热带药材虎乳灵芝质量标准建立

Establishment of quality standards for the tropical herbs Lignosus rhinocerus

摘要

制定热带药材虎乳灵芝的质量标准。该研究对虎乳灵芝药材的性状、显微结构和薄层色谱特征进行了定性鉴别，参照《中国药典》2020年版测定其水分、总灰分、浸出物含量，并采用紫外分光光度法对总多糖等含量指标进行测定。规定虎乳灵芝药材水分含量不得超过13.0%、总灰分不得超过2.0%、水溶性浸出物含量不得少于3.0%；以无水葡萄糖作对照，虎乳灵芝药材总多糖含量不得少于0.45%。通过研究，建立了虎乳灵芝专属性薄层，创新了显微鉴别方法，并制定了虎乳灵芝药材标准。该研究方法重现性好，简便高效，可用于热带药材虎乳灵芝的质量控制，为进一步控制虎乳灵芝药材质量、研究与开发虎乳灵芝提供了参考。

Abstract

This study aims to establish the quality standard of Lignosus rhinocerus， a tropical medicinal herb. In this study， the qualitative identification of traits， microstructure and thin‑layer chromatographic characteristics of Lignosus rhinocerus was carried out. The contents of water， total ash and extract contents of Lignosus rhinocerus were determined by according to the methods of Chinese Pharmacopoeia in 2020. UV spectrophotometric method was applied for the determination of total sugars content. The quality standards of Lignosus rhinocerus are that the moisture content shall not exceed 13.0%， the total ash shall not exceed 2.0%， and the content of water‑soluble leachate shall not be less than 3.0%； and with dextrose anhydrous as the control， the total sugars content of Lignosus rhinocerus should not be less than 0.45%. The results of the study established a proprietary thin‑layer identification method for Lignosus rhinocerus and derived the optimal extraction process for the total flavonoids of Lignosus rhinocerus The method is reproducible， simple and efficient， and can be used for the quality control of Lignosus rhinocerus. It provides a reference for the further control of the quality of the herbs of Lignosus rhinocerus， and for the research and development of Lignosus rhinocerus.

Graphical abstract

关键词

虎乳灵芝 / 质量标准 / 总多糖

Key words

Lignosus rhinocerus / quality standard / total sugars

0 引 言

虎乳灵芝药材名为虎乳灵芝（Lignosus），为多孔菌科（Polyporaceae）虎乳灵芝（Lignosus rhinocerus （Cooke） Ryv.）的菌核，生于林中地上，从腐殖层长出，主要分布在海南、印度尼西亚、菲律宾、马来西亚等热带地区^［1］。虎乳灵芝含有丰富的多糖、氨基酸、蛋白质等多种营养成分，其中，活性蛋白有凝集素、丝氨酸蛋白酶和纤溶活性蛋白等，营养成分有麦角甾醇、甾醇类及羊毛脂烷型三萜类化合物，还含有脂肪酸、酚类、灵芝酸等多种药理作用的活性物质^［2‑8］。

虎乳灵芝在马来西亚使用广泛，常用来治疗咳嗽、感冒、发烧、食物中毒和创伤，或用来滋补^［9］。中医认为虎乳灵芝有止咳定喘、健脾化湿的功效，民间常用于治疗哮喘及咳喘，疗效极佳。现代研究发现其提取物具有抗氧化活性、抗肿瘤活性、抗菌活性和松弛气道的作用。虎乳灵芝菌核的提取物、冷水提取物和甲醇提取物均具有较高的清除能力和自由基还原能力^［3］。虎乳灵芝菌核的冷水提取物对人乳腺癌细胞MCF‑7和人肺癌细胞A549均有抑制增殖活性，并且虎乳灵芝中分离出的丝氨酸蛋白酶可以抑制乳腺癌细胞增殖^{［10，11］}。虎乳灵芝多糖组分均可以诱导肿瘤缩小，对先天免疫细胞的增殖具有积极影响^{［12，13］}。提取于虎乳灵芝菌核的溶液可以抑制革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌的生长，同时可以抑制真菌的增殖^［14］。虎乳灵芝菌核水提物具有促进受损坐骨神经功能恢复的活性的作用^［15］。虎乳灵芝可以松弛预收缩气道，显著抑制了卡巴胆醇、5‑羟基异丙胺和钙诱导的气道收缩^［16］。

1999年，中国报道了热带药材虎乳灵芝，该药材此前在马来西亚广泛使用，并衍生出多种产品^［17］。目前，海南地区也存在其野生种，且形成一定的人工培育和种植规模。但中国对于虎乳灵芝的报道较少，同时虎乳灵芝药材质量标准存在空缺，为确保药材的安全，保证药材饮片的质量，迫切需要建立该药材的质量标准。本研究参照《中国药典》2020年版^［18］，采用薄层色谱法、紫外分光光度法等方法，从性状、显微鉴定、薄层色谱鉴别、水分、总灰分及水溶性浸出物等方面，制定了海南习用药材虎乳灵芝的质量标准，为进一步控制虎乳灵芝药材质量、研究与开发虎乳灵芝提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

DHG‑9053A型电热恒温鼓风干燥箱（浙江托普仪器有限公司）；F‑040SD型福洋牌超声波清洗机（深圳福洋科技集团有限公司）；PL203型千分之一电子天平（梅特勒‑托利多仪器（上海）有限公司）；HH‑6型数显恒温水浴锅（常州荣华仪器制造有限公司）；Nikon ECLPSE80i型生物显微镜（日本尼康）；LE104E/02型万分之一电子天平（梅特勒‑托利多仪器（上海）有限公司）；JY025型紫外分析仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；YTH‑4‑10型箱式电阻炉（绍兴市苏珀仪器有限公司）；UV‑1900型紫外‑可见分光光度计（岛津仪器苏州有限公司）。

1.1.2 试剂

试剂：无水葡萄糖对照品（购自中国食品药品检定研究院，批号：110833‑201707）；环己烷、甲酸乙酯、甲酸、甲醇、苯酚、浓盐酸、乙醇，均为中国产分析纯（西陇科学）；实验用水为娃哈哈。

1.1.3 药材

材料：使用10批样品的干燥菌核，如表1所示。经海南师范大学生命科学学院曾念开教授鉴定为多孔菌科（Polyporaceae）虎乳灵芝（Lignosus rhinocerus （Cooke）Ryv.），凭证（腊叶）标本保存于海南省中药标本馆，在中国医学科学院药用植物研究所海南分所内。其中，采自于海口市龙华区的虎乳灵芝为对照药材，编号为HRLZ20220824004。

1.2 方法

1.2.1 性状鉴别

取表1中10批虎乳灵芝药材，依照《中国药典》2020年版第四部的性状鉴定方法^［18］，对形状、大小、表面色泽、质地及气味进行鉴定和描述。

1.2.2 显微鉴别

选取平整的薄片置载玻片上，取表1中10批虎乳灵芝粉末（四号筛），分别滴加水或5%的KOH溶液1~2滴，于生物显微镜下观察显微结构^［19］。

1.2.3 薄层色谱鉴别

研究者取表1中10 批虎乳灵芝粉末1 g，加入无水乙醇20 mL，超声60 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，得到供试品溶液。另取对照药材（HRLZ20220824004）1 g，按照上述方法提取，得到对照品溶液。

参照2020年版《中国药典》四部薄层色谱法试验^［18］，分别吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上， 放入环己烷∶甲酸乙酯∶甲酸（15∶5∶0.2）的展开缸里，展开，晾干。置于紫外光灯下（365 nm）检视。

1.2.4 浸出物、总灰分、水分含量测定

取表1中10批虎乳灵芝粉末，总灰分、水分、浸出物测定方法分别依照《中国药典》2020年版（四部）通则下的烘干法、总灰分测定法、浸出物测定法进行测定^［18］。

1.2.5 总多糖含量测定

1）样品溶液的制备。取本品粉末约2 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，加入50 mL纯水，加热回流2 h，滤过，滤液置50 mL量瓶中，加纯水至刻度，摇匀即得。

2）对照品溶液的制备。精密称取干燥至恒质量的葡萄糖对照品10.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，即可以得浓度为100‍‍‍ ‍μg/‍mL的葡萄糖对照品溶液。

3）标准曲线的绘制。分别精密吸取葡萄糖对照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于10 mL试管中，加纯水至1 mL，再加入1 ‍mL浓度为6%的苯酚溶液，加入4 mL浓硫酸，沸水浴25 ‍min后冷水浴10 min，在487 nm处测定其吸光度^［20］。

4）精密度试验。精密称取虎乳灵芝药材（编号：HRLZ20231023006）2 g，按供试品制备方法制备，测定总多糖含量。

5）重复性试验。精密称取无水葡萄糖对照品溶液0.4 mL，测定总多糖的含量。

6）稳定性试验。精密吸取供试品溶液（编号：HRLZ20231023006）1.0 mL，每隔5 min测定一次吸光度，连续30 min。

7）加样回收试验。取已知含量的同一批虎乳灵芝样品（编号：HRLZ20230731007）6 份，每份各2 g，精密称定，按供试样品制备的方法制备，精密称取样品溶液0.2 mL，置于10 mL具塞试管中，分别精密加入无水葡萄糖对照品溶液0.2 mL。照标准曲线的制备项下的方法，自“加纯水至1 mL”起依法测定吸光度并计算的含量。

8）样品溶液的总多糖含量测定。对10 批虎乳灵芝药材进行提取，并测定其吸光度，得出相应的总多糖含量。

2 结 果

2.1 性状鉴别

性状鉴别结果显示如图1所示，本品为不规则片状，大小不一，直径为1~8 cm，厚为1~3 cm。切面不平坦，白色或淡黄色，呈颗粒性。外皮呈灰褐色薄且多粗糙有不规则裂纹。质地坚硬，气微，味淡。

2.2 显微鉴别

显微鉴定结果显示如图2所示，粉末呈灰白色或淡黄色，味淡。粉末用水装片显微镜下可见类圆形多糖团块，中间透明，边缘近黑色，无色菌丝，相缠绕附着在上面。粉末用5%的氢氧化钾液装片，团块溶化，露出菌丝和菌丝团，菌丝无色，细长，不规则弯曲，有分枝，直径为1~3 μm^［21］。

2.3 薄层色谱鉴别

薄层色谱结果显示如图3所示，供试品薄层色谱中在与对照药材薄层色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，可用于虎乳灵芝的鉴别。

2.4 浸出物、总灰分、水分含量测定

2.4.1 浸出物预实验结果

按照浸出物测定法进行水溶性冷浸、热浸及醇溶性冷浸、热浸的浸出物实验测定，并计算药材中水溶性冷浸、热浸，以及醇溶性冷浸、热浸中浸出物含量，如表2所示，X为平均值，sd为标准偏差。由此可得，水溶性热浸法测定浸出物的平均含量最高，为3.93%。因此，应以水溶性热浸法测定分别对10 批不同产地及采集时间的虎乳灵芝药材进行水溶性浸出物测定，并计算药材中水溶性浸出物含量。

2.4.2 浸出物、总灰分、水分含量测定结果

10 批虎乳灵芝药材水分含量为9.25%~11.20%，平均值为10.18%，根据10 批虎乳灵芝水分含量平均值乘120%，得到虎乳灵芝水分含量限定标准：10.18%×1.20=12.21%，拟规定虎乳灵芝药材水分含量不得超过13.0%。10 批虎乳灵芝总灰分含量为0.76%~1.23%，平均值为1.03%，根据10 批虎乳灵芝总灰分含量平均值乘120%，得到虎乳灵芝总灰分含量限量标准：1.03%×1.20=1.23%，拟规定虎乳灵芝药材总灰分含量不得超过2.0%。10 批虎乳灵芝药材浸出物含量为3.54%~4.75%，平均值为4.18%，根据10 ‍批虎乳灵芝浸出物含量平均值乘80%，得到虎乳灵芝浸出物含量限量标准：4.18%×0.80=3.35%，拟规定虎乳灵芝药材浸出物含量不得少于3.0%。结果显示如表3所示。

2.5 总黄酮含量测定结果

1）线性关系考察。以吸光度（A）为纵坐标，浓度（mg/g）为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程y‍=59.241x+0.1025（R²=0.999 3）。结果表明，以无水葡萄糖作为对照品，其浓度在0.001 67~0.016 67 mg/ mL范围内与吸光度线性关系良好。

2）精密度。重复测定6次结果表明，总多糖含量的RSD=0.47%，表明仪器精密度良好。

3）重复性。平行测定6次结果表明，总多糖含量的RSD为0.55%，表明该方法重复性良好。

4）稳定性。结果表明，供试品溶液在30 min内显色稳定，RSD=0.59%。

5）加样回收率。测得总多糖平均加样回收率为99.14%，RSD值为1.38%。

6）总多糖含量。10批虎乳灵芝药材总多糖含量为0.61%~1.23%，如表3所示，根据总多糖含量得最小值乘80%，得到虎乳灵芝药材总多糖含量限定标准为0.45%，故拟规定虎乳灵芝药材按干燥品计算，总多糖含量不得少于0.45%。

3 结 论

本文参照《中国药典》2020年版，制定出了海南热带地区虎乳灵芝药材的质量标准^{［18，22］}。规定了水分含量不得超过13.0%，总灰分不得超过2.0%，水溶性浸出物含量不得少于3.0%；建立了虎乳灵芝专属薄层色谱鉴别，以环己烷∶甲酸乙酯∶甲酸（15∶5‍∶0.2）为展开剂，置于紫外光灯下（365 nm）检视；并采用紫外分光光度法进行总多糖的测定，规定了虎乳灵芝药材按干燥品计算，总多糖含量不得少于0.45%。

虎乳灵芝是在马来西亚广泛使用的真菌，距今已有400 a的历史，常用来治疗咳嗽、感冒、发烧、食物中毒和创伤^{［23‑25］}。除此之外，在中国广东、海南、香港等地，虎乳灵芝也被用来治疗喘咳、肝炎等疾病^［26］。在中国海南地区，虎乳灵芝虽然具有一定的人工培育种植规模，衍生出多种产品，但是质量标准的相关研究仍十分匮乏。本研究制定了虎乳灵芝的质量标准，填补了虎乳灵芝药品标准的空白，为以虎乳灵芝药材为原料的产品提供了鉴别、检验和检测的依据^［27］。同时，为虎乳灵芝药材的合理使用及用药标准的深入研究提供了理论支持。

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基金资助

海南省重大科技计划项目(ZDZX2021034)

万宁市科研项目(2022wnkj10)