱导，取离心后的上清液滴加在双层平板上，其抑菌活性恢复至正常水平，见图3（d）。

3 讨 论

嗜麦芽寡养单胞菌是一种能够引起严重感染的条件致病菌，临床症状包括肺炎、菌血症、皮肤病和泌尿系统感染等^{［28⁃32］}。嗜麦芽寡养单胞菌对大多数抗生素耐药，除去固有耐药性以外，还拥有强大的获得性耐药性^{［33⁃39］}。因此，治疗嗜麦芽寡养单胞菌的感染非常困难，造成其较高的死亡率，寻找高效的治疗药物迫在眉睫。PTLB与烈性噬菌体一样具有杀菌活性，可用于治疗多重耐药菌的感染，而且PTLB比噬菌体稳定，其制备和保存也更为容易。目前已有PTLB治疗病原菌感染动物的报道，如利用R型脓菌素治愈感染铜绿假单胞菌的小鼠^［40］；也有实验证实通过定向改造PTLB的尾丝基因，能使PTLB具有特定的杀菌谱，如将F型单核菌素的尾丝基因和李斯特菌噬菌体A118的尾丝基因融合，使F型单核菌素具有了噬菌体A118的杀菌谱^{［41，42］}。这些研究表明PTLB作为抗菌制剂的潜力和应用价值。

嗜麦芽菌素F1是一种F型PTLB，这是首次分离到嗜麦芽寡养单胞菌产生的F型PTLB。序列分析表明F1基因簇含有18个预测的基因，结合BLASTp对比将其中10个基因编码的蛋白预测为有功能的蛋白。将F1基因簇与GenBank数据库中的嗜麦芽寡养单胞菌基因组进行BLASTn对比，发现有8个基因组中对应区域的序列相似度大于80%，说明这类F型PTLB基因簇在嗜麦芽寡养单胞菌中高度保守。大多数PTLB基因簇上能预测到典型的噬菌体裂解基因，这些基因编码的蛋白在PTLB组装完成后裂解细菌，使PTLB释放到胞外^［22］；然而在c25菌基因组中嗜麦芽菌素F1基因簇的上下游均没有发现与噬菌体裂解相关的基因，由于c25菌中的溶原噬菌体有裂解基因，并能将合成的噬菌体释放到胞外。因此，推测嗜麦芽菌素F1的释放可能依赖c25菌原噬菌体的裂解系统。虽然目前没有检测到c25菌溶原噬菌体的敏感菌，但是嗜麦芽菌素F1能够裂解64株嗜麦芽寡养单胞菌中的一半菌株，并对部分菌株表现出很高的杀菌活性，而且在60 ℃以下的环境中一直保持较高的稳定性，以上结果表明，嗜麦芽菌素F1有较强的杀菌活性和较广的裂解谱，并且热稳定性强，有较好的应用潜力。

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基金资助

国家科技基础资源调查专项(2021FY100900)

国家大学生创新创业训练计划项目(202110486031)