寨卡病毒感染TLR3基因敲除小鼠模型的构建

Construction of a TLR3 gene knockout mouse model infected with Zika virus

摘要

Toll样受体3（Toll-like receptor 3，TLR3）在寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）感染介导的炎症反应及神经损伤中具有重要作用，然而，ZIKV感染TLR3基因敲除小鼠模型的开发相对滞后，其应用潜力尚未被充分挖掘。因此，建立合适的动物感染模型对解析ZIKV致病机制及研发防治策略具有重要意义。本研究成功建立并验证了TLR3-KO小鼠模型，该模型在寨卡病毒系统性感染特征、组织病理损伤模式及免疫应答特征方面均展现出良好的实验适用性，为探究寨卡病毒致病分子机制及抗病毒药物研发提供了可靠的动物实验平台。

Abstract

Toll-like receptor 3 （TLR3） plays a crucial role in the inflammatory responses and neural damage associated with Zika virus （ZIKV） infection. However， the development of ZIKV infection models utilizing TLR3 gene knockout mice has been relatively delayed， and their potential applications remain inadequately explored. Therefore， establishing appropriate animal infection models is significantly important for elucidating the pathogenic mechanisms of ZIKV and for developing effective prevention and treatment strategies. In this study， we successfully established and validated a TLR3 knockout （KO） mouse model. This model demonstrates excellent experimental applicability regarding systemic infection characteristics， histopathological damage patterns， and immune response features of ZIKV， thereby providing a reliable platform for in-depth exploration of the molecular mechanisms underlying ZIKV pathogenesis and the development of antiviral drugs.

Graphical abstract

关键词

寨卡病毒 / Toll样受体3 / 小鼠模型

Key words

Zika virus / Toll-like receptor 3 （TLR3） / mouse model

0 引 言

寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）在1947年首次从乌干达恒河猴体内分离，是一种单股正链RNA病毒，属于黄病毒科黄病毒属（Flavivirus）^［1］。2007年首次暴发大规模ZIKV疫情^［2］，2015年，巴西出现大规模ZIKV感染，人数逾百万，并出现死亡病例^［3］。因此，世界卫生组织在2016年将ZIKV列为国际关注的突发公共卫生事件^［4］。ZIKV主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）叮咬传播^［5］。血液、泪液、母婴及性传播等非蚊媒途径也有报道^［6-8］。孕妇感染尤为危险，病毒可突破胎盘屏障引发小头畸形、脑皮质发育异常、视网膜瘢痕等结构缺陷，甚至导致胎儿宫内死亡^［9］。神经侵袭性是ZIKV重要致病特征，可诱发格林-巴利综合征（Guillain-Barré syndrome，GBS）、脑膜脑炎及急性播散性脑脊髓炎等严重并发症^［10］。

Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）是一类广泛存在于免疫细胞和组织的模式识别受体，通过识别病原体（如细菌、病毒）的病原相关分子模式（如脂多糖、病毒RNA）激活机体免疫应答，是机体先天免疫的“第一道防线”^［11］。参与病原体核酸识别的TLR（TLR3、TLR7、TLR8和TLR9）位于内溶酶体区室内，而其他TLR家族成员（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6）位于细胞表面。TLR3是Toll样受体家族成员，主要识别病毒RNA，通过独特的\beta干扰素TIR结构域衔接蛋白（TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF）依赖信号通路激活干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）和核因子\kappaB（nuclear factor Kappa-B，NF-\kappaB），诱导Ⅰ型干扰素（type Ⅰ interferon，IFN-Ⅰ）和炎症因子释放，在抗病毒免疫中起核心作用，TLR3异常可能导致病毒感染易感性或自身免疫紊乱^［12］。ZIKV进入细胞后，TLR3识别病毒核酸并诱导Ⅰ型干扰素表达，进而诱导下游干扰素刺激基因（interferon-stimulated gene，ISG）及炎症因子（如肿瘤坏死因子tumor necrosis factor，TNF）、趋化因子（如chemokine （C-C motif） ligand 5，CCL5）表达，从而抑制病毒的增殖^［13］。已有研究表明，ZIKV感染脑类器官后，激活TLR3，诱导炎症反应、细胞凋亡并导致神经损伤^［14］；而在神经胶质细胞中，TLR3抑制的条件下，ZIKV复制则减少，且诱导较弱的炎症反应^［15］。这些研究表明，TLR3在ZIKV感染介导的炎症反应及神经损伤中具有重要作用。然而，ZIKV感染TLR3基因敲除小鼠模型的开发相对滞后，其应用潜力尚未充分挖掘，并且目前全球尚无获批的ZIKV特效抗病毒药物或疫苗^［16］。因此，建立合适的动物感染模型对解析ZIKV致病机制及研发防治策略具有重要意义。

本研究首次采用TLR3基因敲除（TLR3 knockout，TLR3-KO）的小鼠构建ZIKV感染模型，实验证实，该模型可实现病毒多器官复制（脑及生殖器）并诱发特征性病理改变，为研究ZIKV致病机制提供了新型平台。

1 材料和方法

1.1 细胞与病毒

非洲绿猴肾细胞（Vero E6）来源于武汉大学中国典型培养物保藏中心，白纹伊蚊（Aedes albopictus）幼蚊细胞（C6/36）、寨卡病毒（SZ-wiv01株）来自武汉大学生命科学学院陈宇教授实验室。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）高糖细胞培养基和RNA提取Trizol试剂购于Life Technologies公司；RNAeasy^TM病毒RNA抽提试剂盒购于上海碧云天生物技术股份有限公司，RNA逆转录试剂盒购于翌圣生物科技（上海）股份有限公司；胎牛血清和磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、24孔细胞培养板、T75细胞培养板均购于GIBCO公司；LightCycler 480 Real-time PCR system购于Roche公司；memmert INCO153二氧化碳培养箱；Thermo LEGEND MACH 1.6R高速离心机。

1.3 寨卡病毒的扩增

将C6/36细胞接种于T75细胞培养瓶中，待细胞汇合度达到约80%时，按感染复数（multiplicity of infection，MOI）=0.05感染ZIKV；随后将T75细胞培养瓶置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中培养，待细胞病变度在70%左右时，收集细胞培养液上清，4 ℃ 1 000g离心10 min，分装，-80 ℃冻存备用。

1.4 动物模型和病毒感染

无特定病原体（specific pathogen free，SPF）动物级别TLR3-KO小鼠由北京唯尚立德生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证编号：SCXK（京）2021-0010。在武汉大学动物实验中心的隔离环境中进行纯合子交配，TLR3-KO小鼠感染实验在动物二级生物安全实验室（ABSL-2）完成，实验室备案编号：鄂卫生安备ABSL-2［2021］01-05-010，相关动物实验通过武汉大学实验动物福利伦理审查（审查批号：WP20220092）。采用随机数字表法挑选5~8周龄小鼠，经尾静脉注射寨卡病毒SZ-wiv01株（1×10⁵ PFU/只）；对照组经尾静脉注射同体积PBS。在感染后第3天、第5天、第7天、第12天采用CO₂安乐死术处死小鼠，收集各组的小鼠脏器组织，一部分组织样本用于固定染色，一部分用试剂盒提取RNA，采用One Step PrimeScript RT-PCR kit进行实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测，引物序列见表1。

1.5 苏木精和伊红染色

在感染病毒后的第3天、第5天、第7天、第12天采用CO₂安乐死术处死对照组及实验组小鼠，收集脑、肝、脾及生殖器官组织，4%多聚甲醛固定，经水洗、脱水和石蜡包埋后进行切片，苏木精和伊红染色（hematoxylin-eosin staining，H&E）观察组织病理性变化。

1.6 统计学方法

实验数据以\overline{x}\pm s表示，各组间的实验数据采用Student’s unpaired t-test或Two-way ANOVA进行分析，ns表示p>\mathrm{0.05}，无统计学差异；*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001，差异具有统计学意义。使用GraphPad Prism 8软件生成图表。

2 结果与分析

2.1 检测TLR3-KO小鼠感染ZIKV后脑部病毒载量和炎症因子表达

用RT-qPCR检测TLR3-KO小鼠尾静脉注射PBS或ZIKV后，第3天、第5天、第7天、第12天脑部ZIKV、ISG15、CCL5、TNF-α的mRNA水平，每个组织样本设置3个平行孔，结果见图1。图1（a）显示，与PBS组小鼠相比，实验组雄鼠脑组织在第3天和第5天可以检测到ZIKV病毒基因，雌鼠脑组织在第3天、第5天、第7天、第12天均可以检测到ZIKV病毒基因，这表明实验组小鼠脑部均成功感染ZIKV。TLR3受体识别病毒RNA后，可以激活下游干扰素及炎症因子表达。图1（b）显示，TLR3-KO小鼠感染ZIKV后，实验组雄鼠脑组织ISG15在第3天约上调至对照组水平的3倍，第5天约上调至对照组水平的1.5倍，第7天约上调至对照组水平的2倍。实验组雌鼠脑组织ISG15在第3天、第5天、第7天约上调至对照组水平的2倍，第12天回复至对照组水平。图1（c）显示，TLR3-KO小鼠感染ZIKV后，实验组脑组织CCL5基因表达水平与ISG15类似，实验组雄鼠与雌鼠的CCL5基因表达水平在第3天、第5天、第7天约上调至对照组水平的4~5倍，雌鼠脑组织CCL5基因表达水平在第12天仍维持在对照组水平2倍左右。图1（d）显示，TLR3-KO小鼠感染ZIKV后，雄性小鼠脑部炎症因子TNF-α表达与实验组相比，下调约50%，而雌鼠则没有显著性差异。上述实验数据表明，尽管ZIKV感染TLR3-KO小鼠后可以激活ISG15、CCL5基因表达，但炎症因子TNF-α表达受到抑制。

2.2 检测TLR3-KO小鼠感染ZIKV后生殖器中病毒载量和炎症因子表达

用RT-qPCR检测TLR3-KO小鼠尾静脉注射PBS或ZIKV后，第3天、第5天、第7天、第12天生殖器ZIKV、ISG15、CCL5、TNF-α的mRNA水平，每个组织样本设置3个平行孔，结果见图2。图2（a）显示，与PBS组小鼠相比，实验组雄鼠生殖器在第3天、第5天、第7天可以检测到ZIKV病毒基因，雌鼠生殖器在第3天、第5天、第7天、第12天均可以检测到ZIKV病毒基因，且病毒基因表达量高于雄鼠，这表明实验组小鼠生殖器均成功感染ZIKV。图2（b）~图2（d）显示，TLR3-KO小鼠感染ZIKV后，与对照组相比，实验组雄鼠睾丸ISG15基因、CCL5基因水平均没有显著性差异，而TNF-α基因则下调了50%左右。与对照组相比，实验组雌鼠卵巢中的ISG15基因表达水平没有显著性差异，CCL5基因则在第3、5、7、12天显著上调约6~8倍，而TNF-α基因下调了50%~60%。上述实验数据表明，ZIKV感染TLR3-KO小鼠生殖器后，仅CCL5基因表达可以激活，但干扰素下游ISG15基因没有激活，且炎症因子TNF-α表达受到抑制。

2.3 TLR3-KO 小鼠感染ZIKV后组织病变分析

TLR3-KO小鼠感染寨卡病毒未出现死亡现象。感染ZIKV后第3天TLR3-KO雄性小鼠和雌性小鼠的脑及生殖器组织H&E染色结果见图3。结果显示，对照组小鼠脑、生殖器组织结构正常，无炎症细胞浸润。实验组TLR3-KO小鼠脑部局部出现炎性细胞浸润，结构紊乱。雄性小鼠睾丸组织结构松散，且出现明显的炎症细胞浸润。实验组TLR3-KO雌性小鼠卵巢出现炎性细胞浸润，结构被明显破坏。上述实验结果表明，TLR3-KO小鼠感染ZIKV后，脑组织及生殖器均出现炎症细胞浸润，组织结构损伤。

3 讨 论

非人灵长类动物、豚鼠、小鼠等是研究ZIKV感染的理想动物模型。由于野生型小鼠不易感染ZIKV，因此多采用干扰素通路关键基因缺陷型品系小鼠构建感染模型，例如，Ⅰ型干扰素受体缺陷型A129小鼠，ZIKV感染的A129小鼠致死性具有年龄依赖性，3周龄的小鼠病毒易感性更高，在感染病毒后可引起100%的致死率^［17］，因此更适合用于模拟婴幼儿ZIKV感染模型；IRF3-IRF5-IRF7基因条件性敲除的C57BL/6小鼠对ZIKV高度敏感，敏感性比A129小鼠更高，并且小鼠在感染ZIKV后，表现出后肢无力、麻痹等神经系统症状^［18］；以及Ⅰ/Ⅱ型干扰素双受体缺失的AG129小鼠，该模型的小鼠在感染ZIKV后，表现为体重减轻、神经系统损伤、病毒血症，甚至死亡，可用于判定ZIKV的毒性和病毒宿主相互作用的分子机制研究^［19］。尽管上述模型为解析ZIKV的致病机制奠定了基础，但新的动物模型有待开发。

TLR3是机体识别ZIKV、介导细胞因子表达、发挥抗病毒功能的重要模式识别受体之一^［20］。但在脑类器官中，ZIKV感染后，活化的TLR3是诱导炎症反应、细胞凋亡并导致神经损伤的关键因素^［14］。而另一方面，神经胶质细胞中的TLR3在被抑制的条件下，ZIKV复制反而减少，且诱导较弱的炎症反应^［15］。因此，TLR3在机体感染ZIKV后，发挥的功能仍有待进一步探究。然而，目前仍缺乏TLR3受体敲除的小鼠模型，亟待建立和评估ZIKV感染的TLR3-KO小鼠模型。

本研究构建了TLR3基因敲除小鼠（TLR3-KO）ZIKV感染模型。感染后小鼠组织结构损伤，但未出现死亡。病毒基因检测显示，尾静脉注射感染的小鼠在感染后第3天至第12天，其脑组织及生殖器中均可检出ZIKV基因，且相较于雄鼠，雌鼠病毒基因持续维持高水平。已有研究表明，母婴传播是ZIKV传播的重要途径^［21-22］，因此，本研究TLR3-KO雌鼠生殖器中ZIKV维持高复制的现象，可能是导致孕鼠胎儿感染ZIKV的关键原因之一。此外，感染小鼠脑组织中ISG15、CCL5基因的mRNA表达水平显著性上调，而炎症因子TNF-α表达在雄鼠中被抑制，但在雌鼠中保持在本底水平。与脑部免疫反应不同，实验组睾丸中ISG15、CCL5的表达维持在本底水平，没有被激活表达，而在雌鼠卵巢组织中，CCL5表达被显著激活。病理学观察表明：实验组脑部出现局部炎症细胞浸润；睾丸组织结构松散并伴有显著炎症反应。卵巢组织出现大量炎症细胞浸润，组织结构损伤。

值得注意的是，本研究小鼠模型与既往小鼠模型呈现部分表型差异：如Ⅰ/Ⅱ型干扰素双受体缺失的AG129小鼠通常表现为严重的神经系统症状（如弓背、震颤、运动障碍等）^［19］。而本研究中采用的TLR3-KO小鼠经尾静脉感染ZIKV后，虽出现生殖器病理损伤及脑部免疫细胞浸润，但免疫反应雌雄小鼠表型不一。已有研究报道，ZIKV感染脑类器官后，激活TLR3，诱导炎症反应、细胞凋亡并导致神经损伤^［14］。而在神经胶质细胞中，TLR3抑制的条件下，ZIKV复制则减少，且诱导较弱的炎症反应^［15］，这与本研究中的实验结果类似。本研究建立的TLR3-KO小鼠ZIKV感染模型，可为体内深入研究TLR3基因介导的ZIKV感染所致组织损伤（特别是生殖器损伤）的致病机制及新型治疗策略提供重要工具。

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基金资助

国家重点研发计划(2021YFF0702002)

湖北省自然科学基金青年项目(2024AFB103)